Un nuovo modello murino atassico di atassia telangiectasia causata da una mutazione senza senso clinicamente rilevante (parte 2)

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3.0 Discussione

Aumentando lo stress genotossico attraverso l'aggiunta di un colpo secondario al percorso DDR, abbiamo generato un nuovo modello murino che mostra la serie più completa di sintomi AT di qualsiasi modello fino ad oggi. Ciò include un'atassia grave e progressiva associata all'atrofia cerebellare e alle perturbazioni delle proprietà del PN insieme a un'elevata incidenza di cancro e difetti nello sviluppo delle cellule immunitarie. Insieme, queste comorbidità comprendono le tre principali cause di morte prematuraAT: ciascuno contribuiscea circa un terzo dei decessi. Di questi, l'effetto invalidante dell'atassia è il più penetrante ed è segnalato da pazienti e operatori sanitari come quello che ha il maggiore impatto sulla qualità della vita. Per questo motivo, la presenza di atassia e atrofia cerebellare in questo nuovo modello murino è di grande importanza, in quanto fornisce per la prima volta una risorsa non solo per chiarire i meccanismi della disfunzione neurologica, ma anche un modello in vivo assolutamente necessario per testare le terapie AT severamente necessarie, come i composti read-through che descriviamo qui. Abbiamo trovato diverse somiglianze tra la progressione complessiva dell'atassia nell'Atm3535; topi Aptx eAT pazienti. Nell'AT clinica, i deficit motori sono osservabili a circa 2 anni di età, quando genitori e medici rilevano una ridotta capacità di passare dall'andare avanti e indietro a un cancello liscio e riflessivamente coordinato; sfortunatamente, si sa poco sui difetti motori nelle fasi iniziali a causa delle malattie bassa prevalenza e attuale mancanza di test diagnostici precoci (Rothblum-Oviatt et al. 2016). I pazienti di solito imparano a camminare senza assistenza e i sintomi neurologici tendono a rimanere stabili durante i primi 4-5 anni di vita (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Abbiamo trovato una simile progressione iniziale dei deficit motori in Atm735×R3x; Topi Aptx^', rilevando precocemente lievi deficit motori a P8 (deficit del riflesso di raddrizzamento) seguiti da un periodo di relativa stabilità, prima dell'inizio di un'atassia progressiva e grave che si sviluppa dopo p210 che includeva cambiamenti nell'andatura, riflesso di sussulto, tremore e locomotore attività. Diverse importanti domande emergono da questi risultati, incluso se ATM e/o APTX abbiano un ruolo nello sviluppo neurologico nel

cervelletto. Studi futuri incentrati sulla fase iniziale del disturbo saranno fondamentali per capire se il cervelletto si sviluppa normalmente prima della disfunzione o se i difetti dello sviluppo sono una causa iniziale. Abbiamo anche scoperto, in modo simile ai pazienti con AT, che la gravità dell'atassia a sviluppo tardivo era variabile, con alcuni topi che deambulavano con un cancello posteriore goffo e alto (Video 3) e altri che si muovevano quasi interamente a causa della contorsione del tronco posteriore ( Fig.1E e Video 4)(Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy e Lang 2018; Boder e Sedgwick 1958). Nel complesso, abbiamo riscontrato che Atm?35×xR35×; I topi di Aptx hanno sviluppato una perdita progressiva visivamente profonda e misurabile della coordinazione motoria simile a quella osservata nei pazienti con AT, che è stata salvata dall'espressione di almeno una copia di Atm o Aptx get he. La perdita della coordinazione motoria nell'AT è stata attribuita alla degenerazione cerebellare a causa della sua neuropatologia relativamente selettiva attraverso il cervello e del suo ruolo causale in diverse forme di atassia (Hoche et al.2012). Consistente conA pazientestudi di neuroimaging (Wallis et al.2007; Sahama et al.2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al.2013), troviamo che la dimensione cerebellare in Atm735×R3× ; I topi Aptx sono inizialmente normali, ma si atrofizzano progressivamente in concomitanza con i cambiamenti nella funzione neurologica. Sebbene la perdita di tessuto cerebellare sia stata considerata una delle principali cause di atassia nell'uomo, dai dati clinici non è chiaro se la gravità dell'atassia sia un buon predittore dell'entità della degenerazione cerebellare riscontrata post mortem (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006 : Dineen et al.2020). Nell'ATM?35×R35×; Aptx^, troviamo una chiara atrofia associata all'assottigliamento dello strato di dendrite neuronale di Purkinje che precede i deficit comportamentali gravi e tardivi. Le nostre osservazioni istologiche nell'Atm?35xR35×; I topi Aptx suggeriscono che i cambiamenti nella funzione cerebellare stessa, piuttosto che una profonda perdita di cellule cerebellari, sono sufficienti a causare il fenotipo atassico, coerente con l'osservazione di difetti comportamentali prima di una significativa perdita di PN in diverse SCA (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al.2000; Clark et al.1997; Jayabal et al.2016). Il motivo per cui la carenza di ATM e APTX è necessaria per generare atassia nei topi quando la perdita di entrambi è sufficiente a causare atassia negli esseri umani rimane poco chiara. Una possibilità è che il cervello dei roditori possa utilizzare in modo più flessibile vie compensatorie o proteine ​​ridondanti mentre risponde alle 10-20k lesioni del DNA che colpiscono le cellule ogni giorno (Lindahl e Barnes 2000). Esistono diverse forme di riparazione del DNA per soddisfare potenzialmente questa sfida, inclusa la riparazione dell'escissione della base (BER), la riparazione dell'escissione del nucleotide (NER),

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nonché giunzioni di estremità omologhe e non omologhe (HEJ e NHEJ, rispettivamente), in cui ATM e APTX sono stati tutti implicati (Chou et al.2015; Caglayan et al.2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee e Walker 2017) In alternativa, potrebbe essere il caso in cui la carenza di ATM o APTX da sola non influisca adeguatamente sulla salute delle cellule durante la durata relativamente breve della vita del topo, e quindi è necessario eliminare entrambe le proteine ​​per ottenere un accumulo sufficiente di danno al DNA che si manifesti in questo periodo di tempo. Questa possibilità è rafforzata dal fatto che ATM e APTX hanno proprietà biochimiche e ruoli funzionali distinti nella risposta al danno del DNA, e quindi si prevede che una carenza in entrambi causerebbe un impatto più ampio alla stabilità del genoma (cioè, un aumento dello stress genotossico). La nostra scoperta che sono necessarie due proteine ​​​​del percorso di stabilità del genoma per indurre difetti neurologici nei topi suggerisce fortemente che è la perdita dell'Oriole di ATM nella riparazione del DNA, piuttosto che le potenziali funzioni nella segnalazione dello stress ossidativo, nella mitofagia o nella funzione mitocondriale che causano i difetti cerebellari ( Shiloh 2020). Alternative, tuttavia, non possono essere completamente escluse, poiché APTX, come ATM, è stato osservato all'interno dei mitocondri delle cellule cerebrali, dove si pensa che supporti l'elaborazione del DNA mitocondriale (Meagher and Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Questo nuovo modello murino fornisce un nuovo strumento per esplorare queste possibilità e definire meccanicamente in che modo la perdita di ATM e APTX alla fine provoca disfunzione cerebellare. Le perturbazioni biofisiche osservate nelle PN registrate dall'AtmR35XR35X; I topi Aptx si trovano in modo simile in molti altri modelli murini di atassia. Ciò include i cambiamenti che abbiamo osservato nella resistenza di ingresso PN, nella capacità della membrana e nella soglia e larghezza AP, che sono stati descritti anche in modelli murini di SCA come 1, 3 e 7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al.2011; Dell 'Orco et al.2015). Inoltre, la progressiva riduzione della frequenza di attivazione del potenziale d'azione PN che riportiamo si correla positivamente con lo sviluppo di atassia nell'AtrnR35XR35X; Aptx'mice è riportato in un gran numero di modelli di topi atassici, inclusi SCA 1, 2, 3,5, 6 e 13, nonché alcune forme episodiche (vedi recensione (Cook, Fields e Watt 2021)). Data la significativa sovrapposizione delle perturbazioni PN osservate in molte diverse atassie causate da distinti difetti cellulari, il ripristino delle frequenze di attivazione PN AP è stato considerato un approccio terapeutico di ampia portata. Tuttavia, non è chiaro se la ridotta attivazione della PN sia un fattore causale di atassia. Inoltre, l'evidenza sperimentale suggerisce che i cambiamenti nell'attività della PN potrebbero in effetti essere una risposta generalizzata per mantenere l'omeostasi durante il deterioramento della fisiologia della PN correlato alla malattia (Dell'Orco et al.2015). Pertanto, sono necessari sforzi continui in tutte le atassie cerebellari per collegare le interruzioni genetiche, molecolari e cellulari causate dalla malattia ai cambiamenti specifici nella segnalazione neurale cerebellare che alla fine generano l'atassia. Di importanza significativa in questo sforzo sarà determinare se i difetti cerebellari che causano la malattia causano comunemente o differenzialmente atassia attraverso una perdita della funzione cerebellare (p. es., perdita di segnali di coordinamento durante il movimento), o da un effetto dominante negativo (p. circuiti con pattern di uscita neurale anormali). In definitiva, mentre una strategia terapeutica comune per affrontare le atassie cerebellari avrebbe l'impatto maggiore, un approccio diretto che affronti le distinte cause genetiche e molecolari della disfunzione cellulare potrebbe in definitiva essere necessario per sviluppare con successo una terapia efficace. Il legame meccanicistico tra una carenza di DNA proteine ​​di stabilità come ATM e APTX e la disfunzione PN è tutt'altro che chiara. I nostri risultati suggeriscono che l'effetto della perdita di ATM e APTX sulle PN è intrinseco, poiché non troviamo cambiamenti nelle proprietà presinaptiche delle cellule dei granuli o prove della loro perdita cellulare (nessun cambiamento nello spessore del GCL). Inoltre, mentre abbiamo osservato differenze nella plasticità a breve termine degli input olivari inferiori in PN e wildtype carenti di ATM e APTX, questi risultati probabilmente indicano un'interruzione dell'omeostasi del Ca2* potenzialmente attraverso riduzioni di Inositolo 1,4,5- Espressione del recettore trifosfato 1(ltpr1), simile a quelli osservati nei modelli murini SCA 1,2 e 3, nonché nei topi carenti di ATM (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et al. al.2011). Sebbene ciò fornisca una strada promettente per l'esame e il confronto futuri, non è ancora chiaro, anche per le SCA, se i cambiamenti nell'omeostasi del Ca²* siano il fattore causale o solo un altro sintomo o addirittura una risposta compensatoria di PN malati o disturbati (Dell 'Orco et al.2015). Nel sistema immunitario, l'ATM è implicato nella riparazione delle rotture del DNA che si verificano naturalmente durante il riarrangiamento genico dei geni dei recettori dell'antigene nei precursori delle cellule B e T, un fenomeno critico per la diversità dei recettori dell'antigene (LG e TCR) di queste cellule. trovarlocellula Tle proporzioni nel sangue sono significativamente ridotte è coerente con studi precedenti su esseri umani e topi knockout AT (Schubert, Reichenbach e Zielen 2002; Hathcock et al.2013; Chao, Yang e Xu 2000; Barlow et al.1996). Questa riduzione dei linfociti T nella periferia è probabilmente correlata a un difetto dell'immunità sia cellulare che umorale. È importante sottolineare che abbiamo scoperto che l'espressione di una copia del gene ATM è sufficiente per ripristinare i deficit di CD4 plus nel sangue, indicando che le terapie in grado di ripristinare l'espressione parziale di ATM avrebbero efficacia terapeutica. Sebbene in questo documento non abbiamo valutato lo sviluppo dei linfociti B, è probabile che conclusioni simili si applicherebbero a quel processo date le loro somiglianze meccanicistiche (Marshall et al. 2018). Come previsto, la riduzione dei linfociti T nel sangue periferico è correlata allo sviluppo difettoso dei timociti. Nel timo abbiamo riscontrato due difetti principali. Uno, indotto principalmente dal deficit di APTX, si manifesta come un difetto nella transizione da DN3 a DN4 in coincidenza con il riarrangiamento precoce del locus TCR. L'altro difetto, principalmente causato dal deficit di ATM, è correlato con una ridotta progressione di CD4*CD8 doppiamente positivi a cellule singole positive, principalmente i timociti CD4'. Sebbene la scoperta di APTX sia stata sorprendente, poiché la sua carenza (AOA 1) non è associata a deficit immunitari, è noto che APTX interagisce con le proteine ​​​​di riarrangiamento del gene TCR, incluso XRCC4 (Clements et al. 2004). Saranno futuri studi volti a definire il ruolo di APTX nei meccanismi di giunzione finale durante il riarrangiamento del gene TCR

importante, e la possibilità che meccanismi alternativi di giunzione finale, come l'uso di microomologie, spieghino la mancanza di un deficit immunitario in sua assenza necessita di ulteriori indagini (Bogue et al. 1997). La sopravvivenza di Atm?35×/R35×; Aptx'mice è considerevolmente più lungo rispetto ai precedenti modelli di mouse AT. In confronto, il primoKOmodello murino riportato da Barlow et al. morì di timoma di solito entro 2-4 mesi dalla nascita (Barlow et al. 1996). La ridotta sopravvivenza al cancro in questo e in molti altri modelli murini AT knockout è probabilmente genetica, poiché è stato dimostrato che il ceppo di fondo che ospita la mutazione ha effetti significativi sulla prevalenza e sulla sopravvivenza del cancro, con A/J e C57BL/6

sfondi con una sopravvivenza significativamente aumentata rispetto ai ceppi BALBC e 129S (Genik et al. 2014). Il fatto che i nostri topi carenti di ATM siano stati creati su uno sfondo C57BL/6 probabilmente è alla base; che i topi Aptx*t non sviluppano atassia, è la loro durata di vita relativamente lunga. Dato che l'Atm35xR35×; improbabile che la morte precoce nei topi AT KO impedisca l'osservazione di un fenotipo atassico che altrimenti si svilupperebbe in questi topi. Tuttavia, non è noto se il background C57BL/6 conferisca resilienza all'atassia in via di sviluppo, come fa per il cancro. La definizione dei fattori genetici o possibilmente epigenetici che influenzano la gravità della malattia potrebbe fornire strade per lo sviluppo terapeutico futuro. Data la natura globale della mutazione ATM e APTX nulla nel nostro modello murino, non possiamo escludere del tutto che difetti extracerebellari possano anche contribuire al fenotipo atassico grave, e quindi all'esame futuro al di fuori del cervelletto nel proencefalo, nel tronco cerebrale, nel midollo spinale , e anche il muscolo dovrà essere condotto. All'interno del cervelletto, mentre abbiamo riscontrato alcune differenze anatomiche nelle proprietà di attivazione del PN all'interno di diverse regioni del cervelletto, non abbiamo rilevato differenze regionali nella larghezza del ML o nella densità del PN. Tuttavia, ci sono sfide nell'uso dell'anatomia regionale come fattore di raggruppamento nel cervelletto, poiché le pieghe fisiche del tessuto non sono necessariamente correlate ai confini dell'espressione funzionale, molecolare o dei domini di proprietà fisiologici che sono stati descritti (Apps e Hawkes 2009 ; Tsutsumi et al.2015; Gao, van Beugen e De Zeeuw 2012; Zhou et al.2014). Esperimenti incentrati sull'esame dell'entità dei difetti cerebellari all'interno di questi domini saranno importanti negli studi futuri e confrontati con i resoconti aneddotici di differenze anatomiche nei pazienti con AT (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover e Huff 1976; Amromin, Boder, e Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan e Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare e Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Mentre rileviamo due potenziali stadi nella progressione dell'atassia nell'Atm735wR35x; Topi Aptx, la fase successiva dell'atassia grave si sviluppa nell'età adulta nei topi, rispetto all'esordio infantile negli esseri umani. Ciò potrebbe limitarne l'uso in alcuni studi sullo sviluppo neurologico. Inoltre, l'interpretazione degli esperimenti futuri deve considerare attentamente il fatto che questo nuovo modello esprime mutazioni nulle in due geni di stabilità del genoma contemporaneamente, una situazione che non è stata rilevata nei pazienti umani né con AT né con AOA1. Infine, individuare dove, quando e come la carenza di ATM causa patologia cerebellare e atassia è stata una sfida, poiché i precedenti topi con carenza di ATM generalmente mancano delle caratteristiche necessarie per collegare causalmente i deficit cellulari e molecolari al fenotipo atassico. Sono state definite molteplici e promettenti vie di indagine, comprese quelle focalizzate a livello neuronale, dove l'ATM è implicato nella segnalazione dello stress ossidativo (Chen et al.2003) e nella funzione sinaptica (Li et al.2009; Vail et al.2016), come così come la funzione gliale, dove prove recenti suggeriscono che la patologia gliale potrebbe essere un fattore principale nella patologia cerebellare (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al.2016; Petersen, Rimkus e Wassarman 2012; Weyemi et al.2015). Questo nuovo modello animale fornisce un nuovo strumento per testare ipotesi meccanicistiche su come la carenza di ATM causi patologia cerebellare e atassia. Inoltre, questo modello può servire soprattutto come strumento preclinico critico per testare candidati terapeutici precedentemente proposti (Browne et al.2004; Chen et al.2003) e i nostri composti SMRT (Du et al. 2013). Le gravi limitazioni di non avere un modello preclinico adatto per i test terapeutici, specialmente per malattie rare come AT e AOA1, non possono essere sopravvalutate.

4.0 Materiali e metodi

4.1 Dichiarazione etica

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutti gli animali sono stati maneggiati secondo i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso The Lundquist Institute (31374-03,31773-02) e UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3} }). Il protocollo è stato approvato dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali del Lundquist Institute (Numero di garanzia: D16-00213). È stato compiuto ogni sforzo per ridurre al minimo il dolore e la sofferenza fornendo supporto quando necessario e scegliendo obiettivi etici.

4.2 Topi

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>Mutazione T trovata in una vasta popolazione del Nord AfricaApazienti using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), replicando l'AT PTC umano). Gli alleli genomici sono stati quindi clonati in una versione modificata del vettore di targeting dei mammiferi NorCOMM utilizzando una reazione gateway 3-way (Bradley et al. 2012). I vettori di targeting risultanti sono stati elettroporati in cellule C2 ES (C57BI/6N, derivate in laboratorio A. Nagy, Toronto, Canada) e cloni mirati con successo sono stati identificati mediante selezione con G418 (Gertsenstein et al.2010). L'integrazione della cassetta di targeting mutata nel locus del gene Atm è stata confermata da Southern blot e dal sequenziamento di prodotti PCR per confermare la presenza della mutazione Atm PTC, targeting senza errori nel locus Atm e componenti funzionali privi di errori del

vettore (dati non mostrati). I cloni ES positivi sono stati utilizzati per l'iniezione di blastocisti per ottenere le linee transgeniche. L'allele transgenico conteneva un promotore-delta beta-actina umana floxedTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(Fig.1A). La genotipizzazione delle due linee Atm è stata eseguita utilizzando i seguenti primer a Tm 62 gradi: Atm gene forward (F) primer:5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; e Atm gene reverse(R)primer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', creando un prodotto allelico di tipo selvaggio di 151 bp o un prodotto allelico mirato di 241 bp (Figg. 1A, 1B). Atmn35~ e Atm035×v erano incrociato con topi C57Bl/6J per 9 generazioni (99,2% isogenico) prima della crioconservazione e successiva riderivazione utilizzando madri surrogate C57BI/6J. Atm735× e Atm?35x e Atm 35×/Q35× erano riproduttori ottenuti da topi fratelli F1 Atm35 e Atm835X plus. AtmR35×k35×: entrambi sono risultati fertili. I topi knockout Aptx (Aptx) sono stati creati e forniti al Dr. Mathews come embrioni dal Dr. McKinnon (Ahel et al.2006) e successivamente sono stati rielaborati tramite madri surrogate C57Bl/6J. I topi Aptx sono su uno sfondo misto C57Bl/6 e 129. ATM35k35; Topi Aptx di varie combinazioni di tipo selvatico, eterozigoti e omozigoti sono stati creati da Atm35X; Gli allevatori di Aptxt sono stati generati incrociando i topi Atm?35×R35 e Aptx^. Una coorte di doppio mutante e topi di controllo corrispondenti è stata utilizzata nello studio comportamentale longitudinale per l'analisi dell'andatura e il test SHERPA (Figg.2,3). Più coorti aggiuntive di topi mutanti e di controllo della stessa età sono state utilizzate per esperimenti di test elettrofisiologici, immunoistologici e del polo verticale (Figg.4, 7). Esperimenti immunologici e di espressione proteica sono stati condotti utilizzando topi allevati dai topi originali AtmR35 × e Atm35 × derivati ​​​​(Figg.5, 6 e 8). La genotipizzazione è stata eseguita da campioni di tessuto dell'orecchio di topi P8-11. I metodi PCR in tempo reale condotti da Transnetyx Inc. sono stati utilizzati per determinare il genotipo di ciascun animale. Gli animali sono stati resi identificabili tramite tatuaggi delle dita dei piedi eseguiti contemporaneamente alla biopsia dell'orecchio. Primer unici per Atm35× e Atm35× sono stati quantificati e utilizzati per identificare topi wild-type, eterozigoti e omozigoti (elencati sopra). I primer Aptx'e Aptx*" sono stati usati per valutare i loro genotipi.

4.3 Salute animale

Gli animali sono stati pesati tramite una bilancia digitale a P8, 45, 120.210.400. La morte dell'animale è stata registrata come il giorno in cui è stato trovato morto, o il giorno dell'eutanasia in cui gli animali hanno raggiunto un punto finale umano (animale incapace di raddrizzarsi entro gli anni '60, significativa stuoia dei capelli che indica mancanza di auto-cura o eccessivo stress come notato dal veterinario personale). Le carcasse di animali sono state immediatamente congelate dopo la morte e le autopsie sono state eseguite in lotti. La probabile causa del decesso è stata determinata al meglio delle nostre possibilità in collaborazione con il personale veterinario (Dott.ssa Catalina Guerra) mediante ispezione visiva degli organi interni. Alcuni topi sono stati cannibalizzati o eliminati accidentalmente dal personale del vivaio e lo sono stati

quindi etichettati come "scomparsi". I topi senza una causa visiva di morte riconoscibile sono stati etichettati come "indeterminabili". I topi trovati con masse toraciche vicino a dove sarebbe normalmente il timo nei topi giovani sono stati elencati come affetti da "cancro del timo". le probabili cause di morte (p. es., fegato ingrossato, ostruzione urinaria) sono state etichettate come "altre".

4.4 Comportamento

Prima di eseguire qualsiasi test comportamentale, i topi sono stati acclimatati alla suite comportamentale per circa 20 minuti. I topi sono stati testati in diversi momenti della giornata, in linea con il loro ciclo giornaliero. Una batteria di test comportamentali è stata eseguita su topi ingenui a doppio mutante dei genotipi indicati in vari momenti a seconda del comportamento ma nella stessa coorte di topi. La batteria di test includeva la valutazione dell'andatura della passerella (P45, 120,210, 400) e un sottoinsieme dei test SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College e Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA) (P30 e 400). Questi test sono stati condotti dall'UCLA Behavioral Core. I topi doppi mutanti e di controllo sono stati inoltre esaminati nel test del polo verticale. Tutti gli apparati comportamentali sono stati spazzati via con etanolo (70 percento) tra ogni soggetto del test.

Analisi dell'andatura

Abbiamo utilizzato un sistema di analisi dell'andatura Noldus Catwalk progettato per misurare e analizzare in modo semiautomatico l'andatura dei topi durante la normale deambulazione. In breve, il movimento dei topi attraverso un corridoio con fondo di vetro è registrato da una posizione centrale. Le impronte delle zampe sono evidenziate nel video a causa dell'illuminazione della piattaforma pedonale in vetro. Ogni passaggio del mouse all'interno di un video viene successivamente rilevato utilizzando Catwalk XT (Noldus) in modo semiautomatico. Una corsa per ogni mouse consiste in 3 prove di deambulazione coerente attraverso la piattaforma monitorata. Sono accettate solo prove coerenti e i topi possono richiedere fino a 10 tentativi per completare 3 prove conformi in entrambe le direzioni attraverso il corridoio. Le prove conformi sono state definite come quelle con movimento sulla piattaforma inferiore a 5 s e con una variazione di velocità non superiore al 60%. Una volta posizionati sulla piattaforma, i topi generalmente correvano avanti e indietro senza bisogno di suggerimenti da parte dello sperimentatore.

Palo verticale

I topi sono posti in cima a un bullone alto 80 cm con il naso rivolto verso il basso e le zampe posteriori il più vicino possibile alla parte superiore. I topi vengono immediatamente rilasciati e il tempo inizia immediatamente dopo il posizionamento.

Il tempo si ferma quando la prima zampa anteriore tocca la superficie sotto il palo. La predilezione naturale di un topo è quella di scendere immediatamente dal palo e gli vengono dati fino a 60 anni per attraversare il palo, altrimenti vengono aiutati a staccarsi dal palo. A una prova non completata viene automaticamente assegnato un tempo di 30 secondi, poiché il 95 percento dei topi che non sono scesi entro 30 secondi erano ancora sul palo al traguardo degli anni '60. SHIRPA I test comportamentali sono stati condotti dall'Università della California, Los Angeles Behavioral Core al P30

e P400. Tutti i parametri sono valutati per fornire una valutazione quantitativa. che consente il confronto dei risultati sia nel tempo che tra diversi laboratori. Ciascun mouse è stato testato in sequenza su tutti i comportamenti entro un intervallo di tempo di ~20-min prima di passare al mouse successivo. Lo sperimentatore era cieco al genotipo animale. Lo schermo è stato eseguito come descritto in precedenza (Rogers et al. 1997).

Osservazione comportamentale

Lo schermo principale fornisce un profilo di osservazione comportamentale e la valutazione di ciascun animale inizia osservando il comportamento indisturbato in un barattolo di osservazione (10 cm di diametro) per 5 min. Oltre ai comportamenti valutati di posizione del corpo, attività spontanea, frequenza respiratoria e tremore, l'osservatore registra qualsiasi istanza di comportamento bizzarro o stereotipato e convulsioni, leccate compulsive, morsi autodistruttivi e retropulsione (camminare all'indietro) e indicazioni di spazi disorientamento.

Comportamento nell'arena

Successivamente, il topo viene trasferito nell'arena (30 cm x 50 cm) per testare l'eccitazione del trasferimento e l'osservazione del comportamento normale. L'arena è contrassegnata in una griglia di quadrati di 10 x 10 cm² per misurare l'attività locomotoria entro un periodo di 30 secondi. Mentre il topo è attivo nell'arena, vengono registrate le misure di risposta di sussulto, andatura, elevazione pelvica e elevazione della coda.

Contenzione supina

L'animale è trattenuto in posizione supina per registrare i comportamenti autonomi. Durante questa valutazione sono stati valutati la forza di presa, il tono corporeo, il riflesso del padiglione auricolare, il riflesso corneale, la presa del piede, la manovra del filo e la frequenza cardiaca.

Equilibrio e orientamento

Infine, sono state eseguite diverse misurazioni della funzione del sistema vestibolare. Sono stati eseguiti i test del riflesso di raddrizzamento, del riflesso di raddrizzamento del contatto e della geotassi negativa. Durante questa procedura sono state registrate vocalizzazioni, minzione e paura generale, irritabilità o aggressività.

Equipaggiamento utilizzato

1.Arena in plexiglas trasparente (dimensioni interne approssimative 55x33x18 cm). Sul pavimento dell'arena c'è una lastra di plexiglas contrassegnata da 15 quadrati (11 cm). Un filo rigido orizzontale (3 mm di diametro) è fissato attraverso l'angolo posteriore destro in modo che gli animali non possano toccare i lati durante la manovra del filo. Una griglia (40x 20 cm) con una maglia di 12 mm (approssimativa) è fissata su tutta la larghezza della scatola per misurare la sospensione della coda e il comportamento della forza di presa. 2. Come vaso di osservazione è stato utilizzato un cilindro in plexiglas trasparente (15 x ll cm). 3. Un pavimento a griglia (40x 20 cm) con maglie da 12 mm su cui poggiano i vasetti di osservazione.4. Quattro supporti cilindrici in acciaio inox (lunghezza 3 cm x 2,5 cm di diametro) per sollevare le griglie dalla panca. 5. Una piastra quadrata (13 cm) in acciaio inossidabile per il trasferimento degli animali nell'arena. 6. Tagliare lunghezze di 3/0 Mersilk tenuti nella pinza per test di riflesso corneale e pinna 7. Un'asta di plastica per tasselli è stata affilata a una punta di matita per testare la salivazione e il morso.8. Un paio di pinze per attrezzature da dissezione, curve con punte sottili (pinze da 125 mm, Philip Harris Scientific, Cat. No. D46-174), per la presa del dito del piede. 9.Un cronometro.10. Una casella IHR Click viene utilizzata per testare le risposte di sorpresa. La Click Box genera un breve tono di 20 kHz a 90dB SPL quando viene tenuta a 30 cm sopra il mouse. Contatta il Prof. KP Steel, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11.Un righello.12.Un tubo in plexiglas trasparente di 30 cm con un diametro interno di 2,5 cm per il riflesso di raddrizzamento del contatto.4.5 Elettrofisiologia Preparazione della fetta cerebellare acuta Dal cervelletto di topi nidiata sperimentali e di controllo sono state preparate simpatiche fette parasagittali di 300 μm di spessore seguendo i metodi pubblicati (Hansen et al., 2013). In breve, il cervelletto è stato rapidamente rimosso e immerso in una soluzione extracellulare ghiacciata con la composizione di (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 glucosio, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla e 1 NaHzPOa,pH7,4 quando gassato con il 5 percento di CO-/95 percento di O2. Il cervelletto è stato sezionato parasagittalmente utilizzando un vibratomo (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Germania) e inizialmente incubato a 35 gradi per-30 min, quindi equilibrato e conservato a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Elettrofisiologia extracellulare Le registrazioni extracellulari e intracellulari sono state ottenute dai neuroni di Purkinje (PNs) in fette costantemente perfuse con una soluzione extracellulare a bolle di carbonio e mantenute a 37 gradi C (extracellulare) o 32 gradi (intracellulare) ± 1 grado (vedi sopra). Le cellule sono state visualizzate con l'ottica DIC e un obiettivo 40 × a immersione in acqua (NA 0,75) utilizzando un microscopio Zeiss Examiner. Pipette di vetro di ~ 3 MQ di resistenza (Modello P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) sono state riempite con una soluzione extracellulare e posizionate vicino a collinette di assoni PN per misurare i transitori di corrente capacitiva associati al potenziale d'azione in modalità di tensione-clamp con il potenziale della pipetta mantenuto a 0 mV. Per le registrazioni patch-clamp a cellule intere, le pipette sono state riempite con una soluzione intracellulare (mM): 140 mesi (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 Fosfocreatina (sale tris), 1 EGTA, 4 Mg -ATP, 0,4 Na-GTP.100 μM Picrotossina (Sigma) è stata aggiunta per bloccare gli input sinaptici inibitori GABAegerici. I dati sono stati acquisiti utilizzando

un amplificatore MultiClamp 700B a 20 o 100 kHz in tensione o in corrente-clamp, Digidata 1440 con pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e filtrato da 2 a 4 kHz. La resistenza in serie era solitamente compresa tra 10 e 15 MQ. La resistenza in serie è stata compensata all'80 percento solo per esperimenti di plasticità a breve termine. Per le registrazioni extracellulari, sono stati registrati da 20 a 45 PN per ogni animale in tutti i genotipi, sessi e gruppi di età. Le registrazioni sono state distribuite lungo l'asse mediale-laterale e rostrocaudale del cervelletto. Sono state esaminate solo le cellule con un aspetto "sano" (basso contrasto dei bordi cellulari) e una frequenza di attivazione regolare e ininterrotta. Durante l'analisi, è stato riscontrato che alcune cellule presentavano spazi vuoti nell'attivazione superiori a 2 secondi e queste cellule sono state eliminate dall'analisi, poiché questo tipo di attivazione è associato all'essere "malsano". Il doppio tessuto mutante non differiva qualitativamente in aspetto al microscopio DIC prima delle registrazioni, né il numero di cellule "malsane" era maggiore di quello di altri genotipi (7 percento contro 4-11 percento di tutte le cellule nei genotipi di controllo a P400). Il confronto spaziale dell'attività neurale è stato ottenuto registrando da sezioni seriali nel floccolo, fette laterali (2"d o 3'), intermedie (6" o 7a) e mediali (11" o 12t). i gruppi di età più giovani (P45 e 110) in modo che corrispondano all'incirca al posizionamento relativo delle registrazioni tra i gruppi di età. 0-3 sono state effettuate registrazioni da ciascun lobulo all'interno di ciascuna sezione in base alla qualità e alla salute dei tessuti. Ciascuna registrazione è durata per {{29} }minuto Sono stati utilizzati da 3 a 5 topi per ogni gruppo di età e lo sperimentatore è stato accecato al genotipo, all'età e al sesso.

Le registrazioni intracellulari sono state ottenute da PN nel lobulo IIl o VIl del cervelletto mediale (cioè nel verme); non sono state osservate differenze statistiche nelle proprietà tra i lobuli.

Analisi

Gli intervalli interstimolo del potenziale d'azione spontaneo sono stati rilevati e analizzati utilizzando routine standard e personalizzate in ClampFit (dispositivo molecolare), GoPro (Wavemetrics) ed Excel (Microsoft). In particolare, i potenziali d'azione sono stati rilevati come soglia e le statistiche sui picchi (ad esempio, frequenza e lunghezza dell'intervallo) sono state determinate utilizzando adattatelgorProroutines(TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). Il coefficiente di variazione dell'intervallo medio tra i picchi (CV) e l'intervallo mediano tra i picchi (CV2=2 ISIn più 1-ISInl/(ISIn più 1 più ISIn)) sono stati calcolati in Excel utilizzando macro personalizzate. Le proprietà della membrana standard sono state analizzate utilizzando lgorPro. L'RM è stato determinato calcolando la media di 3 risposte di traccia di tensione a un -5 impulso mV da un -80 mV di mantenimento del potenziale e misurando la deflessione di corrente risultante tra 900 e 1000 ms dopo l'inizio. La costante di tempo della membrana è stata misurata adattando un singolo esponenziale alla fase di decadimento iniziale dal 90% al 10% del picco. Il CM è stato calcolato dividendo la costante di tempo della membrana per il RM.sEPSC gli eventi sono stati registrati in un periodo di 1-minuto e rilevati e misurati utilizzando Neuroexpress (v21.1.13). Gli assoni delle fibre parallele e rampicanti sono stati stimolati utilizzando elettrodi di vetro theta (WPI) e un isolatore di stimolo controllato da TTL (ISO-Flex, AMPI). Le ampiezze EPSC evocate e le costanti di tempo di decadimento (1 exp. per fibre parallele e 2 exp. per fibre rampicanti) sono state analizzate utilizzando routine personalizzate in lgorPro. I potenziali d'azione sono stati esaminati come parte di una serie di iniezioni di corrente di 1 s tra -500 e 2250 pA (passi di 250 pA) con una corrente di mantenimento regolata per mantenere un potenziale di ~70 mV. Le forme d'onda del potenziale d'azione sono state misurate utilizzando personalizzazioni

routine in lgorPro. La soglia del potenziale d'azione è stata definita come la prima tensione di membrana in cui la prima derivata supera i 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Esame dell'atrofia cerebellare

Dimensione cerebellare Immediatamente dopo la rimozione del cervello dal cranio, è stata ottenuta un'immagine dorsale a montatura intera. Le immagini sono state quindi elaborate utilizzando Fiji (NIH). Le dimensioni del proencefalo e del cervelletto sono state valutate delineando il loro 2-spazio dimensionale e quindi calcolando l'area. Abbiamo normalizzato le possibili differenze nelle dimensioni complessive del cervello dividendo i risultati del cervelletto per le dimensioni del proencefalo per produrre un rapporto relativo tra cervelletto e proencefalo. Gli sperimentatori erano ciechi al genotipo dell'animale. Immunoistochimica Ai rispettivi endpoint dello studio (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0), topi maschi e femmine di tutti i genotipi rappresentato in questo studio è stato anestetizzato con isoflurano e sottoposto a perfusione transcardiale con soluzione salina tamponata con fosfato seguita da paraformaldeide tamponata al 4% (p/v) (PFA) e quindi sezionata per estrarre il cervello. Le immagini dell'intero cervello sono state scattate immediatamente dopo aver rimosso il cervello dal cranio e il cervello è stato quindi immerso in PFA al 4% per 24 ore, quindi crioprotetto in soluzione fisiologica tamponata con Tris (TBS) con 0,05% di azide e 30% di saccarosio per 72 ore e conservato a 4 gradi fino a un ulteriore utilizzo. Il cervelletto è stato separato dal proencefalo e sezionato parasagittale utilizzando un microtomo scorrevole (Microm HM 430, Thermo Scientific) impostato per una sezione di 40 μm di spessore. Le sezioni del cervelletto sono state raccolte in una serie di sei e conservate in TBS-AF (TBS con 30% di saccarosio, 0,05% di sodio azide e 30% di glicole etilenico) a 4 gradi o -20 gradi fino a un ulteriore utilizzo. Per la visualizzazione immunofluorescente dei neuroni di Purkinje, sezioni del cervelletto di entrambi gli Atm*; Aptx*t e Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 per genotipo) sono stati lavati per 5 minuti in TBS tre volte e quindi bloccati in siero di capra normale al 15% a temperatura ambiente per 30 minuti seguiti da incubazione a fluttuazione libera in coniglio o topo anti-calbindina D -28k (1:1000) per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore orbitale. Le sezioni sono state quindi lavate per 5 minuti con TBS tre volte, seguite da incubazione fluttuante in capra anti-coniglio o topo Alexa Fluor 488 (1:1000) per 1 ora al buio a temperatura ambiente su un agitatore orbitale. Dopo l'incubazione dell'anticorpo secondario, le sezioni sono state lavate per 5 minuti in TBS tre volte, quindi montate e coprite con Fluoromount-G con DAPI. Per alcune sezioni, gli anticorpi anti-caspasi{50}}(1:200) e anti-CD68(1:400) sono stati analizzati in parallelo con Calbindin utilizzando un anticorpo secondario Alexa Fluor 647 (1:500). I vetrini sono stati scansionati utilizzando Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver.2020) su un microscopio Zeiss dotato di un ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) utilizzando un obiettivo 2.5, 10, 20, 40 o 63x e immagini catturato con una fotocamera CMOS Hamamatsu (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus). Per quantificare il numero di cellule reattive alla calbindina in ciascun lobulo nelle immagini risultanti, abbiamo utilizzato Stereo Investigator per disegnare casualmente 2 linee tra 300 e 500 μm di lunghezza in ciascun lobulo e contato manualmente il numero totale di PN lungo la lunghezza all'interno dello spessore di 40 um della fetta di tessuto con ingrandimento 40x. La densità 2D (n. di PN/(lunghezza lineare*40 um di spessore)) dei due campioni per lobulo è stata quindi media per un ulteriore confronto tra lobuli e animali. Le larghezze dei dendriti PN positive alla calbindina sono state misurate in una posizione predefinita nel lobulo VI di ciascun animale in sezioni di tessuto spesse 25 o 40 um con ingrandimento 20x. Le larghezze dendritiche dei rami primari e secondari sono state misurate sulla linea mediana tra i corpi cellulari PN e il bordo dello strato molecolare. Sono stati misurati tra 7 e 13 dendriti per sezione, una sezione per animale. Per le misurazioni somatiche della PN, Stereo Investigator è stato utilizzato per selezionare casualmente le PN distribuite sull'intera sezione mediale con un ingrandimento di 20x. La larghezza media del PN per animale è stata determinata calcolando la media dei risultati su 3 sezioni seriali (da 16 a 37 PN per sezione). Le larghezze del PN sono state misurate perpendicolarmente allo strato PN o al dendrite in uscita se storto di più di pochi gradi. Le larghezze dello strato molecolare e dello strato di cellule granulari (visualizzate rispettivamente con le colorazioni Calbindin e DAPI) sono state valutate in Stereo Investigator calcolando la media di due misurazioni della larghezza in posizioni predefinite per ciascun lobulo, all'incirca a metà dell'estensione lunga di ciascun lobulo con un ingrandimento di 2,5x. CD68 la positività nelle sezioni cerebellari è stata quantificata misurando l'area percentuale totale di CD68 più la colorazione positiva attraverso l'intera sezione cerebellare mediale. Le immagini cucite 10x sono state limitate al controllo negativo e quantificate utilizzando ImageJ, una sezione per animale. Per quantificare la percentuale di PN positivi alla Calbindin che erano positivi per la caspasi scissa-3 abbiamo contato i PN nell'intero cervelletto utilizzando Stereo Investigator. Sono state esaminate tre immagini cucite con ingrandimento 20x per animale e i risultati sono stati mediati. La soglia per la positività alla caspasi-3 è stata stabilita da sezioni di controllo colorate solo con gli anticorpi secondari. Per l'analisi istologica non fluorescente, 25-sezioni di tessuto fluttuanti e spesse su vetrini caricati positivamente e asciugate all'aria durante la notte. Il tessuto è stato lavato in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) due volte per 5 minuti, quindi colorato in sequenza con ematossilina allo 0,1 percento in etanolo al 95 percento per ~ 25 secondi e eosina allo 0,5 percento in etanolo al 95 percento per ~ 3 secondi e lavato in acqua bidistillata dopo ogni macchia. Il tessuto è stato successivamente disidratato per 1 minuto in lavaggi di etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100%, quindi applicato su vetrino coprioggetto con Permount. I vetrini sono stati ripresi utilizzando una fotocamera a colori (Q Imaging, MBF Biosciences) sullo stesso microscopio Zeiss e software di acquisizione MBF. Gli sperimentatori sono stati accecati al genotipo del topo in cui sono state esaminate le sezioni e l'ordine di esame è stato intercalato per tutte le misurazioni istologiche.

4.7 Misure di citometria a flusso

L'analisi della citometria a flusso delle cellule del sangue e del timo è stata eseguita mediante colorazione con anticorpi specifici anti-topo∶ CD4, CD8, CD3, CD44 e CD25. In breve, i campioni di sangue intero (50 μ) sono stati colorati utilizzando anticorpi marcati con fluorescenza, quindi i globuli rossi sono stati lisati utilizzando una soluzione di lisi BD mentre i globuli bianchi vivi sono stati colorati utilizzando una colorazione di vitalità. Thymi sono stati dissociati meccanicamente. Da 1 a 2 milioni di cellule del timo sono state colorate in modo simile utilizzando anticorpi specifici per CD4, CD8, CD44 e CD25. L'analisi dei globuli bianchi immunocolorati o dei campioni di timo è stata eseguita utilizzando FACS ARIA l e i dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo come riportato in precedenza (Sanghez et al. 2017).

4.8 BIot occidentali

Estratti proteici (cellule/tessuti) sono stati omogeneizzati nel tampone di lisi del test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 [NP-40],0 0,5 percento di desossicolato,0, 1 percento di SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) con inibitori della proteasi (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml di leupeptina, 5 ug/ml di pepstatina, 5 ug/ml di chimotripsina, 10 ug/ml di aprotinina). Gli estratti proteici sono stati sonicati e quindi pellettizzati mediante centrifugazione a 13,000 rpm per 15 minuti a 4°C. Il saggio proteico BCA è stato utilizzato per quantificare le concentrazioni proteiche. I campioni contenenti quantità uguali di proteine ​​da 50 a 100 ug per corsia sono stati separati utilizzando gel prefabbricati TGX con gradiente dal 4 al 12 percento BioRad, quindi trasferiti mediante il sistema TransBlot Semi-Dry BioRad utilizzando un pacchetto di trasferimento di nitrocellulosa. Le macchie trasferite sono state colorate con la colorazione Ponceau S per un carico proteico uguale, quindi lavate e bloccate con latte in polvere scremato al 5% in TBST per 60 minuti a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari sono stati incubati con agitazione per una notte a 4 gradi. Le macchie sono state analizzate per i seguenti anticorpi: ATM (D2E2)Rabbit mAb Cell Signaling, a diluizione 1:1000, -Actina (D6A8)Rabbit mAb Cell Signaling, GAPDH (D16H11)Rabbit mAb Cell Signaling seguito dall'appropriato coniugato con perossidasi di rafano ( HRP) Anti-coniglio secondario, Anti-topo per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo più lavaggi con TBST, l'espressione proteica è stata rilevata dal substrato di chemiluminescenza Radiance Plus utilizzando i sistemi di imaging Azure c400 e BioRad ChemiDoc. L'analisi densitometrica dell'ATM è stata eseguita utilizzando ImageJ. Gli esperimenti sono stati eseguiti con 2 repliche tecniche e 2-3 biologiche come indicato.

4.9 Valutazione statistica

Il numero di animali scelti per ciascun gruppo è stato basato su analisi di potenza a priori utilizzando GPower v3.1 in base a una dimensione di 0.5, potenza di 0.8 e dimensioni dell'effetto stimate da dati preliminari o studi precedenti. Abbiamo utilizzato metodi statistici parametrici (1- e 2-way ANOVA) per i dati di intervallo normalmente distribuiti e non parametrici (Kruskal Wallace) per verificare le differenze tra i gruppi seguiti da test di confronti multipli a coppie come indicato in il testo. Valori anomali per i dati immunitari nelle Figg. 6 e 7 sono stati esclusi tramite il metodo ROUT (Q=2 percento). Le analisi specifiche utilizzate per ciascun set di dati sono annotate nella legenda di ciascuna figura. Per tutte le figure: ns non significativo,*p Minore o uguale a 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">