Parte 2: La downregulation dell'Hsa-miR renale-127-3p contribuisce all'iperattivazione della via di segnalazione dell'interferone di tipo I nel rene della nefrite da lupus

Per maggiori informazioni. contattotina.xiang@wecistanche.com

Ilsistema immuneè il "custode" del nostro corpo ed è l'arma più efficace contro l'invasione di agenti patogeni. Le persone con una bassa immunità innata hanno maggiori probabilità di ammalarsi. I risultati sperimentali mostrano che i principi attivi di Cistanche possono aumentare l'immunità dell'organismo.

Diamo un'occhiata più da vicino.

1. Glicosidi totali di Cistanchetubulosa

I glucosidi totali di Cistanche tubulosa hanno migliorato significativamente la produzione di anticorpi, il numero di linfociti T del sangue periferico, la funzione fagocitica dei macrofagi peritoneali e le reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato nei topi con lesioni ai raggi Co. L'indice, l'indice della milza e il tasso di sopravvivenza hanno mostrato che i glucosidi totali di Cistanchetubulosaha avuto un forte effetto protettivo sulla funzione immunitaria dei topi danneggiati dalle radiazioni.

2. Cistanche polisaccaridi

Cistanchetubulosai polisaccaridi in Cistanche possono ridurre il contenuto di MDA nel cervello, nel cuore e nel fegato di modelli animali immunocompromessi, aumentare l'attività della telomerasi nel cuore e nel tessuto cerebrale, la funzione fagocitica dei macrofagi peritoneali, la proliferazione dei linfociti, i linfociti T della milza Il contenuto di IL{ {0}} e la concentrazione di ione calcio nei timociti ha mostrato che il polisaccaride di Cistanche deserticola potrebbe potenziare la funzione immunitaria dell'organismo.

3. Verbasco

Il principio attivo di Cistanchetubulosa, Xinjiang, ha indotto il D-galattosio a ridurre significativamente il contenuto di MDA nel cuore, nel fegato e nel tessuto cerebrale dei topi modello di invecchiamento subacuto e aumentare significativamente l'attività della telomerasi nel cuore e nel tessuto cerebrale. La funzione fagocitica dei fagociti è stata potenziata e la proliferazione dei linfociti e il contenuto di IL-2 nel sangue periferico sono stati significativamente aumentati. È dimostrato che il Verbascum può migliorare la funzione immunitaria del corpo.

Riepilogo: Sia che tu abbia una bassa immunità innata o una scarsa immunità acquisita, puoi mangiare cibi legati al cistanche per regolare la tua immunità.

Clicca per conoscere la cistanche tubulosa e dove acquistare la cistanche

RISULTATI

Hsa-miR-127-3p l è un regolatore negativo della via di segnalazione IFN-I

Nel nostro precedente sforzo per studiare i miRNA renali in LN, abbiamo confrontato i profili dei miRNA direnebiopsie da pazienti LN e un gruppo di controllo normale (descritto in MATERIALI E METODI). C'era un modello di espressione di miRNA distinto nei tessuti renali dei pazienti con LN (Figura S1). Tra i miRNA differenzialmente espressi, abbiamo selezionato 9 miRNA che erano sottoregolati (almeno del 50 percento) e conservati (tra uomo e topo) e testato i loro ruoli nella via di segnalazione IFN-I mediante il test del reporter ISRE-luciferasi. Considerando la fonte limitata di cellule renali umane primarie e la loro limitata capacità di proliferazione in vitro, abbiamo esaminato e verificato la funzione regolatoria dei miRNA e studiato i meccanismi molecolari associati utilizzando le cellule Hela. Rispetto agli altri 8 miRNA, la sovraespressione di hsa-miR-127-3p ha inibito significativamente l'induzione dell'attività della luciferasi mediata da ISRE nelle cellule Hela stimolate dall'IFN- (Figure 1A e Figura S2). Pertanto, abbiamo scelto di studiare ulteriormente hsa-miR-127-3p. Oltre a IFN- , l'induzione dell'attività ISRE-luciferasi stimolata da IFN- (un altro membro di IFN-I) potrebbe anche essere inibita da hsa-miR-127-3p(Figura S3).IFN-I può anche indurre l'espressione genica mediato dall'elemento GAS (3). Come previsto, la sovraespressione di hsa-miR-127-3p ha inibito l'induzione mediata da GAS dell'attività della luciferasi stimolata dall'IFN- (Figura 1A). Poiché i miRNA riconoscono i loro bersagli mediante l'accoppiamento di basi complementari delle loro sequenze di semi ai siti bersaglio sugli mRNA bersaglio (6). Questa funzione inibitoria di hsa-miR-127-3p sulla via di segnalazione IFN-I è stata eliminata dalla mutazione della sua sequenza di semi (Figure 1A). Coerentemente con questi risultati, la sovraespressione di hsa-miR-127-3p ha inibito la fosforilazione stimolata dall'IFN di STATl e STAT2, con un effetto molto più forte su STAT2, nelle cellule Hela (Figure 1B e S4). Per dimostrare che questo effetto inibitorio di hsa-miR-127-3p non era limitato alle cellule Hela, abbiamo inoltre verificato che la sovraespressione di hsa-miR-127-3p inibiva la fosforilazione di STAT2 stimolata da IFN in due tipi di cellule aggiuntivi (Figura S5).

Tovalidatehsa-miR-127-3p funziona come un regolatore negativo intrinseco cellulare della via di segnalazione dell'IFN-I nelle cellule residenti renali, abbiamo eseguito saggi reporter ISRE e GAS-luciferasi utilizzando HRMC primari, che possono rispondere a stimoli immunitari innati e partecipare alla patogenesi di LN come indicato in studi precedenti(12-15). Abbiamo trovato hsa-miR-127-3p antagomir potenziata ISREorGAS mediata induzione dell'attività della luciferasi stimolata da IFN- in HRMC primari (Figura 1C). Inoltre, hsa-miR-127-3p antagomir ha migliorato la fosforilazione di STAT2 stimolata dall'IFN- nelle HRMC primarie (Figure 1D e S6).

Successivamente, abbiamo eseguito il microarray per analizzare l'effetto inibitorio di hsa-miR-127-3p sull'espressione dei geni utilizzando campioni di RNA

da cellule Hela trattate con IFN che erano state precedentemente trasfettate con hsa-miR-127-3p o vari controlli (finta trasfezione, imitazioni di controllo negativo, imitazioni di mutanti hsa-miR-127-3p). Abbiamo calcolato i geni differenzialmente espressi sovrapposti nelle cellule Hela trattate con IFN-o (upregolate o sottoregolate di 1.5- volte) tra diverse coppie di confronto (hsa-miR-127-3p imita vs mock, hsa-miR{ {11}}p mimics vs controllo negativo mimics e hsa-miR-127-3p mimics vs hsa-miR-127-3p mimics), hanno recuperato tutti i geni che erano inibiti da hsa-miR{{17 }}p e ha eseguito un'analisi per identificare i motivi regolatori cis arricchiti dei geni inibiti da hsa-miR-127-3p utilizzando il plug-in iRegulon sulla piattaforma Cytoscape (10). Abbiamo scoperto che il motivo cis-regolatorio utilizzato dai TF a valle dell'IFN-I (come STAT-1, STAT-2 e IRFproteins) dominava i motivi arricchiti in alto (9 dei primi 10 motivi) (Figura 2A). Ciò dimostra ulteriormente che hsa-miR-127-3p inibisce principalmente la segnalazione a valle dell'IFN-I. Inoltre, dai dati del microarray, abbiamo riscontrato che la sovraespressione di hsa-miR-127-3p inibiva l'induzione di molti ISG, compresi quelli che costituiscono la 21-firma del gene IFN utilizzata per valutare l'efficacia di anifrolumab nel bloccare l'IFN -I segnalazione(8)(Figura 2B). Coerentemente con i risultati precedenti, i imitatori del mutante hsa-miR-127-3p non potevano inibire quegli ISG (Figura 2B). Abbiamo verificato l'inibizione di hsa-miR-127-3p su due rappresentanti ISG (IFIT3 e CXCL10) mediante ulteriori esperimenti indipendenti (Figura 2C). Mentre hsa-miR-127-3p antagomir ha migliorato l'induzione di IFIT3 e CXCL10 da parte di IFN- negli HRMC primari (Figura 2D). Pertanto, hsa-miR-127-3p funziona come un regolatore negativo della via di segnalazione IFN-I.

JAK1 è un gene bersaglio in buona fede di Hsa-miR-127-3p

Poiché hsa-miR-127-3p inibisce la fosforilazione della tirosina di STAT1 e STAT2 e l'induzione della maggior parte degli ISG stimolati dall'IFN-I, abbiamo ipotizzato che hsa-miR-127-3p possa colpire molecole chiave di trasduzione del segnale a monte di Via di segnalazione IFN-I, come JAK1 e TYK2. Pertanto, abbiamo esaminato i livelli proteici di JAK1 e TYK2 nelle cellule trasfettate con hsa-miR-127-3p o controlli mimici. Abbiamo riscontrato che la sovraespressione di hsa-miR-127-3p ha ridotto l'espressione di JAK1 sia a livello di proteine ​​​​che a livello di mRNA, ma non TYK2 (Figure 3A e S7, S8). Pertanto, abbiamo deciso di verificare se JAK1 fosse un obiettivo di hsa-miR-127-3p.

Con 2 algoritmi diversi (16,17), abbiamo previsto 3 potenziali siti di legame hsa-miR-127-3 sull'mRNA JAK1, con un sito di legame in 3'UTR e gli altri due nella sequenza codificante (CDS) (Figura S9) . Sebbene debole, hsa-miR-127-3p imita l'espressione del gene della luciferasi fuso con il tipo selvatico JAK13'UTR, mentre la mutazione della sequenza bersaglio in JAK1 3'UTR ha abolito l'inibizione (Figura 3B). Inoltre, abbiamo clonato una regione di codifica JAK1 troncata contenente i 2 siti target hsa-miR-127-3p nel vettore pCDNA3.1. Quindi, abbiamo creato una forma mutante del plasmide di espressione di troncamento JAK1 interrompendo i siti target 2 hsa-miR-127-3p. Abbiamo scoperto che hsa-miR-127-3p potrebbe anche inibire l'espressione di JAK1 troncato dal plasmide di tipo selvaggio ma non quello mutante (Figure 3C e S10). Considerando che l'effetto inibitorio indipendente di hsa-miR-127-3p onJAK1-3'UTRor JAK1-CDS era debole, proponiamo che hsa-miR-127-3p agisca su questi siti di legame insieme per ottenere una significativa inibizione dell'espressione di JAK1. Per verificare ulteriormente questa relazione di targeting tra hsa-miR-127-3p e JAK1, mostriamo che l'mRNA di JAK1 è stato arricchito nel complesso Ago2 nelle cellule in cui hsa-miR-127-3p era sovraespresso, ma non nelle cellule sovraesprimendo la forma mutante di hsa-miR-127-3p (Figura 3D).

Inoltre, abbiamo scoperto che i livelli di hsa-miR-127-3p nelle biopsie renali di pazienti con LN erano significativamente inferiori a quelli dei controlli normali (Figura 4A), mentre i livelli di JAK1 e IFIT3 nelle biopsie renali di pazienti con LN erano significativamente superiori a quelli dei controlli normali (Figure 4B, C). Inoltre, c'era una correlazione negativa tra i livelli di hsa-miR-127-3p e JAK1 (o IFIT3) nelle biopsie renali di pazienti con LN (Figure 4D, E). Pertanto, JAK1 è un gene bersaglio in buona fede di hsa-miR-127-3p.

DISCUSSIONE

Nel presente studio, abbiamo continuato il nostro precedente sforzo per esplorare le funzioni dei miRNA renali disregolati in LN. Qui, ci siamo concentrati sui miRNA sottoregolati nelle biopsie renali di pazienti con LN. Ne abbiamo scelti 9 per l'analisi in base a 2 criteri: conservazione e grado di downregulation (dettagliato nei RISULTATI). Poiché IFN-I è fondamentale per lo sviluppo di SLE e LN(3), abbiamo esaminato i 9 miRNA per potenziali regolatori della via di segnalazione IFN-I. Abbiamo identificato hsa-miR-127-3p come un regolatore negativo della via di segnalazione IFN-I dimostrando che potrebbe inibire la fosforilazione delle proteine ​​STAT e l'induzione dell'espressione genica mediata da ISRE (o GAS) stimolata da IFN- . Abbiamo scoperto che questo effetto inibitorio esisteva in più tipi cellulari distinti. Inoltre, la sovraespressione di hsa-miR-127-3p potrebbe ridurre notevolmente l'induzione di ISG. Inoltre, esiste una notevole sovrapposizione tra gli ISG inibiti da hsa-miR-127-3p e la firma dell'IFN soppressa da anifrolumab: 17 dei 21 geni della firma dell'IFN potrebbero essere inibiti da hsa-miR-127-3p, che viene utilizzato per valutare l'efficienza inibitoria di anifrolumab (18). Da notare che un recente studio clinico di fase 3 ha suggerito che la somministrazione mensile di nivolumab avvantaggia i pazienti con LES rispetto al placebo(2). Pertanto, i nostri risultati indicano che hsa-miR-127-3p può fungere da malattia da blocco dell'IFN-I (20). Ciò rafforza ulteriormente il potenziale terapeutico di hsa-miR-127-3p nel trattamento delle malattie autoimmuni.

Ci sono domande irrisolte per studi futuri. Uno è che non conosciamo ancora il meccanismo esatto per la downregulation di hsa-miR-127-3p nel rene di LN, che ci aiuterà a capire la patogenesi di LN. I nostri dati preliminari non pubblicati indicano che l'attivazione a lungo termine della via di segnalazione IFN-I ha soppresso l'espressione di hsa-miR-127-3p. Pertanto, potrebbe esserci un ciclo feedforward formato dall'eccessivo IFN-I e dalla diminuzione intracellulare di hsa-miR-127-3p, che amplifica la segnalazione dell'IFN-I. L'altro è che, fino ad ora, non abbiamo potuto esaminare gli effetti inibitori in vivo di hsa-miR-127-3p su JAK1 perché le sequenze di legame hsa-miR-127-3p del gene JAK1 umano non esistono nei topi . In futuro, i topi ingegnerizzati che esprimono il gene JAK1 umano potrebbero aiutare a chiarire l'efficienza in vivo di hsa-miR-127-3p nell'inibire JAK1 e la segnalazione delle citochine associate.

Per riassumere, mostriamo che JAK1 è un bersaglio in buona fede di hsa-miR-127-3p e la downregulation anormale di hsa-miR renale-127-3p contribuisce alla patogenesi di LN migliorando l'espressione di JAK1 e la successiva attivazione della via di segnalazione dell'IFN-I nel rene. Poiché le vie di segnalazione delle citochine infiammatorie associate a JAK1-sono fondamentali per lo sviluppo di molte malattie autoimmuni(4), sono necessari studi futuri per esplorare gli effetti terapeutici di hsa-miR-127-3p su LN o altre malattie autoimmuni correlate danni d'organo con sovraregolazione anormale di JAK1.