Un nuovo peptide derivato dalla netrina-1- migliora la protezione contro la morte neuronale e attenua l'emorragia intracerebrale nei topi Parte 3

Gruppi di trattamento con soluzione salina, TAT o TE1 (disciolto in soluzione salina) sono stati somministrati ai topi 2 h dopo l'ICH e ogni giorno per 5 giorni mediante iniezione intraperitoneale per un volume totale di 0,1 ml per animale. I peptidi sono stati somministrati in cieco a dosi di 12 mg/kg.

La soluzione salina fisiologica è un tampone fisiologico comunemente usato, ampiamente utilizzato negli esperimenti medici e biologici. Ma lo sapevi? La soluzione salina fisiologica può anche migliorare la nostra memoria!

Innanzitutto la soluzione salina fisiologica svolge un ruolo importante nella normale funzione delle cellule. Può mantenere la normale pressione osmotica cellulare e mantenere la normale morfologia e funzione delle cellule. Nel cervello, un gran numero di cellule nervose necessitano di soluzione salina fisiologica come sostanza di base e l'integrazione di soluzione salina fisiologica può favorire il normale funzionamento delle cellule cerebrali, fornire ossigeno e sostanze nutritive sufficienti per il cervello e rendere il cervello più sano.

In secondo luogo, la soluzione salina fisiologica può promuovere la trasmissione del segnale tra i neuroni cerebrali e migliorare la capacità di apprendimento del cervello. Gli studi hanno dimostrato che nel processo di apprendimento del compito, l'iniezione di soluzione salina fisiologica può migliorare significativamente l'effetto di apprendimento degli studenti, migliorare lo stato emotivo degli studenti e ridurre l'ansia e lo stress dell'apprendimento. Allo stesso tempo, la soluzione fisiologica può anche aumentare il numero e la complessità dei neuroni nell’ippocampo, favorendo la formazione e il mantenimento della memoria.

Inoltre, la soluzione salina fisiologica può migliorare l’ambiente metabolico del cervello e ridurre vari effetti dannosi sul cervello, come danni, lesioni, ischemia e ipossia. Questi sono fattori che possono danneggiare il cervello e l'iniezione di soluzione salina fisiologica può migliorare la capacità di adattamento del cervello e ridurne i danni, migliorando così la memoria e la capacità di pensiero del cervello.

In generale, la soluzione salina è una sostanza ideale per migliorare la memoria. Può avere molteplici effetti positivi sul cervello, tra cui l’aumento del numero e della complessità dei neuroni, il miglioramento dell’ambiente metabolico e la promozione della trasmissione del segnale tra i neuroni. Pertanto, quando abbiamo bisogno di migliorare la nostra memoria, potremmo anche prendere in considerazione l’iniezione di soluzione salina per fornire una migliore protezione e supporto al nostro cervello. Si vede che dobbiamo migliorare la nostra memoria, e la Cistanche può migliorare significativamente la nostra memoria perché può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentando i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita, che sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l'apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello ottenga nutrimento ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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4.13. Modello murino di ICH indotto da collagenasi

L’iniezione di collagenasi è comunemente usata per indurre l’ICH [60]. Topi maschi C57BL/6 (da 8 a 12 settimane di età) sono stati anestetizzati con isoflurano (dal 2 al 5%) e posizionati su un telaio stereotassico.

Durante la procedura, la temperatura corporea di ciascun animale è stata mantenuta a 37 ◦C con una coperta omeotermica. Utilizzando uno strumento stereotassico (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, Cina) e una siringa (Hamilton Company, Reno, NV, USA), 0,3 µL di collagenasi (0.{{12 }}45 UI; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) sono stati infusi nello striato destro (AP: +0,2 mm; ML: −2,3 mm; DV: −3,5 mm) a una velocità di flusso di 0,1 µl/min.

Un totale di 0,3 µL di soluzione salina è stato infuso negli animali di controllo. Tutte le procedure chirurgiche sono state condotte in condizioni asettiche. In questo studio sono stati utilizzati oltre 66 topi maschi e gli animali sono stati assegnati in modo casuale a gruppi prima di ciascun esperimento [57].

4.14. Analisi comportamentale

L'analisi comportamentale neurologica dei topi dopo la formazione di ematomi cerebrali è stata rilevata mediante il test di rimozione del nastro adesivo [61] e il test del cilindro [60]. Il test di rimozione del nastro adesivo è stato eseguito posizionando il nastro adesivo sulla regione della piantatrice di ciascuna zampa anteriore (destra e sinistra) dei topi.

Ogni topo è stato posto in una nuova gabbia.

Per ciascuna zampa è stato registrato il tempo trascorso dall'applicazione del nastro al momento in cui il topo lo ha rimosso con successo. Per ciascuna zampa è stato consentito un massimo di 300 s. Tra un esperimento e l'altro, gli animali sono stati alloggiati nelle loro gabbie domestiche in una struttura priva di agenti patogeni.

Il test del cilindro è stato eseguito posizionando un topo in un cilindro di vetro acrilico trasparente (diametro: 8 cm; altezza: 25 cm) davanti a 2 specchi e una telecamera per 5 minuti. La telecamera è stata posizionata centralmente davanti ai 2 specchi e al cilindro per ottenere un video ottimale.

Per valutare l'uso indipendente degli arti anteriori, sono state valutate (1) la capacità dei topi di contattare la parete del cilindro con un arto anteriore durante l'allevamento completo e (2) la capacità dei topi di atterrare con un solo arto anteriore sul pavimento dopo l'allevamento completo. Sono stati contati al rallentatore almeno 20 punti di contatto per ciascun arto anteriore.

Per l'analisi di base prima dell'intervento chirurgico, il test è stato eseguito due volte per topo con una pausa di 1 ora tra le prove. Gli arti anteriori sono espressi come il rapporto tra l'uso indipendente degli arti anteriori destro e sinistro.

4.15. Analisi del volume dell'ematoma

Per determinare se i trattamenti riducevano il volume dell'ematoma, i topi sono stati sacrificati 5 giorni dopo l'ICH; i cervelli sono stati rimossi e congelati in OCT. Le sezioni coronali sono state tagliate ad uno spessore di 30 µm e posizionate direttamente su vetrini. Per quantificare il volume dell'ematoma, le sezioni sono state digitalizzate a livelli coronali standardizzati.

Un utente in cieco ha misurato i contorni e l'ematoma negli emisferi sinistro e destro in ciascuna sezione. Il volume dell'ematoma e il gonfiore sono stati misurati e calcolati utilizzando ImageJ (NIH).

Almeno 5 cervelli per gruppo sono stati sottoposti a misurazioni dell'ematoma e il volume dell'ematoma è stato misurato in tutto il cervello.

4.16. Colorazione con fluoro-giada C

La neurodegenerazione nei topi in seguito a ICH indotta da collagenasi è stata valutata mediante colorazione con un kit di colorazione pronto per l'uso con fluoro-giada C (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Australia) secondo il protocollo del produttore [62].

In breve, i topi di controllo e i topi ICH (±ip peptide) sono stati sacrificati 5 giorni dopo la modellazione e i cervelli sono stati processati secondo il protocollo utilizzato per l'esperimento di immunocitochimica.

Le sezioni cerebrali galleggianti sono state immerse in una soluzione di idrossido di sodio all'1% per 5 minuti, risciacquate per 2 minuti in etanolo al 70% e quindi risciacquate per 2 minuti in acqua distillata. Successivamente, le sezioni galleggianti sono state immerse in una soluzione di permanganato di potassio allo 0,06% (KMnO4 in acqua distillata) per 10 minuti.

Le sezioni sono state lavate con ddH2O prima di essere immerse in una soluzione colorante di fluoro-giada 0,0001% (fluoro-giada C in acqua distillata) per 20 minuti con leggera agitazione al buio.

Le sezioni sono state lavate con ddH2O, montate su vetrini rivestiti ed essiccate a temperatura ambiente per una notte al buio. La colorazione con fluoro-giada C all'interno della regione periematomerica è stata esaminata utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM 880. La quantificazione della colorazione con fluoro-giada è stata eseguita utilizzando il software ImageJ.

4.17. Immunofluorescenza dei tessuti

La colorazione con immunofluorescenza dei tessuti è stata eseguita utilizzando una serie di sezioni di 30-μm di spessore. Le sezioni sono state incubate con i seguenti anticorpi primari: anticorpi murini antiNeuN (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, USA) o anticorpi murini anti-GFAP (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, USA) a 4 ◦C durante la notte. Dopo il lavaggio con PBS, le sezioni sono state quindi incubate con l'anticorpo anti-topo di asino coniugato Alexa Fluor 488-(1:1000; Invitrogen, A21202, Carlsbad, CA, USA).

4.18. Saggio TUNEL

Un test TUNEL (nick end-labeling) mediato da deossiuridina trifosfato (dUTP) terminale deossinucleotidil transferasi è stato utilizzato per identificare le cellule apoptotiche con frammentazione del DNA nucleare nella regione periematomale del cervello.

La colorazione è stata eseguita utilizzando un kit commerciale per il test dell'apoptosi TUNEL in una sola fase (Beyotime, C1090, Nanjing, Cina) ed eseguita secondo le istruzioni del produttore. Dopo l'immunofluorescenza dei tessuti, è stata eseguita la reazione TUNEL.

Le sezioni cerebrali sono state incubate con una miscela di reazione TUNEL (1 ora a 37 ◦C), quindi le sezioni sono state lavate con PBS e controcolorate con DAPI. La co-localizzazione della colorazione NeuN-TUNEL è stata esaminata utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM 880.

I neuroni TUNEL-positivi (NeuN positivi) nella regione periematomale all'interno dello striato sono stati quantificati utilizzando il software ImageJ su tre diverse immagini per topo scattate con un obiettivo 20X. La colocalizzazione della colorazione GFAP-TUNEL era simile a quella della colorazione NeuN-TUNEL.

4.19. Saggio di permeabilità della barriera ematoencefalica in vivo

In vivo, i test di permeabilità della barriera ematoencefalica sono stati eseguiti come descritto in precedenza [63-65]. In breve, ai topi di controllo e ai topi ICH (±ip peptide) è stato iniettato per via intraperitoneale destrano 4 kDa marcato con FITC (100 µl di stock 2 mM in PBS, Sigma Aldrich, 46944-100 MG-F, St Louis, MO, USA) dopo la modellazione 5 giorni, seguita da anestesia 5 minuti dopo.

Dopo un tempo di circolazione di 10 minuti per il tracciante, gli animali sono stati preparati per la perfusione transcardiaca e circa 300 µl di sangue sono stati raccolti dalla cavità toracica subito dopo la puntura atriale, seguiti da perfusione per 3 minuti con PBS. L'emiencefalo (privo di lobi olfattivi, cervelletto e rombencefalo) e un singolo rene sono stati raccolti e immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 ◦C.

Per la misurazione della fluorescenza, i campioni sono stati scongelati su ghiaccio, pesati e omogeneizzati in PBS (400 µL per l'emicerebro e 600 µL per il rene), seguiti da centrifugazione per 20 minuti a 4 ◦C e 15,000× g.

I surnatanti (100 µL), nonché volumi uguali di siero (diluizione 1/5 in PBS), sono stati caricati in una piastra nera 96-pozzetto e la fluorescenza è stata misurata al corrispondente livello di eccitazione (490 nm)/emissione (520 nm ) in un lettore di piastre (Tecan, Männedorf, Svizzera). Animali finti (senza tracciarininiezione) sono stati utilizzati per sottrarre i valori di autofluorescenza. L'indice di permeabilità (mL/g) è stato calcolato come il rapporto tra RFU tissutali/g di peso del tessuto e RFU sieriche/mL di siero.

4.20. Colorazione fluorescente della lectina

Per visualizzare i microvasi cerebrali, abbiamo utilizzato la lectina di Lycopersicon esculentum coniugata con fluoresceina (1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, USA) per immergere sezioni galleggianti per 1 ora.

Le sezioni sono state riprese su un microscopio confocale Zeiss LSM 880 con un obiettivo 20× e le immagini sono state elaborate con un'impostazione gamma di 1,3. Sono state scattate tre immagini da 3 aree prespecificate nella regione periematomale del cervello coronale peranimale. I punti di diramazione dei vasi sono stati quantificati in ciascun cervello da un investigatore in cieco. Un punto di diramazione è stato definito come un singolo vaso marcato con fluoresceina che si separa notevolmente in 2 percorsi vascolari distinti e separati [66].

4.21. Analisi statistica

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in cieco ed eseguite 3 volte in modo indipendente come precedentemente descritto [67]. I dati sono presentati come media ± SEM. L'analisi statistica è stata eseguita mediante ANOVA a una via, ANOVA a due vie e test di Student, a seconda dei casi, utilizzando GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA ) e il software SPSS versione 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

I parametri statistici si trovano nelle relative legende delle figure. La significatività statistica è stata fissata a *p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.]

5. Conclusioni

Il dominio EGF3 di Netrin-1 è cruciale per l'interazione di Netrin-1 con DCC e può attivare diversi percorsi di segnalazione. Il peptide troncato E1 di Netrin-1 (residui 407–422) interagisce con DCC per proteggere i neuroni dalla tossicità indotta dall'emina.

L'applicazione del peptide E1 migliora il recupero funzionale in un modello sperimentale di ICH. Inoltre, il peptide E1 può proteggere i neuroni dalla degenerazione e dall'apoptosi dopo l'ICH.

Contributi dell'autore: Concettualizzazione, LL, Z.-XH e X.-JZ; metodologia, LL, K.-JL eJ.-BC; validazione H.-LY e X.-XH; indagine, X.-JZ; cura dei dati, JY; risorse LL eZ.-XH; scritte LL, Z.-XH e X.-JZ; supervisione, Z.-XH, X.-JZ; acquisizione di finanziamenti, Z.-XHand X.-JZ Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento: questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (31671065 e 32071018), Piano di sviluppo scientifico e tecnologico della provincia di Jilin (202520YY01017404).

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale: tutte le procedure sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Northeast Normal University (NENU/IACUC, AP2016200299). Gli standard nazionali della Repubblica popolare cinese (GB/T 35892–2018), Laboratory Animal-Guideline forEthical Review of Animal Welfare, sono stati la guida per la nostra cura e i nostri protocolli sugli animali.

Dichiarazione di consenso informato: non applicabile.

Ringraziamenti: questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31671065 e 32071018) e dal Piano di sviluppo scientifico e tecnologico della provincia di Jilin (202520YY01017404).

Conflitti di interessi: gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto, ovvero nella decisione di pubblicare i risultati.

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