La maanimbina ha migliorato i deficit di memoria legati all'invecchiamento nei topi attraverso una migliore trasmissione colinergica e la soppressione dello stress ossidativo, dei livelli di amiloide e della neuroinfiammazione Parte 2

2.6. Valutazione dei livelli di malondialdeide (MDA) e glutatione (GSH).

Utilizzando kit disponibili in commercio, i livelli di MDA e GSH sono stati analizzati in campioni di cervello (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).

Mentre la scienza e la tecnologia continuano ad avanzare, gli scienziati stanno cercando di scoprire i misteri di misteriose e importanti attività psicologiche umane come la memoria, il pensiero e la coscienza. Tra questi, lo studio dei campioni cerebrali è considerato un campo di grande interesse perché può aiutarci a comprendere più a fondo la relazione tra memoria e cervello.

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Innanzitutto, cos’è un campione di cervello? In poche parole, si riferisce a un metodo per catturare, preservare e analizzare i neuroni (cellule cerebrali) e le loro connessioni nel cervello. In parole povere, è come una mappa del cervello che può mostrare le connessioni e le funzioni tra le diverse aree.

Successivamente, parliamo della relazione tra campioni di cervello e memoria. La ricerca scientifica ha dimostrato che la nostra memoria è strettamente correlata alla struttura del cervello. Quando apprendiamo nuove conoscenze, nel cervello si formano nuove connessioni neuronali e queste connessioni diventano più forti nel tempo. Attraverso lo studio di campioni di cervello, gli scienziati stanno lavorando duramente per studiare queste connessioni cerebrali e cercare di capire come migliorare l’apprendimento e la memoria attraverso di esse.

Inoltre, attraverso l'analisi di campioni di cervello, gli scienziati possono anche scoprire alcune cose interessanti. Ad esempio, hanno scoperto che l’ippocampo nel cervello umano è un’area strettamente correlata alla memoria. Questo perché l'ippocampo ha un'importante funzione nel cervello umano per convertire le informazioni dalla memoria a breve termine alla memoria a lungo termine.

Pertanto, il valore della ricerca sui campioni cerebrali non è solo quello di aiutarci a comprendere meglio la relazione tra cervello e memoria, ma anche di aiutarci a scoprire le cause profonde dei disturbi della memoria o delle malattie cognitive, promuovendo così il trattamento e la prevenzione delle malattie correlate.

Infine, dovremmo considerare positivamente l’aiuto della ricerca sui campioni di cervello sulla memoria. Sebbene ci siano ancora molti problemi scientifici da risolvere, con il continuo miglioramento della scienza e della tecnologia, crediamo che ci saranno ulteriori progressi in futuro. Guardiamo insieme al futuro e non vediamo l'ora di rendere il nostro cervello più intelligente attraverso la ricerca scientifica! Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria. La Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antietà, che possono aiutare a ridurre le reazioni ossidative e infiammatorie nel cervello, proteggendo così la salute del sistema nervoso. Inoltre, Cistanche può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, la capacità di apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire il verificarsi di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.

I livelli di MDA e GSH sono stati misurati rispettivamente in nanomoli/milligrammi di proteine ​​e micromoli/milligrammi di proteine. Per stimare il contenuto proteico nei tessuti cerebrali è stata seguita la tecnica Bradford.

2.7. Stima delle attività dell'acetilcolina (ACh) e dell'acetilcolinesterasi (AChE).

I livelli di ACh e AChE nell'omogenato cerebrale sono stati analizzati utilizzando kit commercializzati (BioAssay System, Hayward, CA, USA), che erano rispettivamente il kit EnzyChromTM AcetylcholineAssay e il kit QuantiChromTM Acetylcholinesterase Assay.

L'intensità della formazione del colore è stata rilevata in un lettore di micropiastre rispettivamente a 570 e 412 nm. Il livello di ACh ottenuto è stato espresso come µM, mentre l'attività di AChE è stata espressa come U/L.

2.8. Misurazione dei livelli di -amiloide

I kit ELISA di Cloud Clone Corp (Katy, TX, USA) sono stati utilizzati per valutare i livelli di A 1-40 e A 1-42 negli omogenati cerebrali. Per misurare la formazione del colore è stato utilizzato un lettore di micropiastre impostato su 450 nm.

La concentrazione di A 1-40 e A 1-42 nel campione era inversamente proporzionale all'intensità del colore. I risultati sono stati rappresentati in termini di pg/mL di proteine ​​totali.

2.9. Valutazione dell'attività della -secretasi (BACE-1) nel cervello del topo

L'attività BACE-1 nell'omogenato è stata quantificata utilizzando un kit commercializzato (SensoLyte® -Secretase Assay Kit di AnaSpec, Fremont, CA, USA). La rilevazione del kit si basa su un peptide, che viene scisso da BACE-1, e il segnale viene rilevato utilizzando un spettrofotometro con eccitazione/emissione a 490/520 nm.

2.10. Misurazione dell'attività della cicloossigenasi totale (COX).

L'attività della COX totale nell'omogenato cerebrale è stata stimata utilizzando un kit ELISA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA). La formazione del colore era direttamente proporzionale all'attività totale della COX. È stato utilizzato un lettore di micropiastre per leggere l'assorbanza a 590 nm.

2.11. Espressione genica di BACE-1 e COX-2

L'espressione di BACE-1 e COX-2 nell'RNA cerebrale isolato è stata analizzata utilizzando RT-PCR. Le tre fasi principali coinvolte erano: estrazione dell'RNA, conversione dell'RNA in tocDNA e reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR).

Tutti i passaggi hanno coinvolto kit forniti da Qiagen Valencia, CA, USA. Innanzitutto, l'RNA è stato estratto dal campione di cervello conservato nell'RNA. In questa fase, circa 100 mg di campione di tessuto cerebrale sono stati omogeneizzati utilizzando un TissueRuptor in 1 ml di reagente di lisi QIAzol e incubati per 5 minuti a temperatura ambiente.

Alla miscela di lisato cerebrale e reagente di lisi QIAzol è stato aggiunto cloroformio e agitata vigorosamente per 15 secondi, seguita da incubazione a temperatura ambiente per 2-3 minuti.

La miscela è stata centrifugata a 12,000× g per 15 minuti a 4 ◦C e le tre fasi formavano una fase incolore (fase superiore), che consisteva di RNA ed è stata raccolta con 1 volume di etanolo al 70% aggiunto a Esso.

Successivamente, 700 µL del campione sono stati trasferiti in una colonna spin e centrifugati a temperatura ambiente a 8000× g per 15 s; il flusso continuo è stato scartato. Dopo l'aggiunta di 700 µl di tampone RW1 (fornito nel kit) e la centrifugazione per 15 s a 8000× g, il flusso è stato scartato. La fase è continuata con l'aggiunta di 500 µl di tampone RPE (fornito nel kit) e centrifugazione per 15 s a 8000× g.

Questo passaggio è stato ripetuto due volte per lavare qualsiasi contaminazione organica nell'RNA. Infine, l'RNA è stato eluito aggiungendo 50 µL di acqua priva di RNAsi e centrifugato per 1 minuto a 8000× g.

La concentrazione di RNA è stata misurata utilizzando ananodrop (nanodrop 2000c, Thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA). L'RNA estratto è stato poi convertito in cDNA, che è stato utilizzato per eseguire la RT-PCR.

Innanzitutto, 14 µl di RNA modello sono stati aggiunti con la miscela master di trascrizione inversa da 6 µl (1 µl di trascrittasi inversa Quantiscript, 4 µl di buffer Quantiscript RT, 1 µl di miscela di primer RT). Dopo la miscelazione, è stato incubato per 15 minuti a 42 ◦C, seguito da incubazione a 95 ◦C per 3 minuti per inattivare la trascrittasi inversa Quantiscript.

Il prodotto formatosi era cDNA e infine è stata condotta la RT-PCR. Le condizioni RT-PCR sono state fissate a 95 ◦C per 5 minuti seguite da 40 cicli a 95 ◦C per 10 minuti e 60 ◦C per 30 minuti.

L'espressione dei geni BACE-1 e COX-2 è stata quantificata e normalizzata rispetto ai due geni housekeeping (-actina e GAPDH). I primer delle sequenze nucleotidiche erano basati su BACE-1 del topo (anteriore50-GCATGATCATTGGTGGTATC-30: inverso 50-CCATCTTGAGATCTTGAC-CA-30) ​​e COX-2 (in avanti 50-GTGTGCGACATACTCAAGCAGGA) sequenze di cDNA. -30: inverso 50-TGAAGTGGTAACCGCTCAGGTG-30), GAPDH (in avanti 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: inverso 50-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-30) e -actina (avanti 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: inverso 50-GCTGGAAGGTGGACAGGTGAG-30).

Sono state ottenute misurazioni della fluorescenza e per valutarle è stato utilizzato il software Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Hilden, Germania).

I risultati sono stati presentati come livelli di espressione successivi alla normalizzazione del gene housekeeping, che erano B-actina e GAPDH utilizzando l'approccio comparativo CT (ciclo soglia). L'equazione (1) è stata utilizzata per calcolare l'espressione genica del campione.

Il valore CT di ciascun campione è stato ottenuto in base alla curva standard generata per ciascun gene (gene target e gene di riferimento).

∆∆CT=Campione ∆CT − Controllo ∆CT (1)

Dove

Campione ∆CT: valore CT del gene bersaglio − valore CT del gene di riferimento

Controllo ∆CT: valore CT del gene bersaglio − valore CT del gene di riferimento

2.12. Analisi statistica

I dati sperimentali sono stati presentati come media ± SEM. La procedura ANOVA unidirezionale (Graph Pad versione 9, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) e il test post hoc Tukey-Kramer sono stati utilizzati per classificare le variazioni statistiche. Significativo è stato definito come un valore di probabilità pari a 0.05.

3. Risultati

3.1. Memoria potenziata da Mahanimbina nei topi anziani

L'apprendimento spaziale e la capacità di memoria della mahanimbina nel modello murino sono stati esaminati utilizzando il test MWM. Sono stati misurati la latenza di fuga (EL), la distanza di fuga (ED) e il tempo trascorso nel quadrante target.

Inoltre, l'attività locomotoria è stata considerata anche in base alla velocità media del nuoto dei topi. La Figura 2A mostra che il gruppo di controllo anziano aveva un EL marcatamente più lungo dal giorno 1 al giorno 3 (22,05 ± 1,70 s, 21,35 ± 1,85 s, 19,96 ± 2,34 s; p < 0,001 rispettivamente) rispetto al controllo giovane (12,75 ± 1,30, 10,12 ± 0,98, 7,60 ± 1,31; rispettivamente).

Ha rivelato che i topi anziani presentavano un deficit sostanziale nell'apprendimento e nella funzione di memoria nel test MWM. Tuttavia, il trattamento orale con dosaggi diversi (1 e 2 mg/kg) di mahanimbina ha mostrato un’inversione dei suddetti cambiamenti nell’EL dei topi anziani.

I valori EL per il gruppo mahanimbina da 1 mg/kg erano 22,01 ± 1,60 s, 15,88 ± 1,54 s (p < 0.01) e 8 0,26 ± 0 0,93 s (p < 0.001) per i giorni 1, 2 e 3, corrispondentemente rispetto al controllo invecchiato, mentre l'EL i valori per il gruppo mahanimbina 2 mg/kg erano 16,09 ± 0,33 s(p < 0,05), 17,14 ± 0,57 s (p < 0,05), 10,57 ± 0,86 s (p < 0,01), rispettivamente, se paragonati al controllo invecchiato. Il giorno 3, la EL di entrambi i gruppi (1 e 2 mg/kg) di mahanimbina non era significativamente diversa da quella del giovane controllo.

Figura 2. Effetto della mahanimbina su (A) latenza di fuga, tempo impiegato per trovare la piattaforma nascosta. (B) Distanza di fuga, distanza percorsa dal punto di partenza fino a trovare la piattaforma nascosta; (C) velocità media, velocità di nuoto dell'animale per trovare la piattaforma nascosta; (D) test della sonda, percentuale di tempo trascorso dai topi anziani nel quadrante target utilizzando il test del labirinto acquatico di Morris. Ci sono stati miglioramenti significativi nella latenza di fuga e nella distanza di fuga con mahanimbina nei topi anziani.

Inoltre, il trattamento ha aumentato il tempo trascorso nel quadrante target dei topi anziani. Tutti i dati sono stati espressi come media ± SEM (n {{0}}). ANOVA unidirezionale (giorno 1: F(3,20)=11.74, p < 0.001, giorno 2: F(3,20)=17.38,p < 0.001 e giorno 3: F(3,2{{69 }})=14.88, p < 0.001 per la latenza di escape giorno 1: F(3,20) {{ 26}}.22, p < 0.001, giorno 2: F(3,20)=28.62, p < 0,001 e giorno 3: F(3,20) {{40 }}.15, p < 0,001 per la distanza di fuga; giorno 1:F(3,20)=1.939, p > 0,05, giorno 2: F(3,20)=3.467, p > 0,05 e giorno 3: F(3,20)=2.497, p > 0,05 per la velocità media F(3,20)=7.185, p < 0,01 per il test della sonda seguito da Test di confronti multipli di Tukey-Kramer.** p < 0,01 e *** p < 0,001 rispetto al controllo giovane, # p < 0,05, ## p < 0,01 e ### p < 0,001 rispetto al controllo anziano.

La Figura 2B rappresenta l'effetto di mahanimbine sulla distanza percorsa dal punto di partenza fino a trovare la piattaforma nascosta. Il gruppo di controllo anziano ha percorso la distanza più lunga prima di trovare la piattaforma nascosta nei giorni 1, 2 e 3 (4,79 ± 0,73 m, 4,34 ± {{10}},11 m e 4,38 ± 0.59 m; p < {{20}}.001 rispettivamente) quando correlato al controllo giovane (1,36 ± 0,31 m, 1,35 ± 0,24 m e 0,78 ± 0,14 m rispettivamente).

Topi anziani alimentati con 1 mg/kg di mahanimbina hanno ridotto significativamente la ED (2,17 ± 0,11 m (p < 0.01),2,10 ± { {13}},24 m (p < 0.001), 0,89 ± 0,18 (p < 0,001 rispettivamente) per il giorno 1 fino al giorno 3 rispetto al controllo invecchiato;

Un significativo calo parallelo dell'ED è stato osservato nei topi a cui erano stati somministrati 2 mg/kg di mahanimbina nei giorni 1, 2 e 3 (2,43 ± 0,28 (p < 0.01) , 2,78 ± 0,32(p < 0.001), 1,47 ± 0,30 (p < 0,001 rispettivamente).

Per quanto riguarda le velocità medie del nuoto durante l'attività, non sono state osservate differenze tra i gruppi (Figura 2C). Ciò indica che la mahanimbina non ha alterato l’attività locomotoria correlata alla funzione motoria nei topi anziani.

Dopo 24 ore dall'attività effettiva, è stata condotta una sessione di test di sonda (giorno 30) per valutare la conservazione della memoria degli animali. Il gruppo di controllo anziano (Figura 2D) ha trascorso meno tempo nel quadrante target (10,10 ± 1,14% (p < 0,001)) e ha mostrato un tempo trascorso nel quadrante target significativamente ridotto rispetto al gruppo di controllo controllo giovane (19,53 ± 2,56%), mentre i topi anziani trattati con 1 mg/kg (20,27 ± 4,84%, p < 0,01) e 2 mg/kg (17,85 ± 1,56%, p < 0,05) di mahanimbina mediante sonda orale hanno mostrato un significativo tempo trascorso più a lungo nel quadrante target rispetto al controllo invecchiato.

3.2. Effetto di Mahanimbine sui livelli di MDA e GSH nel cervello di topo invecchiato

I livelli di MDA nel controllo anziano (Figura 3A) erano considerevolmente più alti (11,54 ± 0,88 µM;p < 0.001) rispetto al controllo giovane (4,37 ± 0,09 µM). L'aumento del livello di MDA nell'omogenato cerebrale di topi anziani rifletteva una maggiore attività di LPO, che indicava un aumento dello stress ossidativo nel tessuto cerebrale.

Al contrario, la somministrazione di mahanimbina (1 mg/kg, po) ha ridotto significativamente i livelli di MDA cerebrali nei topi anziani (7,56 ± 0,35 µM;p < 0.001) rispetto al controllo invecchiato. Non sono stati notati cambiamenti considerevoli con 2 mg/kg di mahanimbina (9,65 ± 0,51 µM).

La quantità di glutatione (GSH) nell'omogenato cerebrale ha suggerito il potenziale antiossidante della mahanimbina. L'analisi statistica del GSH (Figura 3B) ha mostrato un'attenuazione significativa tra il gruppo di controllo anziano (0.0028 ± 0.0004 µmoles/ mg; p < 0,001) quando associato al controllo giovane (0,0447 ± 0,0029 µmoli/mg).

Il presente studio ha inoltre rilevato che il trattamento con mahanimbina (1 e 2 mg/kg, PO) ha invertito il livello di GSH, che era significativamente più alto (0.0372 ± 0.{{8} }{{10}}38 µmoli/mg, p < 0,001 e 0,0282 ± 0,0041 µmoli/mg, p < 0,001 rispettivamente) come corrispondenti al controllo invecchiato;

3.3. Mahanimbina ha migliorato l'attività colinergica nel cervello di topo invecchiato

La Figura 4A mostra i livelli di ACh nel cervello del topo. L'ACh era ridotta in modo comparabile (p < 0.001) nel controllo anziano (17,79 ± 1,54 µM) rispetto al controllo giovane (34,82 ± 0. 31 µM). La somministrazione di mahanimbina (1 e 2 mg/kg), tuttavia, è aumentata significativamente (35,61 ± 0,85 µM, (p < 0,001); 39,42 ± 0,88 µM (p < 0,001); rispettivamente) il livello di ACh nel cervello associato al gruppo di controllo anziano.

La Figura 4B rappresenta l'effetto della mahanimbina contro l'attività ACHE nel cervello. L'attività dell'AChE nel gruppo di controllo anziano (204,80 ±1,55 U/L) era considerevolmente elevata (p < 0,001) così come nel gruppo di controllo giovane (51,06 ± 1,36 U/L).

Tuttavia, il livello di AChE è stato suggestivamente inibito con il trattamento di 1 mg/kg (62,03 ± 4,64 U/L; p < 0,001) e 2 mg/kg (43,73 ± 4,76 U /L; p < 0,001) mahanimbina quando associata al controllo invecchiato. Nel complesso, la somministrazione di una dose elevata di mahanimbina (2 mg/kg, po) ha prodotto risultati migliori per l'attività colinergica poiché ha aumentato il livello di ACh e ha soppresso l'attività di AChE.

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