Uno studio pilota sulla proteomica delle urine nella lesione renale acuta associata a COVID

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Uno studio pilota sulla proteomica delle urine nella lesione renale acuta associata a COVID-19

Parole chiave:Urina, COVID-19, Danno renale acuto,COVID

INTRODUZIONE

Acutorenelesioneè una delle principali complicazioni associateCOVID-19e si verifica fino al 76% dei pazienti nell'unità di terapia intensiva.1,2 Il tasso di mortalità dei pazienti conCOVID-19che ha sviluppatoDanno renale acuto (COVID-Acutorenelesione) is >10 volte superiore a quelli che non l'hanno fatto. Sebbene candidatoDanno renale acutoesistono marcatori, l'eziologia diCOVID-Danno renale acutoè multifattoriale che richiede approcci agnostici per l'identificazione degli analiti nel corso intraospedaliero precoce per fornire approfondimenti sui biomarcatori e sui meccanismi associati aCOVID-Danno renale acutoeCOVID-19infezione. RicercareCOVID-19–gli effetti associati sul proteoma urinario sono limitati e la disfunzione renale non è stata segnalata.3 Circa il 70% delle proteine ​​rilevate nelurinasono prodotti nel rene con una quantità significativa filtrata dal sangue. Ipotizziamo che i cambiamenti nelle abbondanze proteiche nelurinapotrebbe portare alla scoperta di marcatori proteici associatiCOVID-19oCOVID-Acutorenelesionee fornire approfondimenti meccanicistici per migliorare la comprensione.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Abbiamo analizzatourinacampioni da 14 partecipanti (6COVID-Acutorenelesione, 3 COVID-NoAcutorenelesione, e 5 nCOVID-NoAcutorenelesione) (Materiali e metodi supplementari, Figura 1A supplementare e Tabella S1 supplementare). Per tenere conto della grande variazione del contenuto proteico attraversourinacampioni, abbiamo usato un acido bicinconinico per misurare la concentrazione di peptidi dopo la digestione delle proteine ​​(materiali e metodi supplementari). Tutti i campioni di peptidi vengono quindi normalizzati alla stessa concentrazione prima dell'analisi per consentire la quantificazione relativa delle differenze nel proteoma urinario (materiali e metodi supplementari).

Cistanchepuò essere utilizzato per ilCOVID-19–associatoAcutorenelesione.

IlUrinaproteoma di COVID-Acutorenelesione

Dopo aver confermato la qualità diurinaper la scoperta di analiti (materiali e metodi supplementari, tabella supplementare S2 e figura supplementare S1), abbiamo valutato se la varianza sottostante potesse distinguere traacutorenelesionepositivo (Acutorenelesione) (6 COVID-Acutorenelesione) da altri campioni senzaAcutorenelesione(8 Acutorenelesionenegativo); tuttoAcutorenelesionei campioni provenivano da pazienti conCOVID-19. Le prime 2 componenti principali rappresentavano il 42,1% della varianza e separavano chiaramente i 2 gruppi (Figura 1b), suggerendo così un impatto prominente diAcutorenelesionesulurinaproteoma dei pazienti conCOVID-19. C'è stato un aumento statisticamente significativo di 97 proteine ​​e una diminuzione di 140 proteine ​​nelAcutorenelesionegruppo (regola P <{0}}.05; figura="" 1c="" e="" figura="" supplementare="" s2a).="" l'analisi="" del="" clustering="" gerarchico="" e="" dell'arricchimento="" del="" percorso="" ha="" rivelato="" che="" i="" percorsi="" regolati="" dall'alto="" erano="" l'attivazione="" del="" complemento,="" le="" cascate="" di="" coagulazione="" e="" l'esocitosi="" regolata="" (figura="" 1d="" ed="">

In particolare, i componenti del complemento C2, C3, C5, C6 e C8G sono stati significativamente aumentati nelAcutorenelesionegruppo che influenza l'inizio del complemento (Figura 1d). In particolare, il fattore di accelerazione del decadimento CD55 è diminuito di 2.5- volte nelAcutorenelesionegruppo. Ciò suggerisce una ridotta capacità di regolare l'attivazione del complemento, aggravando così la lesione. Questo risultato è supportato dall'esacerbazione diAcutorenelesionenei topi con delezione di CD55 dopo danno da ischemia-riperfusione.4 L'attivazione del sistema del complemento è associata a graveCOVID-19. La proteina delle cellule renali sC5b-9, spesso associata a insufficienza respiratoria, è sovraregolata nel plasma nei pazienti conCOVID-19con danno renale da moderato a grave. Confronto diCOVID-19 campioni con e senzaAcutorenelesioneha anche rivelato l'arricchimento delle proteine ​​​​associate alla via del complemento (materiali e metodi supplementari, colonne X-Z della tabella supplementare S2). La possibilità che complessi immunoglobulinici (trovati a livelli più elevati in individui con graveCOVID-19) potrebbe plausibilmente reclutare questo complemento al nefrone potrebbe spiegare il meccanismo perAcutorenelesionee grave insufficienza che richiede la dialisi. Rilevazione di diverse componenti delle vie del complemento nelurinadi pazienti conCOVID-Acutorenelesioneè nuovo. Potrebbe servire come punto di riferimento per confrontare come si evolve la patogenicità SARS-CoV-2 durante diverse ondate diCOVID-19e apre la strada alla valutazione comparativa conCOVID-Acutorenelesionenel futuro. Così,urinaè un biocampione facilmente accessibile per monitorare lo stato del sistema del complemento nei pazienti conCOVID-19.

Inoltre, i fattori della coagulazione F9, F10, F13b, la catena beta del fibrinogeno e la catena gamma del fibrinogeno erano significativamente aumentati nelAcutorenelesionegruppo (Figura 1d). In questo gruppo sono stati aumentati anche diversi marcatori di esocitosi regolata, tra cui mieloperossidasi, catalasi, lisozima, leucotriene A4 idrolasi, proteinasi 3 e metallopeptidasi 9 della matrice (Figura 1d). I percorsi regolati dall'alto verso il basso includevano l'organizzazione della matrice extracellulare e l'adesione cellula-cellula eterofila (Figura 1e), indicando un danno tubulare.

Inoltre, abbiamo rilevato che diversi biomarcatori urinari noti diacutorenelesione, compreso NGAL; FABP3, FABP4; MEP1A; e RBP4, aumentato nelurinadei pazienti conCOVID-Acutorenelesione(Figura 1d e Tabella Supplementare S2). Tuttavia, l'analisi del proteoma ha rivelato una significativa diminuzione di UMOD ed EGF in questo gruppo. UMOD urinario ed EGF sono risultati inversamente correlati conAcutorenelesione, e la loro diminuzione è fortemente associata aAcutorenelesioneseverity. These results further validate our proteome approach and are indicative of tubular injury affecting secretion (NGAL, UMOD, EGF) or defective absorption by proximal tubules (FABP3, FABP4). A novel observation was a >30-volte aumento di IGFBP6 nei pazienti conCOVID-Acutorenelesione. Relativamente poco si sa su IGFBP6 inAcutorenelesione, ma in precedenza è stato riscontrato che è correlato a una ridotta funzionalità renale e all'insufficienza renale.5 Ulteriori studi che utilizzano coorti più ampie diurinasono necessari campioni in tutte le condizioni per confermare i cambiamenti in questi biomarcatori e per confrontarli con altre cause diacutorenelesione, covariate e risultati.

IlUrinaProteoma associato conCOVID-19in assenza diAcutorenelesione

PerchéAcutorenelesioneporta a cambiamenti significativi nelle abbondanze di molte proteine ​​urinarie, è difficile identificare i cambiamenti che sono solo associatiCOVID-19. Abbiamo, quindi, confrontato ilurinaproteomi diCOVID-19positivo (n ¼ 3) e negativo (COVID) (n ¼ 5) pazienti senzaAcutorenelesione(Figura supplementare S2B). Le abbondanze di 57 proteine ​​sono aumentate significativamente e 19 proteine ​​sono state significativamente diminuite nelurinadiCOVID-19 patients (adjust P < 0.05, Figure 2a and Supplementary Table S2). Furthermore, a large percentage of the proteins with significantly increased levels were immunoglobulins (49.1%). The remaining proteins with increased expression were involved in the antigen presentation pathway. Proteins with significantly decreased expression were enriched in the regulated exocytosis pathway (Figure 2b). Specifically, the average abundances of major MHC-I proteins HLA-A and HLA-C increased >3.6-ripiegare ilurinaa causa diCOVID-19. Il complesso MHC presenta antigeni sulla superficie cellulare alle cellule immunitarie quando le cellule sono infettate da virus. I complessi MHC-peptidi sono stati rilevati in diversi fluidi corporei umani, compreso il siero eurina.6 La down-regulation dell'esocitosi è stata contrassegnata dall'abbondanza significativamente ridotta di DEFA1, GRN, HSPA6, SDCBP, IQGAP1 e CYRIB (Figura 2c).

Inoltre, c'erano 4 proteine ​​con abbondanze significativamente aumentate nelCOVIDgruppo rispetto alCOVIDgruppo, inclusi MB, CA1, MANSC1 e ABRACL (Figura 2c e colonne supplementari S2 della tabella S2 AA-AC). Inoltre, 5 proteine ​​sono state significativamente ridotteCOVID, inclusi GRN, CREB3L3, MUC1, CD320 e DLST (Figura 2c e colonne supplementari S2 della tabella S2 AA-AC). Queste proteine ​​recentemente identificate potrebbero essere potenzialmente utilizzate come biomarcatori più sensibili per valutare ilCOVID-19infezione. Inoltre, i dati rivelano che diversi marcatori sono extrarenaliCOVIDpazienti (Figura 2), compreso l'aumento di 568-volte della mioglobina (specifica per il cuore) e di 392-volte dello zimogeno pepsinogeno C (lesioni ai polmoni, all'esofago e allo stomaco), che sono bersagli promettenti per il non invasivourinaprofilatura del proteoma per rilevare e monitorare il danno d'organo indipendente dal rene.

Il virione SARS-CoV-2 non viene in genere diffuso nelurina, ma ha tropismo per i tipi di cellule renali.7–9 Abbiamo valutato seurinala proteomica può rilevare le proteine ​​SARS-CoV-2. È interessante notare che i peptidi della nucleoproteina SARS-CoV-2 sono stati rilevati nelurinacampioni raccolti da 2 pazienti gravemente malati conCOVID-Acutorenelesioneche è morto (materiali e metodi supplementari, figura 1a e tabella supplementare S1). L'identificazione del peptide è stata confermata dalla ricerca con il software MaxQuant e MS-GFþ. La copertura della sequenza quasi completa del dominio di legame dell'RNA è stata ottenuta mediante cromatografia liquida a dimensione singola accoppiata all'analisi della spettrometria di massa tandem. Sono state osservate anche sequenze vicino all'N-terminale della nucleoproteina SARS CoV-2 (Figura 2d). A causa delle corrispondenze dello spettro peptidico relativamente basso dei peptidi SARS-CoV-2 osservate, si prevede che la concentrazione della nucleoproteina SARS-CoV-2 sia bassa in questiurinacampioni (Tabella Supplementare S3).

Sebbene il nostro studio sia un'indagine proof-of-concept con un numero relativamente piccolo di campioni di pazienti, siamo stati in grado di stabilire metodi perurinaproteomica dei pazienti conCOVID-19in ambito clinico. Segnaliamo potenziali biomarcatori diCOVID-19infezione eCOVID-Acutorenelesioneche potrebbero essere utili per rilevare e monitorare lo sviluppo diCOVID-19infezione oAcutorenelesione. In particolare, le vie del complemento e della cascata della coagulazione e le vie dell'esocitosi erano altamente sovraregolate nei pazienti conCOVID-Acutorenelesione. Inoltre, le proteine ​​associate alla presentazione dell'antigene erano significativamente correlateCOVID-19infezione. Proponiamo un elenco di potenziali nuove proteine ​​​​biomarcatori (cioè MB, CA1, MANSC1, ABRACL, GRN, CREB3L3, DEFA1, MUC1, DLST e IGFBP6) e di quelle precedentemente riportateAcutorenelesioneproteine ​​​​biomarcatori (cioè, NGAL, FABP3, FABP4, MEP1A e RBP4) per un'ulteriore convalida della loro specificità, sensibilità e gravità. Un sottoinsieme dei nostri pazienti conCOVID-AcutorenelesionesviluppatoAcutorenelesionesulla malattia renale cronica preesistente, che potrebbe interessare anche ilurinaproteine ​​trovate arricchite in questo gruppo. Analizzare l'effetto dello stato di malattia renale cronica inCOVID-19richiederebbe coorti più grandi; tuttavia, osserviamo che l'arricchimento delle proteine ​​​​del complemento e della via della coagulazione è stato riscontrato nei pazienti conCOVID-Acutorenelesione con e senza malattia renale cronica (Figura 1d e Tabella Supplementare S1). Nel loro insieme, questi entusiasmanti risultati preliminari rivelano chiaramente la necessità di ulteriori indagini in una coorte clinica allargata che includa pazienti conCOVID-19-associatoAcutorenelesione.

CHIARIMENTI

CRP riferisce di essere un membro del comitato consultivo e di possedere azioni in Renalytix AI e di prestare servizio come consulente per Genfifit. Rapporti AV in qualità di consulente per NxStage Medical Inc. e Astute Medical Inc. Queste entità non hanno supportato la ricerca in questo studio. Tutti gli altri autori non hanno dichiarato alcun interesse concorrente.

RINGRAZIAMENTI

Questo studio ha utilizzato campioni ottenuti dalCOVID-19biorepository della Washington University School of Medicine, che è supportato da: la Barnes Jewish Hospital Foundation; il Siteman Cancer Center concede P30 CA091842 dal National Cancer Institute del National Institutes of Health; e il Washington University Institute of Clinical and Translational Sciences concede UL1TR002345 dal National Center for Advancing Translational Sciences del National Institutes of Health. Ringraziamo il George M. O'Brien Center della Johns Hopkins University per aver eseguito ilrenelesionesaggi di biomarcatori (concessione P30DK079310). Parti di questa ricerca sono state eseguite utilizzando EMSL, una struttura scientifica nazionale per l'utente sponsorizzata dall'Ufficio per la ricerca biologica e ambientale del Dipartimento dell'energia e situata presso il PNNL. Il lavoro di proteomica è supportato dal NIH Common Fund, attraverso l'Office of Strategic Coordination/Office of the NIH Director con il premio UG3HL145593, e NIH sovvenziona U01DK124020. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista del National Institutes of Health. Ringraziamo il Kidney Translational Research Center (KTRC) della Divisione di Nefrologia della Washington University di St. Louis per aver supportato l'elaborazione, la conservazione e lo stoccaggio diurinacampioni. Siamo grati a Charles Goss, Adriana Rauseo Acevedo e Rachel Presti per i loro sforzi nella gestione dei dati e nel reclutamento dei pazienti. Ringraziamo anche Jana Chiang per i suoi contributi nella modifica, formattazione e revisione del contenuto.

MATERIALE SUPPLEMENTARE

File supplementare (PDF) Materiali e metodi supplementari. Include informazioni sui metodi utilizzati per l'acquisizione del campione e l'inclusione del paziente,urinaelaborazione e conservazione, preparazione del campione di proteomica, analisi proteomica basata su LC-MS/MS, elaborazione dei dati di proteomica, analisi di correlazione di pazienti con COV-Acutorenelesionerispetto a quelli senzaacutorenelesionee dove i dati sono disponibili per il download. Figura S1. Correlazione di Pearson della proteomica urinaria tra i campioni studiati. Figura S2. Distribuzione dei valori P prima dell'aggiustamento. (A) Risultati statistici del limma test che ha confrontato le intensità diurinaproteine ​​in base allo stato diacutorenelesione. (B) Risultati statistici del limma test che hanno confrontato le intensità diurinaproteine ​​a base diCOVID-19infezione nelAcutorenelesione-gruppo negativo. Tabella S1. Master sheet dei partecipanti alla ricerca. Tabella S2. Risultati dell'analisi statistica della proteomica urinaria. Tabella S3. I peptidi SARS-CoV{5}} sono stati rilevati in 2 campioni di urina mediante LC-MS/MS. I dati di proteomica sono stati ricercati con il software MSGFþ. Dichiarazione STROBE (PDF).

RIFERIMENTO

La fonte è di Yinyin Ye, Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, Washington, USA, ecc.