Parte Ⅱ: La sovraespressione di PKD1 provoca la malattia del rene policistico

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté e Marie Trudel

I meccanismi patogenetici alla baseautosomica dominante malattia policistica renale(ADPKD) restano da chiarire. Sebbene ci siano prove che PKD1 (malattia del rene policistico 1) l'aploinsufficienza genica e la perdita di eterozigosi possono causare la formazione di cisti nei topi, livelli paradossalmente elevati di PKD1 (malattia del rene policistico 1) sono stati rilevati nei reni di pazienti con ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante). Per determinare se PKD1 (malattia del rene policistico 1) il guadagno di funzione può essere un processo patogenetico, una PKD1 (malattia del rene policistico 1) cromosoma artificiale batterico PKD1 (malattia del rene policistico 1)-BAC) è stato modificato dalla ricombinazione omologa per mirare esclusivamente a una PKD1 sostenuta (malattia del rene policistico 1) espressione preferenzialmente al rene adulto. Sono state generate diverse linee transgeniche che hanno sovraespresso in modo specifico la PKD1 (malattia del rene policistico 1) transgene nei reni 2- per 15-ripiegare su PKD1 (malattia policistica renale1) livelli endogeni. Tutti i topi transgenici hanno sviluppato in modo riproducibile cisti tubulari e glomerulari e insufficienza renale e sono morti per insufficienza renale. Questo modello dimostra che la sovraespressione di PKD1 wild-type (malattia del rene policistico 1) da solo è sufficiente per innescare una cistogenesi simile all'ADPKD umana (autosomica dominantemalattia policistica renale). I nostri risultati hanno anche scoperto un sorprendente aumento dell'espressione renale di c-Myc nei topi di tutte le linee transgeniche, indicando che c-Myc è un effettore critico in vivo a valle della PKD1 (malattia del rene policistico 1) via molecolare. Questo studio non solo ha prodotto un prezioso e primo PKD（malattia policistica renale）modello per valutare la patogenesi molecolare e le terapie, ma fornisce anche prove che il guadagno di funzione potrebbe essere un meccanismo patogenetico nell'ADPKD (malattia del rene policistico autosomica dominante).

Cistanche cura delle malattie renali

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RISULTATI

Produzione di PKD1 (malattia del rene policistico 1)-Ac-BAC per ricombinazione omologa. Per determinare se PKD1 (malattia del rene policistico 1) il solo guadagno di funzione è sufficiente per produrre il fenotipo ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante), abbiamo prima isolato un clone genomico contenente l'intera PKD1 (malattia del rene policistico 1) gene in una libreria del vettore BAC 129/Sv. Questa libreria è stata sottoposta a screening mediante PCR con due set di primer per PKD1 (malattia del rene policistico 1) gene che attraversava l'esone 1 all'estremità 5' e gli esoni da 39 a 40 verso l'estremità 3' (Fig. 1). Un clone BAC positivo per PKD1 (malattia del rene policistico 1) è stato identificato il gene che includeva l'intero corpo del gene Tsc2 adiacente. L'inserto PKD1 (malattia del rene policistico 1) è stato caratterizzato in dettaglio per garantire che la struttura genomica corrispondesse a quella della PKD1 endogena (malattia policistica renale1) gene del ceppo murino 129/Sv da cui deriva l'inserto e dal ceppo consanguineo C57BL/6J. Mappe genomiche della PKD1 (malattia del rene policistico 1) locus nel BAC e in questi ceppi consanguinei mediante analisi Southern blot, con quattro digestione con enzimi di restrizione e sette sonde che coprono l'intera PKD1 (malattia del rene policistico 1)gene, è apparso identico senza evidenza di riarrangiamenti (Fig. 1). Questo BAC conteneva un inserto -121-kb che includeva ~37 kb di upstream e -39 kb di una sequenza a valle del PKD1 (malattia policistica renale1) gene determinato mediante elettroforesi e sequenziamento.

FIGURA. 2.Produzione di costrutti SBPkdlrAc e topi transgenici. (a) Sono stati effettuati successivi eventi di ricombinazione omologa sul Pkdl-BAC murino per introdurre due modifiche: gli elementi regolatori SB inseriti immediatamente a monte del codone di inizio Pkdl e una mutazione puntiforme silente di EcoRI (RI*) introdotta nell'esone(ex) 10. Il vettore di ricombinazione BAC contiene un'origine di replicazione R6Ky, un gene resistente all'ampicillina, un gene SacB, un gene RecA e un sito di clonazione Smal unico in cui sono stati clonati gli elementi regolatori "SB" (o la mutazione puntiforme silente dell'esone 10) con bracci del gene Pkd1 fiancheggianti. Il vettore di ricombinazione BAC è stato elettroporato in cellule E, coli (DH10B) contenenti il ​​tipo selvaggio Pkdl-BAC e, dopo la selezione, si è verificato un primo evento di ricombinazione omologa tramite uno dei due bracci Pkd1 per produrre cointegrati BAC. Il vettore di ricombinazione e le regioni Pkdl duplicate dei cointegrati BAC sono state eliminate in una seconda fase di selezione. I Pkdl-BAC risolti possono tornare al tipo jolly o includere la modifica prevista. La successiva ricombinazione omologa nel BAC appena modificato può quindi essere introdotta.(b)(ienomc DNA ot SBPkd l-etransgenic mxce was anakZed bv Sou thern blot.AVicToiD1ecLon di frammenti linearizzati ha causato l'inserimento del transgene in un testa a testa. orientamento -to-tail e/o tail-to-tail. L'estremità 5' è stata analizzata mediante digestione del DNA genomico con HindIII e ibridata con la specifica sonda transgene SB (pannello di sinistra). Tutte e tre le linee di topo transgenico hanno generato il 10 previsto .9-banda kb per l'inserimento dalla testa alla coda; la banda aggiuntiva osservata nella riga 39 molto probabilmente rappresenta un frammento di giunzione tra SB e il genoma del topo. L'integrità interna del transgene è stata monitorata da diverse digestione di enzimi di restrizione e viene mostrata una macchia rappresentativa di DNA genomico digerito con EcoRI e ibridato con la sonda Pkdl (esone 7-15) (pannello centrale).

Questo SBPKD1 (malattia del rene policistico 1Il clone )-BAC è stato modificato da due successivi eventi di ricombinazione omologhi in E. coli. Il gene PKD1 (malattia del rene policistico 1) è stato contrassegnato nell'esone 10 sostituendo un nucleotide (da G ad A) per creare un nuovo sito EcoRI nella posizione 2355 sulla mappa del cDNA. Questa mutazione puntiforme silente è stata prodotta per distinguere la PKD1 (malattia del rene policistico 1) gene e trascrizione del BAC da quello di origine endogena. Inoltre, abbiamo sostituito gli elementi normativi 5' del PKD1 (malattia del rene policistico 1)-gene BAC sfruttando gli elementi specifici dell'epitelio renale "SB" precedentemente identificati dal gene trans-costrutto SBM (legato a c-Myc) o SBF legato a c-fos) per limitare l'espressione ai reni(36, 38)(Fig. 2a).

Questo nuovo SBPkdlrAG-BAC è stato digerito con NotL, un sito unico situato immediatamente a monte degli elementi SB, e ClaI all'interno del corpo del gene Tsc2, troncando gli elementi regolatori Tsc2 e la metà 5' del corpo del gene per garantire la mancanza di T'sc2 espressione esogena in tutti i tessuti e per rimuovere le sequenze del vettore BAC procariotico (Fig. 1 e 2). Questo 70- frammento linearizzato NotI-ClaI kb è stato isolato, purificato. e quantificato per la microiniezione di ovociti (36).

BENEFICIO CISTANCHE: CURA DELLE MALATTIE RENALI

Produzione e analisi di topi transgenici SBPkdl-ac. Quattro fondatori transgenici portatori di diverse copie del transgene SBPkdlrAc hanno sviluppato in modo coerente la PKD. Dai quattro SBPKD1 (malattia del rene policistico 1)Topi fondatori RAC determinati dall'analisi Southern, tre SBPKD1 (malattia del rene policistico 1)Sono state stabilite linee transgeniche TAG con da due a nove copie del transgene (Fig. 2b). La caratterizzazione dell'integrità del transgene in queste linee è stata monitorata con sonde 5', interne e 3' come mostrato da esempi rappresentativi in ​​Fig.2b. Le linee transgeniche hanno rivelato con la sonda 5'"SB" una banda a 10,9 kb coerente con SBPkdlrAc trans-gene essendo integrato in un orientamento testa-coda e ha rivelato con la sonda 3' una banda 7.{12}}kb (Fig.2b). Inoltre, la sonda interna ha rilevato la banda PKD1 endogena da 9.4-kb (malattia del rene policistico 1) e le bande da 6.9-kb e 2.5-kb del transgene a causa del sito di inserimento EcoRI nell'esone 10 (Fig. 2b). Questi topi contenevano copie complete del transgene in base all'analisi della struttura genomica sovrapposta.

PKD1 (malattia del rene policistico 1)guadagno di funzione in topi transgenici SBPkdl-Ac adulti. Espressione della SBPkdl-AG. transgene e PKD1 (malattia del rene policistico 1) è stato studiato in vari organi. La quantificazione dei livelli di trascrizione dal gene transgene e/o endogeno è stata effettuata mediante analisi Northern blot (Fig. 3a). Come previsto, le trascrizioni del transgene e del gene endogeno erano di lunghezza simile (14,2 kb). Sulla base dell'espressione di controllo GAPDH, i reni di tutte le linee di topo SBPkd 1 A avevano un'espressione del trascritto costantemente aumentata rispetto alla normale PKD1 (malattia del rene policistico 1) livelli nei reni adulti (n=3) di età simile. Il transgene renale e l'espressione endogena per le diverse linee transgeniche hanno mostrato un intervallo da 2- a 15- volte al di sopra della PKD1 endogena renale di controllo(malattia del rene policistico 1)livelli (Fig.3a).In particolare, la linea transgenica39(n=4) ha mostrato una PKD1 più alta (malattia del rene policistico 1) livelli rispetto alle righe 3 (n=3) e 41(n=4). Inoltre, PKD1 (malattia del rene policistico 1) livelli di espressione misurati mediante analisi Northern blot correlati a quelli ottenuti mediante PCR in tempo reale utilizzando primer negli esoni 1 e 2 (Fig. 3b).

FIG.3.Analisi dell'espressione renale di topi SBPkdlrA. (a) Analisi dell'espressione dei trascritti del transgene (Tg) Pkd1 endogeno (endo) e SBPkdlrA nei reni da tre linee transgeniche mediante Northern blotting. Due campioni di ciascuna linea transgenica, 3, 39 e 41 sono stati confrontati con il trascritto renale endogeno Pkdl di topi normali di controllo della stessa età dello stesso background genetico (C5BI 6I × CBA/DE, campioni di RNA renale sono stati ottenuti da topi transgenici prima di malattia renale allo stadio terminale. I trascritti di endo e Tg sono entrambi lunghi -14.2 kb. È stata osservata una sovraespressione sistematica dei trascritti nei reni di tutti i topi transgenici rispetto ai controlli non transgenici. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno per il caricamento. La quantificazione dell'espressione renale in questi topi transgenici variava da 2- a 15- volte rispetto ai livelli endogeni di Pkd1 da topi di controllo impostati arbitrariamente a 1. (b) La rappresentazione schematica del transgene SBPkdl-. e i primer erano utilizzato per amplificare il Pkdl totale inclusi endogeni e transgene (esone 1 ed esone 2) e solo il transgene Pkd1 (B. esone 2) mediante PCR in tempo reale e RT-PCR semiquantitativa, l'analisi RT-PCR dell'espressione del transgene SBPkdlAc è stata quantificata nel rene ed extra tessuti renali. Viene mostrata una valutazione semiquantitativa rappresentativa del transgene SBPkdl.Ac (Tg) che include un campione di tessuto renale (K) da un topo di tutte e tre le linee transgeniche (3. 39 e 41) e di tessuti extrarenali. H, cuore; Lu, polmone; B. cervello; Li, fegato; e S. milza da un topo della linea 39. L'espressione del transgene è facilmente rilevabile nei reni di tutti i topi transgenici, mentre è da bassa a non rilevabile nei tessuti extrarenali. L'espressione del transgene SBPkd1rAc ha prodotto un amplicone 307-bp specifico, mentre il controllo interno S16 ha generato un amplicone 102-bp. M,{30}}indicatore bp; H, O, controllo negativo per l'amplificazione PCR. (c) Analisi dell'espressione PCR in tempo reale di SBPkdlr. Il transgene è stato determinato da diversi topi indipendenti. Il transgene SBPkdl.Ac delle tre linee di topo transgenico 3 (n=5), 39(n =7) e 41 (n=5) ha mostrato che le linee 39 e 41 avevano il valore più alto livelli di espressione renale. L'espressione del transgene SBPkdlrAc nei tessuti extrarenali di topi (n=3) delle tre linee transgeniche è stata valutata mediante PCR in tempo reale. Rispetto ai reni di ciascuna linea transgenica (100 percento), l'analisi dei tessuti extrarenali ha mostrato che i livelli di espressione del transgene erano costantemente inferiori da 10- a 1,000- volte nel cervello, nel cuore, nel fegato, nel pancreas , milza e polmone. (d) Espressione del gene c-mc endogeno nei reni SBPkdl.Ac mediante RT-PCR semiquantitativa. Un'illustrazione schematica mostra i primer utilizzati per amplificare c-Myc. Come previsto, l'espressione di c-Myc è minima nei reni adulti non transgenici (controlli). Al contrario, un'aumentata espressione di c-Mye viene rilevata in tutti i reni SBPkdlrAc adulti delle tre linee, come osservato nei reni SBM transgenici adulti usati come controllo positivo. L'amplicone di c-Myc era di 250 bp; l'amplicone di S16, un controllo interno, era un marker di 102 bp.M,{55}}bp.

La quantificazione dei livelli di espressione del transgene in particolare è stata effettuata mediante PCR in tempo reale e RT-PCR semiquantitativa nelle tre linee transgeniche in età adulta utilizzando primer nella regione 5' non tradotta (B, promotore della globina) e nell'esone 2 di PKD1 (malattia del rene policistico 1)(Fig.3b). Il SBPKD1 (malattia del rene policistico 1) L'espressione di RAC nei topi transgenici è stata confrontata con il prodotto del gene della proteina ribosomiale S16 come standard interno. Le condizioni utilizzate per l'amplificazione semiquantitativa RT-PCR rientravano nell'intervallo lineare. L'espressione del transgene mediante PCR in tempo reale e RT-PCR semiquantitativa ha mostrato in modo coerente e specifico l'espressione più alta nel rene di tutte le linee transgeniche rispetto ad altri organi (Fig. 3b e c). I livelli di espressione renale per un singolo campione erano riproducibili con qualsiasi tecnica di rilevamento utilizzata. I livelli più alti di PKD1 (malattia del rene policistico 1) è stata misurata l'espressione renale del transgene per le linee 39 e 41. Per monitorare se l'aumento dell'espressione della PKD1 (malattia del rene policistico 1) risultasse dal gene transgene o endogeno, lo stesso gruppo di topi delle tre linee transgeniche è stato confrontato per la PKD1 renale ( malattia del rene policistico 1) espressione del transgene e per la PKD1 renale (malattia del rene policistico 1) espressione totale (transgene ed endogena) mediante PCR in tempo reale. Interessante. le righe 39 e 41 relative alla riga 3 hanno mostrato che l'aumento della PKD1 (malattia del rene policistico 1)l'espressione renale del transgene era simile o superiore a quella dell'espressione renale totale di PKD1 (malattia del rene policistico 1), indicando il transgene come specificamente responsabile di questa espressione indotta. In vari organi (inclusi cuore, polmone, cervello, fegato, pancreas e milza), il SBPKD1 (malattia del rene policistico 1) RAC; il transgene ha mostrato un'espressione molto debole rilevata occasionalmente nella milza e nel polmone, con un'espressione da piccola a non rilevabile in altri organi (Fig. 3b). La quantificazione mediante PCR in tempo reale ha dimostrato un livello da 10-a 1,{5}} volte inferiore dell'espressione del transgene nei tessuti extrarenali rispetto all'espressione renale (Fig. 3c). Gli elementi regolatori "SB" del transgene SBPkdlrAc conferiscono un'espressione renale preferenziale; questa particolare distribuzione dell'organo è stata determinata anche quando utilizzata nei transgeni legati a c-Myc (SBM) e c-fos (SBF)(36, 38). c-Mye, un effettore a valle di PKD1 (malattia del rene policistico 1) vie di segnalazione in SBPkdlrAc: topi. Per ottenere informazioni sul meccanismo patogenetico intracellulare dei topi transgenici SBPkdlrAc, abbiamo quindi cercato di monitorare il livello di espressione renale di c-Myc sulla base della nostra precedente osservazione della deregolazione di c-Myc nei reni umani ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante) (22). L'analisi dei reni è stata eseguita da tutte e tre le linee transgeniche 3(n=4).39(n=7) e 41 (n =4) ​​così come dai controlli (n {{9 }}). Come mostrato in Fig.3d, esiste un'espressione sostanziale di c-Mye endogeno indotto nei topi SBPkdlrAa rispetto ai topi di controllo di età simile. È interessante notare che il livello di espressione di c-Myc in alcuni reni SBPkdlrAG, in particolare la linea 39, ha raggiunto livelli paragonabili a quelli osservati nel modello murino transgenico PKD SBM prodotto dall'espressione renale di c-Myc.

Anomalie renali in SBPKD1 (malattia del rene policistico 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 per ciascuna linea) ha sviluppato più cisti tubulari (T) e glomerulari (G) (Fig. 4d, f e g). Sono state osservate cisti nei tubuli delle regioni corticale e midollare, nonché nei tubuli di raccolta dalla papilla (Fig. 4d ed e). I topi transgenici hanno mostrato iperplasia epiteliale tubulare (punta di freccia) che coinvolge sia i tubuli cistici che quelli non cistici e l'ipertrofia frequente (Fig. 4g e h). ma la gravità variava tra i singoli topi. Fibrosi interstiziale (F). Sono stati frequentemente osservati infiltrati linfoidi perivascolari e calchi proteici (P) (Fig. 4d ed e)

Fig. 4

Per definire più precisamente il sito di localizzazione dell'aumento della PKD1 (malattia del rene policistico 1)espressione nei reni, abbiamo effettuato l'ibridazione in situ utilizzando la sonda esone 36-45 precedentemente utilizzata(16). Il segnale di ibridazione è stato localizzato specificamente alle cellule epiteliali che rivestono la cisti e i tubuli iperplastici, nonché le cisti glomerulari. Inoltre, alcuni segnali sono stati osservati sull'epitelio dei tubuli non cistici o leggermente dilatati, identificando probabilmente i tubuli predestinati a subire futuri cambiamenti cistici (Fig. 4i e j). L'analisi istologica renale è stata effettuata anche su topi transgenici alla nascita (n=8), giorno postnatale 10(P10)(n=3),P20(n=5),P35(n{ {10}}) e P45(n= 3) rispetto ai coetanei negativi della stessa fascia di età (da n =2 a 4). È interessante notare che tutti i topi transgenici neonati hanno mostrato dilatazione tubulare e glomerulare rispetto a controllare i compagni di cucciolata negativi (Fig. 4k e 1), indicando che le anomalie renali sono iniziate in utero come osservato nei topi SBM e nell'ADPKD (malattia del rene policistico autosomica dominante) pazienti. La dilatazione tubulare e glomerulare aumentava di dimensioni e numero con l'avanzare dell'età. Con P35, i topi transgenici mostravano iperplasia più grave e evidenza di glomerulosclerosi Funzioni fisiologiche renali alterate nei topi SBPkdlrsc. Le funzioni fisiologiche renali di tutti i topi transgenici hanno mostrato caratteristiche simili alla PKD, mentre i compagni non transgenici non hanno mai sviluppato la malattia. Entro pochi mesi dalla nascita, gli animali colpiti hanno sviluppato un'insufficienza renale cronica. Questi animali sono stati monitorati per i parametri funzionali renali mediante misurazione dei livelli sierici e urinari. azoto ureico (BUN) e creatinina, osmolalità urinaria, proteine ​​urinarie ed escrezione di ioni (Tabella 1). Tutti i topi delle tre linee rispetto ai controlli hanno mostrato difetti di concentrazione, un risultato comune nell'ADPKD (malattia del rene policistico autosomica dominante). e di conseguenza ha mostrato una diminuzione del BUN urinario. concentrazioni di creatinina, proteine ​​e ferro. SBPKD1 transgenico (malattia del rene policistico 1)rAc.fondatori e progenie (n=6) di ciascuna linea sono stati monitorati qualitativamente per la proteinuria sui campioni di urina mediante SDS-PAGE (Fig. 5). I topi di età superiore a 2 mesi mostravano proteinuria non selettiva che progrediva con l'età. Inoltre, i livelli sierici di BUN e creatinina sierica sono stati aumentati, rivelando insufficienza renale (Tabella 2). Poiché l'insufficienza renale cronica porta comunemente ad alterazioni dei parametri ematologici, questi sono stati esaminati in topi transgenici SBPkdlAc di età compresa tra 3 e 14 mesi (Tabella 2). Questi topi transgenici erano anemici, come evidenziato dalla conta dei globuli rossi significativamente ridotta, con emoglobina ed ematocrito che raggiungevano la metà dei livelli normali. Altri parametri dei globuli rossi, come la percentuale di reticolociti, non sono stati influenzati, come previsto quando indotti da un difetto renale. Questi animali sono costantemente morti per insufficienza renale a -5.9± 2,8 mesi di età (n {{12} }) per la linea transgenica 39 e ad età successive,-14.6± 3,1 mesi (n= 20)e-11.7 ±6,5 mesi (n=7) ,rispettivamente per le righe 3 e 41.

EFFETTI DELLA CISTANCHE: CURA DELLE MALATTIE RENALI

DISCUSSIONE

Qui riportiamo l'isolamento e la caratterizzazione di un PKD1 murino (malattia del rene policistico 1)-BAC. Questo PKD1 (malattia del rene policistico 1) è stato contrassegnato il gene e gli elementi regolatori sono stati sostituiti per indirizzare l'espressione specificamente ai reni da due eventi di ricombinazione omologhi successivi. I topi transgenici prodotti con questo nuovo gene SBPkdlrAG hanno mostrato un aumento da 2-a 15- volte nell'espressione di PKD1 (malattia del rene policistico 1) e hanno sviluppato in modo riproducibile alterazioni morfologiche renali precoci tipiche della PKD. L'insufficienza renale è evidente nella mezza età e i topi muoiono prematuramente per insufficienza renale. I nostri risultati indicano anche che il meccanismo di sovraespressione della PKD1 (malattia del rene policistico 1) responsabile di questo fenotipo è mediato dalla segnalazione dell'attivazione di c-Myc in vivo. Questo studio dimostra che l'aumento di funzionalità dei reni PKD1 murino (malattia del rene policistico 1) è sufficiente per produrre un fenotipo renale PKD.

Poiché la PKD1 murina (malattia del rene policistico 1) il gene non è duplicato come nell'uomo (27), abbiamo identificato e isolato direttamente un clone BAC che conteneva l'intera PKD1 (malattia del rene policistico 1) gene. Caratterizzazione completa della PKD1 murina 129/Sv (malattia del rene policistico 1)-BAC. il confronto indiretto con altri due ceppi di topi consanguinei ha confermato l'integrità del locus PKD1 (malattia del rene policistico 1). Il PKD1 (malattia del rene policistico 1)-BACinsert conteneva da-37 a 39 kb di sequenze a monte ea valle del gene PKD1 (malattia del rene policistico 1). La nostra analisi ha dimostrato che la PKD1 (malattia del rene policistico 1) in questo BAC era un locus murino di tipo selvaggio in buona fede che potrebbe servire per ulteriori studi.

Sebbene ci sia una forte evidenza che la formazione di cisti nell'ADPKD (malattia del rene policistico autosomica dominante) può derivare dalla perdita di eterozigosi in seguito all'inattivazione somatica della normale PKD1 (malattia del rene policistico 1) allele(3.21.32), vi sono anche prove suggestive di un'espressione di policistina-1 prolungata o addirittura aumentata nell'epitelio tubulare cistico (22.29). Quest'ultima osservazione solleva la questione se la sovraespressione della PKD1 (malattia del rene policistico 1) sia di per sé una causa prossima sufficiente di cistogenesi. Nei topi transgenici portatori della PKD1 umana (malattia del rene policistico 1), TSC2. RAB26. Geni NTHL1 e SLC9A3R2, solo una minoranza di topi ha sviluppato cisti e nessuno ha avuto un'espressione del transgene rilevabile nell'età adulta nonostante 30 copie del transgene (31). In quei topi transgenici. era difficile stabilire un ruolo chiaro per la sovraespressione di PKD1 (malattia del rene policistico 1) nella cistogenesi. Il nostro modello differisce, poiché da due a nove copie wild-type di PKD1 (malattia del rene policistico 1) da sole, senza geni contigui, sono state integrate nei topi transgenici. Poiché il gene PKD1 (malattia del rene policistico 1) ha funzioni essenziali in vari organi o tessuti, come descritto per numerosi topi con ablazione del gene PKD1 (malattia del rene policistico 1), una sovraespressione sistemica di PKD1 (malattia del rene policistico 1) potrebbe portare a ulteriori effetti confondenti. Di conseguenza, abbiamo affrontato il ruolo della PKD1 (malattia del rene policistico 1)guadagno di funzione utilizzando un approccio che prende di mira la PKD1 (malattia del rene policistico 1) specificamente ai reni. Per ricombinazione omologa, abbiamo prima sostituito la regione regolatoria a monte della PKD1 (malattia del rene policistico 1) con gli elementi regolatori ristretti renali "SB", prevenendo così la ridotta espressione genica normalmente osservata per PKD1 (malattia del rene policistico 1) nell'età adulta e potenziale regolazione del circuito di feedback secondario(36,38). In secondo luogo, abbiamo contrassegnato la PKD1 murina (malattia del rene policistico 1) transgene (Pkdlr) con una mutazione puntiforme silente nell'esone 10 ma non ha inserito un tag epitopo per garantire che sarebbe stata prodotta una proteina "wild-type" completamente funzionale con struttura e integrità conservate. Da questo BAC modificato, un frammento SBPkdlrAG è stato purificato dal gene Tsc2 e dal vettore BAC per prevenire l'interferenza del gene Tsc2, che può anche indurre un fenotipo cistico (8.20.28). nonché per evitare l'effetto inibitorio delle sequenze procariotiche(5).

Sono stati prodotti quattro diversi topi fondatori SBPkdlrActransgenici e tre linee indipendenti con PKD1 renale specifica (malattia del rene policistico 1)-espressione migliorata. Particolarmente sorprendente è la completa penetranza del fenotipo in questi topi transgenici. Il SBPKD1 (malattia del rene policistico 1) Il fondatore di rAc e le linee murine condividevano diverse caratteristiche fisiopatologiche in comune con l'ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante). Questi includono lo sviluppo di cisti nella corteccia, nel midollo e nei glomeruli insieme a iperplasia epiteliale, fibrosi interstiziale e infiammazione interstiziale focale.

Poiché il fenotipo PKD è stato costantemente osservato in tutti i diversi topi fondatori transgenici e l'integrazione del transgene nel genoma del topo è un fenomeno casuale, il fenotipo non può derivare dall'effetto della posizione cromosomica ma solo dall'aumento della PKD1 (malattia del rene policistico 1)espressione. In effetti, è stato dimostrato che l'espressione del transgene PKD1 (malattia del rene policistico 1) in tutte le linee è limitata dal rene. come già osservato per altri transgeni regolati dagli elementi "SB" (36,38). Inoltre, questa maggiore espressione di PKD1 (malattia del rene policistico 1) è stata causata dal transgene e non da una PKD1 endogena indiretta (malattia del rene policistico 1) Attivazione. Quindi, i nostri risultati forniscono una chiara evidenza che il guadagno di funzione di una PKD1 funzionale wild-type (malattia del rene policistico 1) può produrre più cisti renali. È importante sottolineare che queste pratiche di SBPKD1 (malattia del rene policistico 1) costituiscono il primo modello murino generato dalla sola sovraespressione dell'ortologo murino della PKD1 umana (malattia del rene policistico 1) gene.

I topi SBPkdl-Ac dimostrano che PKD1 (malattia del rene policistico 1)la sovraespressione è un meccanismo patogenetico primario della cistogenesi renale. È importante sottolineare che i livelli più alti di espressione del transgene nei reni sembravano essere correlati alla progressione e alla gravità del fenotipo. Abbiamo anche scoperto che la sovraespressione di PKD1 (malattia del rene policistico 1) nello sviluppo di SBPKD1 (malattia del rene policistico 1È probabile che il fenotipo )-Ac segnali l'attivazione di c-Myc in vivo. In teoria, questa attivazione potrebbe anche essere diretta attraverso la coda della policistina-1 C-terminale in fase di scissione proteolitica e traslocazione nucleare (7), poiché è stato dimostrato che una maggiore espressione renale di c-Myc nei topi adulti induce PKD, sarebbe altamente coerente supportare c-Myc come uno dei principali effettori a valle di PKD1 (malattia del rene policistico 1) vie di segnalazione Questo risultato era anche correlato ai nostri precedenti risultati sull'aumento dell'espressione di c-Myc nei reni di tutta l'ADPKD umana (malattia del rene policistico autosomico dominante) analizzata (22). Complessivamente, questi risultati indicano che c-Mye è un mediatore principale di PKD1 (malattia del rene policistico 1)cistogenesi.

I nostri risultati dal PKD1 (malattia del rene policistico 1)il modello di guadagno di funzione, insieme all'aploinsufficienza murina di PKD1 (malattia del rene policistico 1) e alla perdita di funzione, indicano che qualsiasi PKD1 (malattia del rene policistico 1) la disregolazione potrebbe portare alla cistogenesi (2.19.23-26.31.40). Squilibrio grave di PKD1 (malattia del rene policistico 1) nei topi indotto da PKD1 (malattia del rene policistico 1) l'ablazione o la sovraespressione transgenica ha causato l'insorgenza precoce e la rapida progressione delle cisti renali e ha colpito un'elevata percentuale di tubuli. Al contrario, una PKD1 più lieve (malattia del rene policistico 1) uno squilibrio come l'aploinsufficienza ha portato a una progressione più lenta della PKD con cisti più focali. L'apparente sviluppo paradossale di un fenotipo simile per mezzo della disregolazione della policistina{0}} opposta potrebbe essere spiegato dal risultato comune, vale a dire uno squilibrio della concentrazione proteica relativa che potrebbe alterare la formazione o la funzione di un complesso multiproteico policistinico attivo. Presi insieme, i nostri risultati e quelli di altri ricercatori sostengono che il meccanismo di formazione di cisti nell'ADPKD (malattia del rene policistico autosomica dominante) è probabile che derivi da tre meccanismi patogenetici: guadagno di funzione, perdita di funzione ed effetti del dosaggio genico.

Il romanzo SBPkdlrAc; i topi costituiscono un potente modello di cistogenesi renale in grado di fornire importanti approfondimenti sulla fisiopatologia della PKD, PKD1 (malattia del rene policistico 1) vie di trasduzione del segnale e partner interagenti. Lo studio di questo modello può anche portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per ripristinare il normale equilibrio proteico all'interno della PKD1 (malattia del rene policistico 1) complesso multimerico.

Cistanche cura le malattie renali e migliora la funzione renale

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