Isolamento guidato dall'attività di composizioni fenoliche dalla parete di Anneslea Fragrans. E il loro effetto citoprotettivo contro lo stress ossidativo indotto dal perossido di idrogeno nelle cellule HepG2 Parte 1
Mar 25, 2022
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Astratto:Anneslea fragrans Wall., comunemente noto come "Pangpo Tea", è tradizionalmente usato come medicina popolare e tè sano per il trattamento delle malattie del fegato e dell'intestino. Lo scopo di questo studio è stato quello di purificare i polifenoli antiossidanti e citoprotettivi dalle foglie di A.fragrans. Dopo il frazionamento con solventi organici polari e non polari, le frazioni di estratto acquoso di etanolo sono state valutate per il loro contenuto fenolico totale (TPC) e flavonoide (TFC) e le attività antiossidanti (DPPH, ABTS e FRAPassays). La frazione di n-butanolo (BF) ha mostrato il più alto TPC e TFC con la più forte attività antiossidante. La cromatografia bioguidata di BF ha portato alla purificazione di sei flavonoidi (1-6) e un lantanoide benzochinone (7). Le strutture di questi composti sono state determinate con tecniche NMR e MS. Il composto 6 aveva la più forte capacità antiossidante, seguita da 5 e 2. L'effetto protettivo dei composti isolati sullo stress ossidativo indotto dal perossido di idrogeno (H2O2) nelle cellule HepG2 ha rivelato che i composti 5 e 6 hanno mostrato migliori effetti protettivi inibendo le produzioni di ROS, non avendo differenze significative con la vitamina C (p>0,05), mentre 6 ha mostrato la migliore attività anti-apoptosi. I risultati suggeriscono che A.fragrans potrebbe servire come preziosa fonte fitochimica antiossidante per lo sviluppo di alimenti funzionali e prodotti nutraceutici per la salute.
Parole chiavi:Anneslea fragrans; antiossidante; isolamento guidato; stress ossidativo; glicosidi flavonoidi
1. Introduzione
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono prodotte come sottoprodotti attraverso la respirazione ossidativa nei normali processi fisiologici e biochimici [1]. Come radicali liberi endogeni, i ROS svolgono un ruolo importante nella segnalazione cellulare e nel mantenimento della costanza corporea in un intervallo normale [2]. Se il ROS non potesse essere efficacemente eliminato, un ROS eccessivo potrebbe portare al verificarsi di stress ossidativo, che può influenzare la proliferazione cellulare e l'apoptosi [3]. Lo stress ossidativo è strettamente correlato a una varietà di malattie tra cui diabete, iperlipemia, obesità, cancro e malattie cardiovascolari e neurodegenerative [4]. Recentemente, molti studi hanno evidenziato che una dieta arricchita con antiossidanti possiede una serie di effetti benefici dovuti alla loro capacità di scavenging su ROS eccessivi [5,6].
Gli antiossidanti naturali contengono una varietà di molecole come polifenoli [], carotenoidi [8], vitamine [9], composti contenenti azoto [10] e cumarine [9]. I polifenoli sono ampiamente distribuiti in tutto il regno vegetale e promuovono benefici per la salute grazie alle loro proprietà antiossidanti [11]. Molti di loro, come il resveratrolo e alcuni derivati [12], antocianidine [13, isoflavoni [14l, catechina [15l e quercetina [16] sono ben noti per il loro effetto protettivo scavenging ROS [1]. Negli ultimi anni, i polifenoli hanno attirato l'attenzione nella prevenzione del cancro[17], della disfunzione cardiovascolare[18], delle malattie neurodegenerative [19] e dell'invecchiamento [20]. Pertanto, la ricerca di antiossidanti efficaci è un bisogno urgente per promuovere la salute umana.
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Anneslea fragrans Muro. è una pianta sempreverde, che è distribuita principalmente nel sud della Cina [21]. Oltre al suo scopo ornamentale, le foglie di A.fragrans sono anche usate come medicina popolare per trattare la febbre, la protezione del fegato, rinvigorendo lo stomaco e l'intestino Cina e Cambogia [22], che era stato registrato in "Yunnan Simao Chinese Herbal Medicine". Inoltre, le foglie sono state anche lavorate come bevanda al tè, che è conosciuta come "Pangpo Tea". In precedenti rapporti [23], l'estratto di A.fragrans ha mostrato attività antiossidanti e antimalariche. Tuttavia, ad oggi, i suoi composti fenolici antiossidanti delle fragranze A. non sono stati segnalati.
Pertanto, lo scopo di questa ricerca era quello di isolare e identificare i composti antiossidanti delle foglie di A. fragrans che sono responsabili del loro uso tradizionale per il trattamento delle malattie del fegato. Le quattro frazioni, frazione diclorometano (DF), frazione di acetato di etile (EAF), frazione n-butanolo (BF) e frazione acqua residua (RWF) dell'estratto acquoso di etanolo sono state valutate per il loro contenuto totale fenolico (TPC) e totale di flavonoidi (TFC) e per la loro capacità antiossidante. La frazione n-butanolo (BF) aveva il più alto TPC e TFC con la più forte attività antiossidante. Il frazionamento bioguidato di BF ha permesso la purificazione dei composti. Inoltre, l'effetto citoprotettivo dei composti isolati è stato eseguito sullo stress ossidativo indotto dal perossido di idrogeno (H, O),) nelle cellule HepG2 del cancro del fegato umano. La produzione intracellulare di ROS e l'apoptosi cellulare sono state determinate utilizzando la citometria a flusso. Pertanto, questa ricerca ha offerto un prezioso ingrediente fitochimico antiossidante per lo sviluppo e l'utilizzo delle foglie di A.fragrans come integratore funzionale (tè sano) nell'industria alimentare e sanitaria.
2. Risultati e discussione
2.1.Efficienza di rendimento di frazioni e sottofrazioni
La ripartizione liquido-liquido mediante solventi organici e il frazionamento della colonna sono tecniche importanti per arricchire i composti bioattivi dell'estratto grezzo [24]. Utilizzando il partizionamento liquido-liquido, l'estratto di etanolo (CE) dalle foglie di A. fragrans è stato successivamente frazionato con diclorometano, acetato di etile e n-butanolo per dare rispettivamente quattro frazioni (DF, EAF, BF e RWF). Le percentuali di resa delle frazioni sono risultate variare dall'11 al 27%. La frazione idrica residua (RWF, 27%) aveva la resa più elevata e le rese delle altre frazioni erano nell'ordine seguente: frazione n-butanolo (BF, 24%), frazione acetato di etile (EAF, 21%), frazione diclorometano (DF, 11%).
La percentuale di resa delle sottofrazioni (da BF-A a E) è risultata variare dal 3,82 al 48,4%. Il BF-E ha presentato il rendimento più alto del 48,4%, seguito dal BF-D (24,96%), che ha rendimenti significativamente più elevati rispetto alle altre frazioni.
2.2.Analisi HPLC
Il rilevamento della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) ha dimostrato di essere una tecnica potente per la determinazione quantitativa. L'analisi HPLC ha rivelato che BF aveva il maggior numero di composti con la più forte attività antiossidante. Sotto la guida di saggi antiossidanti e analisi HPLC, la frazione antiossidante è stata ulteriormente cromatografata per l'isolamento delle sottofrazioni. Il BF è stato sottoposto a una colonna di resina idrata D101 per produrre cinque sottofrazioni (da BF-A a E). L'analisi HPLC ha rivelato che BF-Cto E aveva i composti più antiossidanti. Il frazionamento bioguidato di queste frazioni (da BF-C a E) ha permesso la purificazione di sette composti puri.
Come mostrato nella Figura 1, il BF e sette composti puri sono stati profilati mediante analisi HPLC. Sulla base del confronto con i tempi di ritenzione e le curve di assorbimento UV, questi sette composti sono stati confermati attraverso tempi di ritenzione a 7,51 min (corrosivo, 7), 7,92 min((epi)-catechina, 6), 9,38 min (confusoside, 1), 9,57 min((S)-naringenin-7-O-β-D-glucopiranoside, 4), 10,32 min(vaccinii folin, 2), 12,64 min (2',3,4,4'-tetraidrossidi diidrocalcone, 5) e 13,95 min (1-[4-(β-D-glucopiranosilossi)-2-idrossifenil]-3-(4-idrossi-3-metossifenil)-1-propanone, 3)(Figura 1A). Tra questi, i composti 1-6 appartengono ai flavonoidi e il composto 7 è il benzochinoletanoide.
2.3.Contenuto fenolico totale (TPC) e contenuto totale di flavonoidi (TFC)
Le foglie di A.fragrans sono tradizionalmente utilizzate come tè per la salute trasformato e hanno dimostrato di essere una buona risorsa di fenoli e flavonoidi [25]. Secondo i saggi spettrofotometrici, il TPC e il TFC sono stati testati in diverse frazioni e sottofrazioni dalle foglie di A. fragrans. Come mostrato nella Tabella 1, il BF aveva il più alto valore TPC con 238,12±12,05 mg di estratto GAE/g seguito da EAF. Il DF ha mostrato il valore TPC più basso come 66,52±0,57 mg di estratto GAE / g. Allo stesso modo, le più alte concentrazioni di TFC sono state trovate anche in BF con tfCvalue di 165,19±5,21 mg DI RE /estratto. Per quanto riguarda l'RWF e l'EAF (rispettivamente 66,92±1,38 e 116,12±2,89 mg GAE/estratto), avevano anche concentrazioni di TFC inferiori rispetto al BF (165,19±5,21 mg di estratto DI RE/g), mentre il DF aveva la concentrazione di TFC più bassa di 47,94±2,84 mg di estratto DI RE/g. I contenuti di TPC e TFCin BF erano circa quattro volte superiori a quelli di DF.
I dati hanno rappresentato la presenza del più alto TPC e TFC in BF-E con valori come 262.03±1.72mg GAE/g estratto; 180,52± 6,30 mg di estratto di RE/g, rispettivamente, seguiti rispettivamente da BF-D (219,84±4,01 e 157,01±2,50 mg di estratto di RE/g), BF-C (210,69±6,31 e 151,01±4,33 mg di estratto di RE/g), mentre BF-B e BF-A avevano i valori più bassi di TPC e TFC (Tabella 1).
2.4.Attività antiossidante
La maggior parte dei polifenoli, in particolare flavonoidi e acidi fenolici, sono sfruttati in alimenti antiossidanti popolari (nutraceutici) e presentano una serie di benefici per l'uomo [17]. Nel nostro studio precedente, le foglie di A.fragrans hanno dimostrato di essere una buona risorsa di polifenoli[26]. Tuttavia, l'attività antiossidante dell'estratto delle foglie di A. fragrans e delle sue sostanze fitochimiche non è stata ancora studiata. A causa dei diversi meccanismi di reazione antiossidante, sono stati combinati tre saggi di ABTS, DPPH e FRAP per valutare l'attività antiossidante delle frazioni e delle sottofrazioni delle foglie di A. fragrans.
Tra le frazioni, BF ha mostrato la più potente attività antiossidante nelle attività di ABTS, DPPH e FRAP radical-scavenging con 1808,46±96,52,951,42±87,75 e 1822,96± 29,24 μmol TE / g estratto (Tabella 1) .PDF ha mostrato la più bassa attività antiossidante nei saggi ABTS e FRAP (139,23±8,62 μmol TE / g estratto e 180,05± 9,46 μmol TE / g estratto, rispettivamente) (Tabella 1). Mentre le attività di scavenging radicale di quattro frazioni (DF, EAE, BF e RWF) nel test dpPH radical-scavenging sono risultate variare da 613,38± 45,35 a 951,42±87,75 μmol TE / g estratto, rispettivamente, senza differenze significative (p >0,05). Questi risultati hanno suggerito che le sostanze fitochimiche delle foglie di A. fragrans potrebbero essere insensibili al DPPH. Per ottenere ulteriormente i metaboliti attivi, BF è stato selezionato per un ulteriore frazionamento. Il BF è stato sottoposto a cromatografia macroporosa adsorbente della colonna di resina D101 eluita da un gradiente del sistema metanolo-acquoso per produrre cinque sottofrazioni (da BF-A a E). Quindi, l'attività di scavenging radicale ABTS di queste sottofrazioni può essere classificata come BF-E> BF-C>BF-D. L'attività riducente nel test FRAP ha rivelato che BF-Dhad la più forte attività antiossidante, che è stata seguita da BF-C e BF-E.It è interessante notare che tre sottofrazioni (bf-C a E) presentavano un'attività antiossidante più elevata rispetto alla frazione madre (BF). Nel loro insieme, BF-C a E è stato sottoposto a cromatografia su colonna per isolare e identificare i fitochimici antiossidanti.
2.5. Attività antiossidante dei composti isolati
Tutti i composti isolati (composti 1-7) sono stati valutati per la capacità antiossidante da ABTS, dpPH radical scavenging attività, e FRAP attività antiossidante. Tutti i dati sono descritti nella Tabella 2. I composti 6 e 2 hanno mostrato la più alta attività antiossidante, seguita da 5. Il composto 4 ha mostrato una moderata attività antiossidante e i composti 1, 3 e 7 sono stati considerati inattivi con attività di scavenging radicale ABTS e DPPH inferiori a 200 μmol di estratto di TE / g. Usando Vc (le attività di scavenging radicale con 2932,91 ±93,63 e 1873,56±121,68 umol TE / g estratto, rispettivamente) come controllo positivo, compound6 ha avuto la più forte attività antiossidante nei saggi di scavenging radicale ABTS e DPPH con 1580.37±89.32 e 1953.31±109.93 μmol TE / g estratto (p<0.05）， respectively.="" furthermore,="" compound="" 6="" had="" the="" best="" antioxidant="" capacity="" in="" the="" frap="" assay="" as="" 5027.43±620.75="" μmol="" te/extract，="" which="" was="" much="" higher="" than="" that="" of="" vc="" as="" 3291.28±241.02="" μmol="" te/extract.="" moreover，="" the="" compound="" 2and6showed="" a="" significant="" antioxidant="" activity,="" which="" was="" equivalent="" to="" a="" positive="" control="">
Inoltre, la relazione struttura-attività antiossidante dei flavonoidi (1-6) è discussa da vari gradi di effetti inibitori. Il composto 2 ha presentato più attività an-tiossidante rispetto ai composti 1, 3 e 5, il che ha suggerito che i gruppi 3,4-diidrossi nei diidrocalconi in 2 possono svolgere un ruolo critico contro ABTS, attività di scavenging dei radicali DPPH e attività antiossidante FRAP, e la porzione di glucosio sostituita a C-4'in 2 può svolgere un ruolo importante sulla sua capacità antiossidante [4]. Inoltre, il composto 6 ha mostrato la più alta attività antiossidante rispetto ad altri composti, il che ha suggerito che i flavan-3-oli (catechina) probabilmente mostrano una migliore attività di scavenging radicale rispetto ai diidrocalconi e ai flavanoni [27]. In sintesi, i composti 2, 5 e 6 con una buona attività antiossidante sono stati ulteriormente selezionati per gli effetti citoprotettivi contro lo stress ossidativo da H2O2 nel prossimo studio.
2.6. Relazione tra attività antiossidante e contenuto di TPC/TFC
Concentrazioni di TPC e TFC altamente correlate con l'attività antiossidante dai valori di FRAP (r = 0,982 e 0,977) e ABTS (r = 0,959 e 0,965), rispettivamente. La matrice di correlazione ha anche mostrato una forte correlazione tra i valori ABTS e FRAP (r = 0,992). Inoltre, è stata effettuata un'analisi multivariata (PCA), estratta dai dati della Tabella 1. Come mostrato nella Figura 2, PCA ha spiegato il 94,44% della variazione totale, in cui PC1 rappresentava l'84,73% della varianza e PC2 rappresentava il 9,71%. I saggi FRAP, ABTS e DPPH con EAF e RWF sono posizionati nei quadranti in alto a destra e le concentrazioni di TPC e TFC con BF e BF-Cto E si trovano rispettivamente nei quadranti in basso a destra nei punteggi positivi PC1. Nel frattempo, il DF e BF-A a B con basse concentrazioni di TPC e TFC si trovano lungo l'asse dei punteggi negativi PC1. Questi risultati hanno mostrato che le concentrazioni TPC e / o TFC sono strettamente associate alla capacità antiossidante e maggiori sono le concentrazioni di TFC TPCor nelle frazioni e nelle sottofrazioni, maggiori sono i loro valori di capacità antiossidante. Questi risultati hanno rivelato che l'alto contenuto fenolico e flavonoide in diverse frazioni e sottofrazioni delle foglie di A. fragrans potrebbe contribuire all'attività antiossidante.
Figura 2. Analisi PCA su fenoli totali, flavonoidi e attività antiossidante. I mezzi con lettere diverse indicano differenze significative (p<0.05).df, eaf,="" bf,="" rwf="" mean="" dichloromethane="" fraction,="" ethyl="" acetate="" fraction,="" n-butanol="" fraction,="" and="" residual="" water="" fraction.="" bf-a="" to="" e="" means="" bf="" was="" subjected="" to="" d101="" column="" chromatography="" to="" yield="" five="">
Questo articolo è estratto da Molecole 2021, 26, 3690. https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules