Caratterizzazione strutturale e valutazione delle attività antinfiammatorie e antitirosinasi dei polifenoli da melastoma normale Parte 2

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Il composto 3 aveva la stessa formula molecolare del composto 2, come determinato dai suoi dati HRESIMS. Il confronto tra i dati NMR di 3 e 2 (Tabella 2) ha rivelato che il gruppo metossile a galloil-C-4 in 2 si è spostato a galloil-C-3' in 3. Ciò è stato confermato dalle correlazioni HMBC (Figura 2) dei protoni metossilici (8y 3.88) e del protone aromatico (bH7.24) con galloil-C-3'(6c 149.1) in 3 e spostamenti chimici del gruppo metossile, galloil-C{ {24}}, galloil-C-4 e galloil-C-3' che si sono spostati rispettivamente da bc60,8,151,5,141,3 e 146,5 in 2tobc56,7,146,6,140,7 e 149,1 in3. Un positivo l'effetto cotone a 237 nm e uno negativo a 262 nm nello spettro CD indicavano la configurazione (S) del gruppo HHDP per 3 [24]. La configurazione della frazione zuccherina è stata dedotta dalla costante di accoppiamento (=8.5 Hz) del protone anomerico della frazione glucosile. L'idrolisi acida di 3 con HC1 1 M ha prodotto D-glucosio, che è stato confermato dalle analisi TLC e GC. Pertanto, il composto 3 è stato identificato come 1-O-galloile-6-O-(3-metossigalloile)-2,3-O-(S)-esaidrossidifenoile{{ 66}}D-glucosio.

La formula molecolare di 4 è stata dedotta dal suo spettro HRESIMS (m/z 783.1032, [MH]-) come C35 H28 O21. Il suo peso molecolare era di 16 unità di massa inferiore a quello di 3, il che può essere attribuito all'assenza di un idrossile e alla presenza di un protone aromatico (6H6.87) a vanilloil-C-5' in 4 (Tabella 2) . Ciò è stato confermato dalla presenza di una frazione aromatica 1,2,4-trisostituita （μ7,60 （dd, J=8.3,1,8 Hz）,6,87 （d, J=8 .3 Hz） e 7.57 （d, J=1.8 Hz）） e il cambiamento di spostamento chimico di galloil-C-5' a δc 145,8 in 3 a vanilloil-C-5 ' a bc 115,9 in 4. Le correlazioni dei protoni metossilici (6H 3,90) e del protone aromatico (H 6,87) con vanilloil-C-3' nello spettro HMBC (Figura 2) hanno ulteriormente confermato il protone aromatico (H 6,87) a vanilloil-C-5'. È stato dimostrato che l'atropisomeria dell'HHDP è una configurazione S dalla comparsa di effetti positivi e negativi sul cotone rispettivamente a 239 nm e 263 nm [24]. Le costanti di accoppiamento del protone anomerico in 4 erano 8,5 Hz che ricordavano la configurazione -anomerica. L'idrolisi acida ha rivelato che 4 aveva le stesse unità di zucchero di 3. Pertanto, il composto 4 è stato identificato come 1-O-galloile-6-O-vanilloile-2,3-O- (S)-esaidrossidifenoil{74}}D-glucosio.

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2.2. Saggi di azione antinfiammatoria

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50uM. È stato riportato che i noti flavonoli kaempferol(7)[26[, quercetin (10)[27l e myricetin{5}}O- -L-rhamnopyranoside(12)28 hanno attività antinfiammatoria, ma il kaempferol -3-rhamnoside (8) [26] e quercetina-3-O- -L-rhamnoside (11)[29] non hanno attività antinfiammatoria. Dai risultati sperimentali e dai dati di letteratura, i flavonoidi nella pianta del titolo hanno una migliore attività antinfiammatoria rispetto agli ellagitannini, potrebbe essere il principio attivo corrispondente all'effetto antinfiammatorio di questa pianta.

2.3. Saggi di attività inibitoria della tirosinasi

Tutti i composti sono stati studiati per la potenziale attività inibitoria della tirosinasi. Come mostrato nella Tabella 3, i nuovi composti 2-4 hanno mostrato attività inibitorie della tirosinasi moderate. Il nuovo composto 1 ha mostrato una debole attività inibitoria della tirosinasi. La quercetina (10)[30] ha una significativa attività inibitoria della tirosinasi e la sua attività antitirosinasi è migliore della quercetina-3-OwL-rhamnoside(11)[26] e del kaempferol (7) [26], che è coerente con i dati della letteratura. Ciò indicava che i gruppi 3'-e 4/-idrossi sull'anello B e i 3-gruppi idrossi sull'anello C nei flavonoli erano cruciali per le loro attività. L'attività anti-tirosinasi del kaempferol (7)[26] è migliore del kaempferol-3-rhamnoside (8)[26] e i composti 8 e 12 [31] non hanno attività anti-tirosinasi significativa, il che supporta ulteriormente quanto sopra relazioni struttura-attività.

3. Sperimentale 3.1.Materiali

Le radici di M.normale sono state raccolte da Yanshan Town, Guilin City, provincia di Guangxi, nel settembre 2018, e autenticate dal professor Yusong Huang (Guangxi Institute of Botany). Un esemplare di voucher (20180912) è stato depositato nel Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization, Guangxi Institute of Botany, Cina.

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3.2. Procedure sperimentali generali

Le rotazioni ottiche sono state misurate con un polarimetro ADP440 più （λ 589 nm, lunghezza del percorso 1.0 cm). Gli spettri NMR sono stati acquisiti su uno spettrometro Bruker Advance 500 (Bruker Biospin AG, Fällanden, Svizzera) e i picchi di solvente residuo sono stati utilizzati come riferimento. Le costanti di accoppiamento e gli spostamenti chimici sono stati forniti rispettivamente in Hz e su una scala δ（ppm）. I dati ESIMS e HIRESIMS sono stati registrati rispettivamente su uno spettrometro di massa BRUKER HCT e uno spettrometro LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Giappone). La GC è stata eseguita su un sistema Agilent 7890ON (Agilent Technologies, Inc. Chandler, AZ, USA) con una colonna Chirasil-Val di 0,32 mm id × 25 mL. L'HPLC analitico è stato eseguito su un sistema Shimadzu LC-2030C HPLC (Shimadzu, Kyoto, Giappone) utilizzando una colonna Agilent Eclipse XDB-C18 (5 um) da 4,6id × 250 mm. L'HPLC semi-preparativo è stato condotto su un sistema HPLC Shimadzu LC-20AT utilizzando una colonna Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) da 20,0id × 250 mm a una velocità di flusso di 4 mL/min. La cromatografia su colonna (CC) è stata eseguita utilizzando Sephadex LH-20 （25-100 μm; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Svezia）, colonna di gel di silice ({32}} mesh, Qingdao Marine Chemical Co. Ltd., Qingdao, Cina), gel MCI CHP 20P(75-150 um; Mitsubishi Chemical Co., Tokyo, Giappone) e colonne Chromatorex ODS (50 um, Merck, Darmstadt, Germania).

3.3. Estrazione e Separazione

Le radici in polvere essiccate all'aria (10 kg) di M. normale sono state estratte con acetone acquoso all'8{{20}} percento (3×7 giorni) a temperatura ambiente e ciascun estratto è stato filtrato. I filtrati sono stati essiccati a pressione ridotta per ottenere un estratto grezzo (0,6 kg). L'estratto è stato sospeso in H2O(1 L) e successivamente partizionato con etere di petrolio (3 × 2 L), EtOAc (3 × 2 L). L'estratto di EtOA (8{{40}}g) è stato diviso in dieci frazioni( Fr.1-10)di gel di silice CC (8 id×20 cm)eluendo con un gradiente di CH2Cl-MeOH(100:0,95:5,90:10,80:20, 70 :30,50:50,0:100,v/v). Fr.4(32 g) è stato caricato su una colonna di gel MCI (6i.d.×20 cm) ed eluito con un gradiente di MeOH-H,O（0∶100-100∶0,v/ø）to permettersi diciotto sottofrazioni （Fr4-1-4-18). }}MeOH (97:{50}}:20, o/v) e Sephadex LH-20 CCeluzione con CH2Cl2-MeOH(1:1,v/o) per ottenere 7(11,3 mg ),8(10,6 mg),9(9,3 mg),10 (20,6 mg),11 (7,6 mg) e 12 (6,2 mg). Fr 6(4,2 g) è stato applicato alla colonna ODS C18 ed eluito con MeOH-H2O (20:{82}}:20) per ottenere 9 sottofrazioni(Fr 6-1-6-9). Ulteriore separazione della sottofrazione Fr 6-4(1,2 g)usando Sephadex LH-20 CC(eluito con MeOH-H2O,10:90-100:0) ha prodotto composti 1(9,6 mg),5( 7,2 mg) e 6(7,3 mg), rispettivamente. I composti 2(tR 130,5 min,5,2mg),3(tR 146,8min,9,6 mg) e 4(tR 177,2min,15,3mg) sono stati ottenuti da Fr7(2,5g) tramite HPLCeluzione semipreparativa con un gradiente di MeOH-H2O( 20:80-40:60, / u, 0-250 min).

3.4.Dati spettroscopici

Whisky tannino C (1): polvere amorfa marrone; [ ]-12.6 gradi (c= 0.16, MeOH);UV （MeOH）λmaxnm （log e）∶203（2.02）,276（1.19）; CD （MeOH）λmax（△e）263（-7.8）,240（10.9）,225(2.9).1Dati NMR a mano 13C, vedere Tabella 1;HRESIMSm/z:[MH]{{24} }.1240(calcolato per C4sH33O27-, 1005.1215). 1-O-(4-metossigalloile)-6-O-galloile-2,3-O-(S)-esaidrossidifenoile{40}}D-glucosio( 2): polvere amorfa marrone polvere amorfa; 【 】5-5.5 gradi （c=0.17, MeOH）; UV（MeOH） 入max nm （log e）∶203 （2.52）,275（2.01）; CD （MeOH）λmax（△8）264（-8.0）,238（30.6）,218（1.3）.'Dati H e 13C-NMR, vedere Tabella 2; HRESIMS m/z:799.0983[MH]-(calcolato per C3sH2O22-, 799.099).

{{0}}O-galloile-6-O-(3-metossigalloile)-2,3-O-(S)-esaidrossidifenolo-6- D-glucosio(3); Polvere amorfa marrone;【 】{12}}.5 gradi （c=0.12, MeOH）; UV（MeOH）入max nm （log e）∶203 （2.40）,273（1.68）; CD （MeOH）λmax（△e）262（-3.1）,237（11.1）,210（{29}}.7）.'Dati Hand13CNMR, vedere Tabella 2;HRESIMS m/z:799.1006 [MH]-(calcolato per C35H2O22-,799.0999). 1-O-galloile-6-O-vanilloile-2,3-O-(S)-esaidrossidifenoile{50}}D-glucosio (4): polvere amorfa marrone; 【 】{53}}.6 gradi （c=0.15, MeOH）; UV（MeOH）λmax nm （log e）∶203 （2.42）,278（1.86）; CD（MeOH）λmax（△e）263（-12.1）,239 （42.5）, 219（0.9）.'Dati H e 13CNMR, vedere Tabella 2; HRESIMS m/z: 783.1032 [MH]- (calcolato per C35H27O21-,783.1050).

3.5. Idrolisi acida di 2-4

Il composto 2 (2 mg) è stato trattato con HC1 1 M (5 mL) a 80 gradi per 4 ore e quindi estratto con etilacetato (3×5 mL). La fase acquosa è stata essiccata sotto un flusso di N2 per generare un residuo neutro che è stato analizzato utilizzando TLC(SiO2) con EtOAc-piridina-EtOH-H, O(7:1:1:2) come sistema solvente. Il valore R del residuo neutro era lo stesso di quello dell'autentico D-glucosio indicando che la componente zuccherina di 2 era glucosio. Il residuo neutro e 5 mg di L-cisteina metil estere cloridrato sono stati disciolti successivamente in 3 mL di piridina anidra e riscaldati a 80 gradi per 1 ora. Dopo rimozione del solvente per evaporazione a pressione ridotta, la miscela di reazione è stata successivamente fatta reagire con 0,6 mL di N-trimetilsililimidazolo a 80 gradi per 1 ora. La miscela di reazione è stata partizionata con n-esano e H, O, quindi lo strato di n-esano è stato analizzato mediante uno strumento GC. Le temperature dell'iniettore e del rivelatore sono state impostate rispettivamente a 250 gradi e 280 gradi. La temperatura iniziale della colonna è stata mantenuta a 160 gradi per 1 minuto, quindi aumentata a 280°C a 5 gradi/minuto e mantenuta per 10 minuti. L'autentico D-glucosio e l'autentico L-glucosio sono stati sililati e analizzati allo stesso modo e i loro tempi di ritenzione erano rispettivamente di 19,09 e 19,25 min. I risultati dell'analisi GC hanno indicato che il componente zucchero di 2 era D-glucosio (t 19,1 min). Le componenti zuccherine di 3 e 4 sono state determinate usando la stessa procedura.

3.6. Attività antinfiammatoria

3.6.1.NO Produzione di celle RAW 264.7 stimolate da LPS

Le cellule RAW 264.7 sono state coltivate in DMEM integrato con il 10% di FBS a 37 gradi in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 per 24 ore. Le cellule in una 24-piastra a pozzetti (5 × 104 cellule/pozzetto) sono state trattate con 200 ng/mL LPS e i composti del test. Dopo 22 ore, i media sono stati raccolti e il livello di nitrito è stato misurato utilizzando il sistema di reagenti Griess (Promega, Madison, WI, USA).

3.6.2. Vitalità cellulare

Il test MTT è stato effettuato per misurare la citotossicità dei campioni di test sulla linea cellulare RAW264.7. Le cellule che erano nella fase di crescita logaritmica sono state seminate in una 96-piastra a pozzetti alla densità di 5 × 10 più -6 × 10* cellule/pozzetto e incubate a 37 gradi con il 5% di CO, per 24 h. Successivamente, le cellule sono state trattate con 100 μL di terreno di coltura a varie concentrazioni di campioni di prova per 24 ore. Il mezzo è stato scartato e a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 ul di terreno privo di FBS contenente MTT (1 mg/mL). Dopo l'incubazione nell'incubatrice per 4 ore, il supernatante è stato scartato e sono stati aggiunti 100 μL di DMSO a ciascun pozzetto per sciogliere il formazano. L'assorbanza è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

3.7. Azione anti-ty/rosinasi

Le attività anti-tirosinasi degli isolati sono state studiate secondo la procedura descritta da Aoki et al. con lievi modifiche [21]. L-DOPA e acido cogico sono stati usati rispettivamente come substrato e controllo positivo. Soluzione di L-DOPA a 5.{5}} mM, tirosinasi dei funghi a 100 U/mL, nonché campioni a diverse concentrazioni sono stati preparati in tampone fosfato (pH6,8) 0,20 μL della soluzione del campione e 10 μL di soluzione di tirosinasi di funghi sono stati miscelati e pre-incubati a 37 gradi per 10 minuti, quindi sono stati aggiunti 40 ul di soluzione di L-DOPA e incubati a 37 gradi per 5 minuti. Il sistema di reazione dell'esperimento di attività anti-tirosinasi è mostrato nella Tabella 4. L'assorbanza è stata misurata a 475 nm utilizzando il lettore di micropiastre multimodale Spark 10M (Tecan Trading AG, Zurigo, Svizzera). Tutti i test sono stati ripetuti tre volte e ogni volta in triplicato. La percentuale di inibizione dell'attività della tirosinasi è stata calcolata utilizzando la seguente formula:

dove T rappresenta l'assorbanza con campione e tirosinasi; Per rappresenta l'assorbanza con un campione ma senza tirosinasi; C rappresenta l'assorbanza con la tirosinasi ma nessun campione; Co rappresenta l'assorbanza senza tirosinasi e campione.

4. Conclusioni

Lo studio ha lo scopo di esplorare più attività antinfiammatorie e inibitorie enzimatiche dei polifenoli dalle radici di M.normale sulla base dei nostri lavori precedenti [20]. Come previsto, dodici polifenoli sono stati ottenuti per la prima volta dall'impianto di piastrelle e il composto 1-4 era il nuovo ellagitannino. Il successo dell'isolamento e dell'identificazione della struttura dell'ellagitannina fornisce materiali per lo screening di farmaci antinfiammatori e inibitori enzimatici e contribuisce anche allo sviluppo e all'utilizzo di M.normale. Gli ellagitannini 1-4 non hanno significative attività inibitorie della tirosinasi e attività antinfiammatorie, il che rende meno probabile che siano un potenziale farmaco antinfiammatorio o un inibitore enzimatico. Fortunatamente, possiedono nuovi effetti, come l'anti-obesità [6,7]. I flavonoidi hanno migliori attività enzimatiche antinfiammatorie e inibitorie rispetto agli ellagitannini nelle radici di M. normale ed è più probabile che siano inibitori antinfiammatori e antienzimatici. Lo studio della relazione struttura-attività è utile per trovare nuovi farmaci antinfiammatori e inibitori enzimatici.

Questo articolo è estratto da Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules