L'esposizione acuta della pelle alla luce ultravioletta innesca un'infiammazione renale mediata dai neutrofili

Noi e altri abbiamo dimostrato che la luce UV induce una rapida infiltrazione di neutrofili nella pelle (6, 7). Sebbene i neutrofili contribuiscano in modo determinante all'infiammazione nei siti di lesione locale, è stato recentemente riconosciuto che i neutrofili possono anche ospitare organi distanti dal sito primario dell'infiammazione (8-10), dove contribuiscono al danno del tessuto polmonare attraverso la produzione di ossigeno reattivo specie (ROS) (11) o attivare il sistema immunitario adattativo nei linfonodi e nel midollo osseo (9, 12). Nel LES, si ritiene che i neutrofili svolgano un ruolo importante nelle malattie sia locali che sistemiche. I neutrofili sono presenti nelle lesioni cutanee dei pazienti con LES (13, 14) e nelrenetessuto di pazienti con LN (15, 16). L'elevata espressione di una firma del gene dei neutrofili è un forte predittore di malattia attiva, inclusi LN e riacutizzazioni cutanee (17, 18). I granulociti proinfiammatori a bassa densità (LDG) sono aumentati in particolare nei pazienti con malattie della pelle (19). Mentre questi risultati implicano i neutrofili nel danno tissutale locale nel LES, se i neutrofili forniscono il legame patogeno tra l'infiammazione della pelle edanno renalenon è compreso.

Per chiarire in che modo l'esposizione della pelle ai raggi UV influisce sulrenee il ruolo svolto dai neutrofili in questi processi, abbiamo valutato i cambiamentirenaleespressione genica di concerto con la migrazione dei neutrofili. Abbiamo scoperto che l'esposizione acuta della pelle alla luce UV stimola i processi infiammatori nelrene,compresa l'espressione di molecole di adesione endoteliale, mediatori infiammatori, marker di lesione e proteinuria transitoria. In particolare, abbiamo scoperto che i neutrofili sono migrati nelrenedopo l'esposizione ai raggi UV in modo IL-17A-dipendente, localizzandosi nelle aree tubulointerstiziali (TI) dove mostravano fenotipi proinfiammatori. Il blocco del traffico dei neutrofili mediante il trattamento con immunoglobuline (IgG) anti-G-CSF è stato abrogatorenaleinfiammazione e prevenuta sovraregolazione dei marker di lesione tubulare. Insieme, questi risultati dimostrano che l'esposizione della pelle alla luce UV innesca fattori subclinicirenaleprocessi infiammatori e lesivi mediati dai neutrofili.

Risultati

L'esposizione della pelle alla luce UV provoca lesioni renali subcliniche.L'esposizione alla luce solare è stata associata all'aggravamento dei sintomi sistemici e all'insorgenza di riacutizzazioni della malattia nei pazienti con LES, inclusa la nefrite (2-4). Pertanto, abbiamo prima chiesto se l'infiammazione sterile acuta della pelle innescata da una singola esposizione alla luce ultravioletta B (UVB) (500 mJ/cm2) nei topi neri 6 (B6) porta a cambiamenti nellarene, tra cui infiammazione, lesioni e proteinuria (Fig. 1A). Il polmone è stato scelto come organo di controllo, poiché nel LES non è stata riportata alcuna associazione tra fotosensibilità e malattia polmonare clinica. Un totale di 500 mJ/cm2 di luce UVB nei topi B6 è stato definito come due dosi eritematose minime (20), la dose di riferimento utilizzata per la protesta umana (21). Analisi dell'espressione genica del perfusorene tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-piegarenaleinduzione in s100A9, un mediatore neutrofilo associato adanno ai reni(22), nonché una maggiore espressione di s100A6, una proteina legante il calcio associata a danno tubulare (23) (Fig. 1 D ed E). Mentre l'induzione di s100A9 è stata rilevata nel polmone, l'espressione del gene s100A6 è rimasta invariata nel polmone (appendice SI, Fig. S1). La risposta infiammatoria nelreneè stato anche associato a un aumento precoce dell'espressione il-1 (giorni 1 e 2 dopo UV), mentre c'era un cambiamento minimo o nullo in tnf o il-6 (Fig. 1F). L'espressione Il-1 non è stata rilevata nel polmone fino a 6 giorni dopo l'esposizione della pelle alla luce UVB (Appendice SI, Fig. S1). Induzione rapida nell'espressione di cxcl12, una chemochina secreta da glomeruli e tubuli e implicata indanno renale(24), è stato rinvenuto anche nelrenema non il polmone (Fig. 1G e SI Appendice, Fig. S1). Pertanto, la lesione cutanea innescata dalla luce UVB istiga rapidamenterenaleprocessi proinfiammatori, mentre si osservano meno cambiamenti nel polmone.

Oltre alla risposta proinfiammatoria osservata nelrene,sia la proteinuria che il rapporto albumina urinaria/creatinina sono aumentati nei primi giorni dopo l'esposizione della pelle ai raggi UVB (Fig. 1 H e I). Questo rapido effetto sufunzione renaleè stato accompagnato da una sovraregolazione nell'espressione della lipocalina-2 edanno renalemolecola 1 (kim-1) (Fig. 1 J e K), marcatori di tubolaredanno ai reniche si osservano anche in LN (25, 26). Nonostante la natura transitoria della proteinuria, l'espressione di questidanno renalei marcatori persistevano fino al giorno 6 (Fig. 1 J e K), probabilmente riflettendo la riparazione dei tessuti.

L'infiammazione della pelle indotta dalla luce UV provoca la migrazione dei neutrofili nel rene.Per studiare se i neutrofili partecipano alla risposta infiammatoria sistemica alla luce UVB, abbiamo esaminato la cinetica dell'accumulo di neutrofili nella pelle irradiata dalla luce UV e nella milza,rene,e polmone di topi C57BL/6 J (B6), un ceppo che imita al meglio i cambiamenti cutanei alla luce UVB nella pelle umana (Fig. 2A) (27). In seguito all'esposizione cutanea acuta alla luce UVB, il numero di neutrofili nella pelle è aumentato di sette volte entro 24 ore ed è rimasto elevato per 6 giorni rispetto ai livelli pre-UV basali (D-1) ​​(Fig. 2B). Ciò è stato accompagnato da una riduzione del numero di neutrofili nel midollo osseo e da un aumento di cinque volte dei neutrofili nel sangue circolanti nei giorni da 1 a 6 (Fig. 2 C e D). Curiosamente, nello stesso lasso di tempo, i neutrofili sono aumentati nella milza, nei polmoni erene(Fig. 2 Appendice E–G e SI, Fig. S2A). La cinetica precisa variava tra gli organi, raggiungendo un picco il giorno 1 nel polmone e i giorni da 2 a 6 nelrenee milza (Fig. 2 E–G). Nelreni, neutrofili per lo più localizzati nell'area tubulo-interstiziale, compreso il sistema vascolare, come indicato dalla colorazione dell'elastasi neutrofila (NE) in prossimità o colocalizzata con la molecola di adesione delle piastrine/cellule endoteliali-1 (PECAM-1/CD31 ) (Fig. 2H). Immagini rappresentative in Fig. 2H mostrano neutrofili all'interno o intorno al sistema vascolare interstiziale (frecce completamente bianche) e nell'interstizio (frecce bianche tratteggiate), con neutrofili occasionali, che si trovano anche nei glomeruli (frecce gialle). Una localizzazione simile è stata rilevata con la colorazione dell'immunofluorescenza (IF) anti-Ly6G (appendice SI, Fig. S2B).

Per determinare se altre cellule immunitarie innate hanno mostrato risposte locali e sistemiche simili ai neutrofili, abbiamo esaminato la distribuzione dei monociti (CD11b più Ly6C più Ly6G-) negli stessi punti temporali dopo l'esposizione alla luce UVB. Mentre i monociti sono stati reclutati anche nella pelle, solo un piccolo numero di monociti infiltranti è stato rilevato nelreneil giorno 6 dopo l'esposizione UVB (∼2-volte rispetto a ∼10.{3}}volte aumento direneneutrofili) (Fig. 2F e SI Appendice Fig, S3). Non è stato rilevato alcun aumento del numero di monociti nel polmone o nella milza (Appendice SI, Fig. S3), suggerendo che la risposta sistemica al danno UV era relativamente selettiva per i neutrofili.

L'infiltrazione di neutrofili nella pelle è stata accompagnata da alterazioni istologiche, inclusa l'infiammazione precoce del derma e la morte delle cellule epidermiche (giorni 1 e 2), seguite dallo sviluppo di acantosi e ipercheratosi con formazione di crosta sierocellulare in alcuni casi (giorno 6) (SI Appendice, Fig. S4). In particolare, non sono apparse lesioni cutanee aperte dopo l'esposizione alla luce UVB, suggerendo che l'infiltrazione di cellule immunitarie osservata si è verificata in condizioni sterili, sebbene non possa essere escluso un contributo di un microbioma cutaneo alterato (20).

Insieme, questi risultati dimostrano che l'esposizione della pelle a una singola dose di luce UVB mobilita i neutrofili sia nel sito locale dell'infiammazione che negli organi interni, compreso ilrene,accompagnata da neutrofilia ematica. Mentre i modelli migratori complessivi erano simili nei topi maschi e femmine, l'infiltrazione dei neutrofili nella pelle era più rapida nelle femmine rispetto ai maschi (Fig. 2B). Al contrario, il danno epidermico dovuto allo stripping del nastro non ha portato alla migrazione dei neutrofili alrenenonostante livelli simili di infiltrazione dei neutrofili e risposta infiammatoria e danno tissutale come si osserva con l'esposizione alla luce UV (appendice SI, Fig. S5), indicando che la disseminazione sistemica dei neutrofili non è comune a tutte le forme di lesione cutanea sterile.

CISTANCHE MIGLIORA LA MALATTIA RENALE/RENALE

IL{0}}A Promuove il reclutamento di neutrofili in seguito all'esposizione della pelle ai raggi UV.Un'indagine sui mediatori chemiotattici e infiammatori nella pelle ha rivelato una significativa sovraregolazione dell'espressione genica delle chemochine neutrofile e delle citochine infiammatorie cxcl1, cxcl5/6, g-csf e il-1 1 a 2 giorni dopo l'esposizione ai raggi UV (Fig. .3 A–D). L'aumento rapido e persistente dell'espressione di s100A9 corrispondeva alla cinetica dell'infiltrazione dei neutrofili nella pelle (Fig. 2B e SI Appendice, Fig. S6), mentre le citochine il-6, tnf e il{13}} sono stati transitoriamente aumentati e sono tornati all'espressione di base entro il giorno 6 (Appendice SI, Fig. S6). Al contrario, il-36a è stato elevato solo il giorno 6 (Appendice SI, Fig. S6), forse riflettendo una funzione riparativa. La presenza transitoria (da 1 a 2 d) di monociti nella pelle (appendice SI, Fig. S3) è stata parallela alla sovraregolazione delle chemochine specifiche dei monociti ccl4 e ccl2 (appendice SI, Fig. S6). Simile all'accumulo di neutrofili nella pelle dei topi femmine (Fig. 2B), l'accumulo di monociti nella pelle si è verificato anche prima nelle femmine rispetto ai maschi (Appendice SI, Fig. S3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000-induzione cutanea piega nell'espressione di g-csf durante i giorni 1 e 2 dopo UV (Fig. 3C). Per determinare se l'induzione di queste citochine fosse rilevante per la mobilizzazione dei neutrofili, abbiamo prima quantificato le concentrazioni di proteine ​​delle citochine nel sangue, che hanno rivelato un aumento robusto e sostenuto (da 10- a 100- volte) nella concentrazione di plasma IL-17A da 6 a 24 h dopo l'esposizione alla luce UV (Fig. 3F), insieme a un aumento transitorio (picco a 6 h) di IL-6 e IL-12, citochine che potrebbe essere a valle di IL-17A (28) (Fig. 3 G e H). Non è stato osservato alcun aumento delle concentrazioni plasmatiche di IFN, GM-CSF, TNF, IL-10, IL-27, IL-23 o IL1. Per determinare se IL-17A è necessario per il reclutamento dei neutrofili indotto da UVB, abbiamo bloccato l'effetto di IL-17A con un anticorpo neutralizzante prima dell'esposizione ai raggi UV (Fig. 3I). Anti-IL-17A IgG ha smorzato significativamente la neutrofilia ematica (Fig. 3J) e ha attenuato l'afflusso di neutrofili sia nel tessuto cutaneo esposto (Fig. 3K e SI Appendice, Fig. S7A) che nelrene(Fig. 3L e Appendice SI, Fig. S7B). Questi risultati dimostrano che il reclutamento dei neutrofili in risposta alla luce UV è mediato, almeno in parte, da IL-17A.

I neutrofili mediano l'infiammazione renale dopo l'esposizione della pelle ai raggi UVLuce.Per determinare se i neutrofili fossero responsabili dei cambiamenti infiammatori nelrene following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000-piega dopo l'esposizione ai raggi UV, suggerendo un ruolo chemiotattico per il G-CSF nel reclutamento dei neutrofili in risposta alla luce UV, abbiamo inibito la mobilizzazione dei neutrofili dal midollo osseo bloccando il G-CSF come illustrato in Fig. 4A. La neutralizzazione del G-CSF ha impedito la neutrofilia del sangue e il reclutamento dei neutrofili nelrenedopo l'esposizione della pelle alla luce UVB (Fig. 4 B e C). In particolare, come precedentemente riportato in diversi modelli (29, 30), il blocco del G-CSF non ha alterato il numero di monociti nelrene(Fig. 4D). Diminuzione della migrazione dei neutrofili alreneè stata accompagnata da una significativa riduzione delrenaleespressione delle molecole di adesione vcam-1 ed e-selectin (Fig. 4 E e F), nonché dei mediatori infiammatori s100A9 e il{5}} d dopo l'esposizione UVB (Fig. 4 G e H). Inoltre, i marcatori di danno tissutale lipocalina-2 e kim-1 nelreneerano significativamente diminuiti nei topi esposti alla luce UV trattati con anticorpi bloccanti G-CSF rispetto agli animali esposti ai raggi UV trattati con isotipo (Fig. 4 I e J). Come riportato in precedenza (6), l'esposizione cutanea acuta alla luce UVB ha innescato una risposta all'interferone di tipo I nelrene(Fig. 4K). Il blocco del G-CSF ha ridotto significativamente, ma non ha completamente abrogato, il punteggio IFN (Fig. 4K). Mentre la presenza di neutrofili nelreneera necessario per le risposte infiammatorie acute e lesioni osservate 1 giorno dopo l'esposizione alla luce UV della pelle (Fig. 4), a questo punto non sono state osservate differenze nella proteinuria, poiché il picco di proteinuria si è verificato intorno al giorno 4 dopo l'esposizione ai raggi UV (Fig. 1 H e IO). Insieme, questi dati indicano che i neutrofili sono responsabili della risposta infiammatoria e, direttamente o indirettamente, contribuiscono all'induzione dell'interferone di tipo I nelrenedopo l'esposizione della pelle ai raggi UV. Analogamente ai risultati ottenuti con le IgG anti-G-CSF, la somministrazione di anticorpi neutralizzanti anti-IL-17 ha parzialmente soppresso la migrazione dei neutrofili verso ilrenee ha provocato una diminuzione dell'espressione genica direnemarcatori infiammatori (vcam-1 e s100A9) e lesioni (lipocalin-2 e kim-1), sebbene solo la riduzione dell'espressione di kim-1 fosse statisticamente significativa (appendice SI, Fig S7 DO–FA)

Una sottopopolazione di neutrofili renali viene trasmigrata inversa, un fenotipo rilevato anche nel sangue dei pazienti con LES.Sebbene sia stato a lungo ritenuto che i neutrofili che entrano nei siti di infezione o di infiammazione sterile successivamente subiscano l'apoptosi e vengano rapidamente rimossi dai macrofagi, numerosi studi hanno rivelato che alcuni neutrofili si muovono in modo bidirezionale, cioè, dopo essere entrati in un tessuto, trasmigrano tornare nel flusso sanguigno e infiltrarsi in un'altra posizione, un processo denominato trasmigrazione inversa (rTEM) (8, 10, 11, 31–34). Per indagare se i neutrofili che ospitavano ilrenedopo che l'esposizione della pelle alla luce UVB è transitata attraverso la pelle esposta, abbiamo studiato la migrazione dei neutrofili in un modello murino B6 fotoattivabile (ubiquitina umana C [UBC]-fotoattivata [PA]-proteina fluorescente verde [GFP]).

Lo schema sperimentale è illustrato in Fig. 5A; 1 giorno dopo l'esposizione della pelle a una singola dose di luce UVB, la pelle è stata esposta alla luce viola (405 nm) in modo tale che le cellule immunitarie infiltranti sono state fotoconvertite in cellule GFP-positive. I neutrofili fotoconvertiti (GFP più Ly6G più) sono stati quindi quantificati in perfusireniil giorno successivo. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che circa il 20 percento dei neutrofili infiltranti i reni era positivo alla GFP dopo la sottrazione del segnale di fondo (~ 10 percento) (Fig. 5B). Contrariamente ai modelli di infiammazione sterile nel fegato o nel muscolo cremastero (8, 10), non abbiamo rilevato neutrofili fotoconvertiti nel polmone, probabilmente perché pochi neutrofili sono stati trovati nel polmone il giorno 2 (Fig. 2F). Per verificare se GFP più neutrofili nelrenestravaso dal tessuto cutaneo esposto ai raggi UV o erano PA intravascolare, abbiamo confrontato le variazioni nel numero di GFP più neutrofili ottenuti dalrenidi topi in cui la stessa pelle esposta alla luce UV era PA con luce viola il giorno dopo (Gruppo I) rispetto a topi in cui la pelle adiacente a tale esposizione alla luce UV era PA con luce viola il giorno dopo (Gruppo II, diagramma nell'appendice SI, Fig. S8A). Sebbene non vi fossero differenze nelle percentuali di neutrofili circolanti tra i gruppi (appendice SI, Fig. S8B), è stato osservato un aumento maggiore di GFP più neutrofili nelrenidi topi in cui la pelle esposta ai raggi UV era anche PA (gruppo I) rispetto alla mancanza di aumento della GFP più neutrofili nei topi in cui la pelle non esposta ai raggi UV era PA (gruppo II) (Appendice SI, Fig. S7B). Nel gruppo II, i numeri dei neutrofili erano simili allo sfondo della positività GFP visto in Fig. 5B (appendice SI, Fig. S8B).

Mentre bassi livelli di GFP plusreneneutrofili nel gruppo II hanno suggerito che la luce viola non ha PA nelle cellule circolanti nella pelle non esposta ai raggi UV, è rimasto possibile che l'esposizione alla luce UV alterasse le interazioni dei neutrofili con i vasi sanguigni nella pelle, consentendo una maggiore fotoconversione e la successivareneaccesso. Per determinare le proporzioni relative dei neutrofili TEM, abbiamo quantificato l'espressione dei marcatori di superficie utilizzati per caratterizzare i neutrofili sottoposti a rTEM: CXCR4hi (8) e ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). In effetti, GFP plusrenei neutrofili esprimevano livelli più elevati di CXCR4 rispetto a GFP più neutrofili nella pelle o neutrofili GFP- nellarene(Fig. 5C). Di

interesse,renaleespressione del ligando CXCR4, cxcl12, da 1 a 2 giorni dopo l'esposizione della pelle alla luce UVB era concomitante con la presenza di neutrofili CXCR4hi nelrene(Fig. 1G), forse fornendo lo stimolo chemiotattico per il reclutamento di questi neutrofili nel rene. È interessante notare che abbiamo rilevato i neutrofili CXCR4hi e ICAM1- hiCXCR1lo nel midollo osseo tardi dopo l'esposizione ai raggi UV (giorno 6, appendice SI, Fig. S9 B e C), suggerendo che alcuni di questi neutrofili risalgono anche al midollo osseo simile a quanto riportato per rTEM a seguito di danno epatico o infezione da virus della pelle (12, 36). Coerentemente con queste osservazioni, abbiamo rilevato una maggiore espressione di CXCR4 sui neutrofili del sangue il giorno 2 dopo l'esposizione ai raggi UV, possibilmente catturando le cellule in rotta verso ilrenee midollo osseo (appendice SI, Fig. S9D). Allo stesso modo, una percentuale significativamente maggiore di cellule ICAM1hiCXCR1lo è stata rilevata tra i neutrofili GFP più nelrenerispetto a GFP più neutrofili nella pelle e GFP- neutrofili nellarene(Fig. 5D). Il fenotipo ICAM1hiCXCR1lo è stato rilevato in circa il 20-35% di GFP più neutrofili nelrene(Fig. 5D), suggerendo che un sottoinsieme di neutrofili che migrano alrenetramite la pelle esposta ai raggi UV lo fa per trasmigrazione inversa, mentre il resto direnei neutrofili sono probabilmente attivati ​​​​durante la circolazione attraverso la pelle infiammata esposta ai raggi UV. La sottopopolazione di neutrofili ICAM1- hiCXCR1lo è stata rilevata anche nelrenidi topi B6 normali esposti alla luce UV che non hanno ricevuto PA (appendice SI, Fig. S9A).

Mentre entrambi i fenotipi dei neutrofili CXCR4hi e ICAM1hiCXCR1lo sono stati associati a funzioni infiammatorie e lesioni tissutali in diversi modelli murini (11, 31, 37), pochi studi sono stati condotti su queste popolazioni cellulari nella malattia umana. Dato il ruolo emergente dei neutrofili nel LES (13, 17, 18) e la loro apparente eterogeneità (19), abbiamo studiato se le cellule polimorfonucleate a densità normale (PMN) o LDG di pazienti con LES

ha dimostrato i fenotipi a migrazione inversa: CXCR4hi (37, 38) e ICAM1hiCXCR1lo. Il profilo della citometria a flusso di PMN e LDG ha rivelato una maggiore espressione di CXCR4 sulla superficie di queste cellule nei pazienti con LES rispetto ai controlli sani (Fig. 6 A e C). Inoltre, abbiamo trovato una percentuale piccola ma significativamente più alta di ICAM1hiCXCR1lo PMN nel sangue del LES (media, 3,5 percento) rispetto ai controlli sani (media, 1,4 percento) (Fig. 6B). È interessante notare che la popolazione di neutrofili LDG (CD15 più CD14loCD10 più nelle cellule mononucleate del sangue periferico [PBMC]) conteneva una percentuale maggiore di cellule ICAM1hiCXCR1lo rispetto ai PMN sia nel sangue sano (media, 7,1 percento) che con LES (media, 29,4 percento) (Fig. 6 B e D). La popolazione simile a rTEM era significativamente più rappresentata negli LDG dei pazienti con LES rispetto ai controlli sani (Fig. 6D). Questi dati identificano la presenza di fenotipi neutrofili simili a rTEM nei PMN e in particolare LDG nei pazienti con LES.

Discussione

Gli effetti sistemici dell'esposizione della pelle ai raggi UV sono poco conosciuti. L'identificazione di questi percorsi in condizioni normali di base può informare i meccanismi del coinvolgimento sistemico dei tessuti dopo l'esposizione al sole che si verifica in malattie come il LES (2–4). Qui, riportiamo diversi risultati su come l'esposizione alla luce solare influisce sul rene. In primo luogo, abbiamo dimostrato che l'esposizione acuta della pelle alla luce UVB innesca risposte infiammatorie e lesioni nelrene,inclusa la proteinuria subclinica. Curiosamente, questirenalei cambiamenti sono stati accompagnati da infiltrazione di neutrofili nel rene a seguito di un'infiammazione cutanea mediata dalla luce UVB. La risposta dei neutrofili dipendeva da IL-17A e G-CSF. I neutrofili nel rene avevano fenotipi proinfiammatori, come evidenziato dalla localizzazione extracellulare di NE, una percentuale maggiore di rTEM (CXCR4hi) noto anche come cellule "invecchiate" e ICAM1hiCXCR1lo. I neutrofili sono stati direttamente implicati nel subclinicodanno renale,poiché l'esaurimento dei neutrofili ha comportato riduzioni significative dell'espressione di molecole di adesione, citochine infiammatorie, firma dell'IFN-I e marcatori di danno renale dopo l'esposizione ai raggi UV della pelle.

Altri tipi di lesioni cutanee, come la rimozione del nastro adesivo e l'applicazione topica di un agonista TLR7, sono stati segnalati per miglioraredanno renalein alcuni modelli di lupus, sebbene si pensasse che l'aumento della malattia fosse mediato dai macrofagi e dalle cellule dendritiche piuttosto che dai neutrofili (39, 40). Avendo dimostrato che lo stripping del nastro non ha portato al reclutamento di neutrofili nelrene, proponiamo che l'esposizione alla luce UV sia diversa da altri tipi di infiammazione cutanea sterile. Ciò può essere spiegato dalla generazione di fotoprodotti o mediatori infiammatori unici dopo la lesione UV che preparano il rene all'infiammazione, dalle differenze nella rimozione dei neutrofili dopo i raggi UV rispetto allo stripping del nastro o da altri fattori. Abbiamo osservato che la luce UV ha innescato una rapida e forte induzione di il-17a RNA messaggero (mRNA) nella pelle insieme a livelli elevati di IL{1}}A in circolo (aumento di ∼100-volte) , necessario per il reclutamento dei neutrofili dopo l'esposizione alla luce UV. L'induzione simultanea da 100- a 1,000-piega nell'espressione cutanea g-csf suggerisce che l'asse IL-17A/G-CSF è il probabile meccanismo responsabile della neutrofilia e dell'homing dei tessuti neutrofili in risposta ai raggi UV. Il ruolo dell'IL-17A nella regolazione della granulopoiesi e del reclutamento dei neutrofili tramite l'induzione del G-CSF è ben riconosciuto in condizioni omeostatiche e alcuni studi hanno identificato l'IL-17A come importante per il reclutamento dei neutrofili nei siti di infiammazione sterile (41, 42). Nel lupus, un'espressione elevata di IL-17A si trova nelle lesioni cutanee (43) e livelli aumentati di IL{16}}A circolante sono stati associati a peggiori manifestazioni della malattia (44), sebbene la relazione specifica con i neutrofili, una popolazione patogena in questa malattia (13, 17, 18), rimane inesplorata. Oltre ai suoi effetti diretti sulla mobilizzazione mediata da G-CSF dei neutrofili dal midollo osseo, IL- 17A può anche contribuire all'homing dei neutrofili nelrenestimolando l'espressione di molecole di adesione (ad es. VCAM-1 ed E-Selectin) sulrenaleendotelio (45, 46).

Utilizzando lo stesso modello di esposizione acuta ai raggi UV, abbiamo recentemente riportato che una singola dose di luce UV ha innescato una risposta IFN-I locale e sistemica, necessaria per un efficiente reclutamento dei neutrofili nella pelle (6). Poiché è stato dimostrato che l'IFN-I induce la produzione di IL-17A (47), è plausibile che questi percorsi, indipendentemente o in concerto, portino al reclutamento e alla migrazione dei neutrofili mediati dalla luce UV che riportiamo qui. Sebbene i nostri risultati suggeriscano un ruolo infiammatorio per IL- 17A, gli effetti soppressivi della luce UVB su IL{7}}A sono stati segnalati in precedenza nella psoriasi, dove l'esposizione della pelle psoriasica alla luce UVB eliminava i linfociti T patogeni e cellule dendritiche infiammatorie mieloidi (48, 49). Poiché la pelle psoriasica, a differenza di quella sana, è ricca di cellule T che producono e rispondono a IL{10}}, è probabile che la differenza nella composizione cellulare determini la risposta alla luce UVB, inclusa l'entità della soppressione di IL mediata dalla luce UVB -17Un'espressione del recettore (50). Il dosaggio UV può anche determinare se si verifica l'effetto infiammatorio o terapeutico: basse dosi sono associate a conseguenze antinfiammatorie e immunosoppressive (51), possibilmente inibendo le risposte dei linfociti T CD8 (52).

I neutrofili svolgono molteplici ruoli durante l'infiammazione dei tessuti. Quando attivati ​​da pattern molecolari associati ai patogeni e pattern molecolari associati al danno (DAMPS) o dall'impegno del recettore, i neutrofili contribuiscono direttamente al danno tissutale rilasciando proteasi, ROS ed estrusione di trappole extracellulari di neutrofili (NET) (53, 54). I neutrofili possono anche promuovere la riparazione dei tessuti mediante la fagocitosi dei detriti cellulari e consentendo la rivascolarizzazione dei tessuti (8). Nel LES, una firma del gene dei neutrofili è un forte predittore di malattie attive tra cui LN e lupus cutaneo (17, 18). I neutrofili si trovano anche nelle lesioni cutanee (13, 14).renecampioni bioptici (15, 16) di pazienti con LES e le loro proprietà infiammatorie sono state attribuite, in parte, alla formazione di NET (16). Questo processo include una maggiore produzione di ROS (55), rilascio di DNA mitocondriale (55) e rilascio e induzione di proteine ​​infiammatorie, come s100A9 (56), IL-1b (57) e interferoni di tipo I (55 , 58). I nostri risultati secondo cui l'inibizione della migrazione dei neutrofili al rene ha abrogato s100A9 e ridotto significativamente l'espressione di IL-1b e ilreneIl punteggio IFN suggerisce che funzioni infiammatorie simili potrebbero essere in gioco. Rilevante per la malattia renale nel LES, i neutrofili sono localizzati principalmente nell'endotelio TI, sede di aumentata espressione didanno renalemarcatori kim-1 e lipocalina-2 nei tessuti renali LN (59,60). La proteinuria può insorgere a causa dell'eccessiva permeabilità della barriera glomerulare alle proteine ​​a causa del ridotto riassorbimento delle proteine ​​da parte dei tubuli o di una combinazione di questi meccanismi (61). Il danno TI nei pazienti con LES è un reperto patologico frequente nei reni LN, compresi quelli con lieve danno glomerulare (61, 62). È stato dimostrato che la lesione da TI predice la gravità della LN (63, 64), ma i meccanismi che la provocano sono sconosciuti. Poiché elevati livelli di kim-1 e lipocalina-2 sono marcatori riconosciuti di danno TI nel LES (26, 65) e bloccano la migrazione dei neutrofili verso ilreneinibito la loro espressione, proponiamo che la proteinuria transitoria osservata dopo l'esposizione ai raggi UV sia una conseguenza dell'infiammazione subclinica TI mediata dai neutrofili (65). L'aumento dell'espressione renale vcam-1, un altro marker di danno TI nel LES (66), supporta ulteriormente questo modello.

Oltre a propagare l'infiammazione nei siti locali di danno sterile o infettivo, è stato dimostrato che i neutrofili ospitano organi distanti (8-10), dove, a seconda del contesto, contribuiscono al danno tissutale attraverso la produzione di ROS (11) o attivano il sistema immunitario adattativo nei linfonodi e nel midollo osseo (9, 12). La natura infiammatoria di questi neutrofili è stata attribuita alla loro capacità di uscire dal sito primario della lesione e migrare verso siti secondari, cioè sottoporsi a rTEM (9–11, 31–34). I nostri risultati che la PA delle cellule contenenti GFP nella pelle dopo l'esposizione ai raggi UV ha portato alla rilevazione di GFP più neutrofili nelrenecon il fenotipo di rTEM suggeriscono che una sottopopolazione direnalei neutrofili sono migrati inversamente dalla pelle esposta ai raggi UV (la GFP più i neutrofili costituiscono circa il 20 percento direneneutrofili e di questi, dal 20 al 35 percento sono rTEM; pertanto, le rTEM costituiscono dal 4 al 7 percento del totalereneneutrofili). Questa proporzione di rTEM è paragonabile alla proporzione riportata dopo danno epatico sterile (~9 percento) (36) e danno da ischemia-riperfusione (~8 percento) (11). In altre circostanze, le rTEM hanno dimostrato di essere pro-infiammatorie (10, 11) e hanno un'apoptosi ridotta (35), portando alla possibilità che svolgano un ruolo nell'induzione dei raggi UVdanno renale.L'elevata espressione di CXCR4 su questi neutrofili è particolarmente rilevante, in quanto coincidenterenaleè stata osservata l'espressione di cxcl12, un ligando CXCR4 espresso da podociti e tubuli (24), che probabilmente fornisce un segnale chemiotattico per questa popolazione di neutrofili. Aumento dell'espressione di CXCR4 sulle cellule immunitarie accoppiato con alti livelli direnaleCXCL12 sono stati identificati in pazienti con LES con LN (67) e questa via era implicata nel lupus e nell'ischemia-riperfusionedanno renalenei topi (24, 68). Oltre ad essere un marker di rTEM, l'aumentata espressione di CXCR4 è anche un indicatore di neutrofili "invecchiati", che possono mediare risposte infiammatorie dannose per i tessuti (38). Il ruolo preciso di CXCR4 nel reclutamento dei neutrofili nelrenepuò essere studiato dall'antagonismo CXCR4 come precedentemente fatto in altri modelli di lesione sterile (38).

La migrazione dei neutrofili tessuto-specifica ei meccanismi responsabili dell'espressione differenziale delle molecole di adesione in diversi organi non sono ben compresi (69). Livelli più elevati di espressione della chemochina cxcl12 nelrenema non il polmone potrebbe spiegare la presenza preferenziale dei neutrofili CXCR4hi nel rene. Inoltre, l'induzione dell'espressione di vcam-1 ed e-selectina nel rene, rispetto a nessun cambiamento nell'espressione nel polmone, contribuisce probabilmente al reclutamento e alla ritenzione preferenziale dei neutrofili nel rene. L'aumento di 5- a 6-volte nell'espressione di s100A9 nel polmone rispetto a un aumento di 30- a 60-volte nel rene e un aumento di 6-volte in il{10}}b espressione nel polmone rispetto a 16-aumento di piega nel rene indica ulteriormente differenze tissutali nella risposta infiammatoria. La riduzione dell'infiltrazione di neutrofili nel rene in seguito alla neutralizzazione del G-CSF può essere attribuita sia a una riduzione del numero circolante e all'attivazione dei neutrofili, sia a una riduzione dell'espressione locale di vcam-1 ed e-selectin. Tuttavia, non possiamo essere certi se la sovraregolazione iniziale di queste molecole di adesione in seguito all'esposizione ai raggi UV della pelle sia attribuita a citochine/DAMPS di origine cutanea o se i neutrofili, attraverso il rilascio di serina proteasi, contribuiscano direttamente alla loro espressione come è stato dimostrato in altri contesti (70). Indipendentemente dai meccanismi e notando che non abbiamo eseguito un'analisi completa di tutti i tessuti, i nostri studi forniscono prove di una selettività d'organo negli effetti sistemici mediati dalla luce UV. Studi futuri riguarderanno le conseguenze funzionali tessuto-specifiche della disseminazione sistemica dei neutrofili, ad esempio attraverso la fuoriuscita di albumina vascolare e la formazione di edemi nel polmone (11, 36).

Nei pazienti con LES, è difficile correlare inequivocabilmente l'esposizione alla luce UV della pelle con le esacerbazioni della malattia sistemica, poiché vi è una variazione significativa (da 1 a 3 settimane) nelle risposte di fotosensibilità visibile in diversi individui (21). Inoltre, subclinicodanno renalepossono essere facilmente ignorati fino a quando esposizioni consecutive alla luce UV non aggravano gli effetti. Mentre abbiamo scoperto che mediato dai neutrofiliinfiammazione renalein risposta alla luce UV non provoca malattie cliniche nei topi sani, un tale meccanismo può contribuire in diversi modi ai razzi di LN nei pazienti con lupus fotosensibile. Il coinvolgimento del recettore Fc da parte degli immunocomplessi potrebbe aumentare il reclutamento dei neutrofili, con conseguente rilascio di ROS e proteasi (71); l'aumentata capacità dei neutrofili lupus e degli LDG di produrre NET, che, nei pazienti con LES, non vengono eliminati in modo efficiente (72), potrebbe portare al rilascio di proteasi dannose per i tessuti (73), propagazione della risposta IFN-I (58) , o danni diretti alreneendotelio creando danni vascolari e perdite (16). Inoltre, le differenze sottostanti nella pelle del lupus, come il potenziamento del segnale IFN-I (5, 74) e i difetti nella popolazione protettiva delle cellule di Langerhans (75), potrebbero informare l'entità e la natura delle risposte sistemiche mediate dai neutrofili. Il monitoraggio della migrazione dei neutrofili insieme all'interrogazione di autoanticorpi, accumulo di cellule apoptotiche e bassi livelli di complemento può essere affrontato utilizzando nuovi modelli di lupus, come i tripli mutanti geneticamente definiti (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− e Sle1.Mfge8− /−C3−/−) (76) o altri ceppi di lupus in seguito all'esposizione ai raggi UV.

Gli esatti meccanismi che collegano i neutrofili all'infiammazione nel LES potrebbero, inoltre, essere influenzati dal fenotipo neutrofili/LDG, poiché l'eterogeneità all'interno di queste popolazioni è diventata più evidente (77). I nostri risultati sulle popolazioni circolanti elevate di CXCR4 e ICAM1hiCXCR1lo (rTEM), in particolare negli LDG del SLE, si aggiungono ulteriormente a questa eterogeneità e suggeriscono che alcuni dei granulociti più pro-infiammatori nel sangue potrebbero avere una precedente "esperienza tissutale", cioè la residenza nel tessuti d'organo colpiti, come la pelle, prima della disseminazione sistemica. I fenotipi rTEM sono stati precedentemente riportati nel liquido sinoviale e nei neutrofili circolanti di pazienti con artrite reumatoide (35, 78) e nel danno polmonare acuto associato alla pancreatite (79). Il loro ruolo in SLE merita ulteriori indagini.

CISTANCHE MIGLIORA IL DOLORE RENALE/RENALE

Materiali e metodi

Topi.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Washington, Seattle. Gli esperimenti iniziali sono stati condotti utilizzando topi C57BL/6J maschi e femmine (Jackson Laboratory, da 3 a 4 mesi, Fig. 1 e 2). I topi femmine sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti successivi. Gli studi sulla PA sono stati eseguiti su B6. Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP) 1Mnz/J topi femmina (Jackson Laboratory, 3-4 mesi). Questi topi sono stati generati mediante iniezione di un vettore transgenico che trasporta PAGFP (variante T203H) sotto il controllo trascrizionale del promotore dell'ubiquitina C umana in embrioni C57BL/6. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni prive di agenti patogeni e mantenuti in cicli luce-buio di 12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua. Gli esperimenti su tutti gli animali sono stati eseguiti alla stessa ora del giorno per evitare l'influenza del ritmo circadiano sulla migrazione dei neutrofili (38).

Esposizione a luce UVB e stripping del nastro.L'aspetto dorsale dei topi C57BL/6 maschi e femmine è stato rasato almeno 24 ore prima dell'irradiazione con luce UVB e negli esperimenti sono stati utilizzati solo i topi con pelle non pigmentata. I topi sono stati anestetizzati con isoflurano ed esposti a una dose di luce UVB (500 mJ/cm2) utilizzando lampadine FS40T12/UVB (National Biological Corporation), con picchi di emissione tra 300 e 315 nm. L'energia luminosa UVB sulla superficie dorsale è stata misurata con un radiometro Photo light IL1400A dotato di un rivelatore SEL240/UVB (International Light Technologies). I topi sono stati soppressi 1, 2 o 6 giorni dopo l'esposizione alla luce UVB e i topi non irradiati sono stati usati come controlli (D-1) (Fig. 2A). Lo stripping del nastro epidermico è stato eseguito come precedentemente descritto (7) e la pelle erenesono stati valutati 24 ore dopo l'infortunio

Inibizione di IL-17A e G-CSF.I topi sono stati trattati per via endovenosa con 100 ug di anti-topo di ratto purificato IL-17A IgG (BioLegend) o controllo isotipico 3 ore prima dell'esposizione alla luce UV (1 × 500 mJ/cm2) (Fig. 3I). Presenza di neutrofili nel sangue, nella pelle e perfusi con soluzione fisiologicareneil tessuto è stato valutato mediante citometria a flusso 24 ore dopo l'esposizione ai raggi UV come descritto di seguito. La migrazione dei neutrofili in risposta alla luce UV è stata inibita trattando i topi per via intraperitoneale con 50 ug di anticorpo monoclonale anti-topo G-CSF o controllo dell'isotipo IgG murino (sistemi di ricerca e sviluppo) 24 ore e 3 ore prima dell'esposizione della pelle alla luce UVB (1 × 500 mJ /cm2) (Fig. 4A). A seguito di perfusione cardiaca, numero di neutrofili e monociti nelrenesono stati valutati mediante citometria a flusso ed espressione genica mediante qPCR, come descritto di seguito. I topi non esposti alla luce UVB sono stati usati come gruppo di controllo aggiuntivo.

Isolamento di cellule da diversi organi.Dopo l'eutanasia con inalazione di CO2, un pezzo di pelle dorsale è stato rimosso e mantenuto in soluzione RPMI (Roswell Park Memorial Institute) su ghiaccio fino alla lavorazione. Il sangue è stato raccolto mediante puntura cardiaca in siringhe rivestite di acido etilendiamminotetraacetico. La perfusione cardiaca è stata successivamente eseguita utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (~60 ml) attraverso il ventricolo sinistro dopo aver tagliato l'atrio destro. La riuscita perfusione è stata determinata osservando completarenee pallore polmonare. Polmoni, reni, milza ed entrambi i femori sono stati rimossi con cura e posti in una soluzione RPMI su ghiaccio fino all'elaborazione del campione. Le cellule sono state isolate da aree equivalenti di tessuto cutaneo (∼30 mm2) macinando e digerendo il tessuto con 0,28 unità/mL di Liberase TM (Roche) e 0,1 mg/mL di Deossiribonucleasi I ( Worthington) in PBS con Ca più 2 e Mg più 2 per 60 minuti a 37 gradi con agitazione. Le cellule sono state isolate da unoreneper animale;renei tessuti sono stati tritati e digeriti in 2 mg/mL di collagenasi di tipo I (Worthington) per 30 minuti a 37 gradi secondo un protocollo pubblicato. Le cellule polmonari sono state raccolte digerendo il tessuto in PBS (Ca più 2 e Mg più 2) con 1 mg/mL di collagenasi di tipo 1 e 60 U di desossiribonucleasi I. Le milze intere sono state frantumate su un colino cellulare da 40 μm e lavate con una soluzione RPMI. Il sangue intero e le cellule della milza, del midollo osseo, dei reni e dei polmoni sono stati trattati con tampone di lisi 1X per globuli rossi (RBC) (BD Biosciences). Dopo l'isolamento/digestione, le cellule di tutti i tessuti sono state filtrate (40 μm), lavate con PBS e risospese in soluzione RPMI prima del conteggio.

Colorazione e analisi della citometria a flusso.Le cellule sono state trattate con Fc Block TruStain FcX (Biolegend) e colorate con il colorante Zombie Aqua Viability (Biolegend) secondo le raccomandazioni del venditore. Le cellule sono state lavate e la colorazione della superficie è stata eseguita utilizzando anticorpi fluorescenti specifici per il topo acquistati da Biolegend. Diverse popolazioni di cellule mieloidi sono state analizzate nel gate delle cellule immunitarie vive (Zombie Aqua-CD45 plus). Sono stati quantificati la percentuale e il numero di neutrofili (Ly6CintLy6Ghi) e monociti (Ly6C più Ly6G-). Il gating rappresentativo della citometria a flusso è presentato nell'appendice SI, Fig. S10. L'espressione percentuale e le intensità medie di fluorescenza dei marcatori di superficie nel modello PA (CXCR4, ICAM1 e CXCR1) sono state determinate utilizzando i controlli di colorazione della fluorescenza meno uno (FMO) nel gate dei neutrofili (Ly6Ghi). Tutti i campioni sono stati elaborati utilizzando il citometro a flusso CytoFLEX (Beckman Coulter) e i dati sono stati analizzati con il software FlowJo versione 10 (Tree Star).

Studi di Fotoattivazione (PA).I topi UBC-PA-GFP sono stati rasati e una parte della schiena è stata irradiata con una dose di luce UVB (500 mJ/cm2) come sopra. Solo l'area cutanea che verrà fotoconvertita è stata esposta alla luce UVB, mentre la pelle rimanente è stata ricoperta da un foglio di alluminio. Dopo 24 ore dalla lesione sterile indotta da UVB, l'intera regione della pelle irradiata da UVB è stata sottoposta a luce viola (405 nm) utilizzando una lampada a diodi emettitori di luce da 50 W con fibra di apertura numerica (NA) 0,37 (Mightex) alla potenza di 100 mW (15 min di esposizione per area). Questo metodo è stato ottimizzato sulla base di un protocollo pubblicato di fotoconversione specifica per la pelle (80).Renie i polmoni sono stati raccolti ed elaborati per l'analisi della citometria a flusso 24 ore dopo la PA, come descritto sopra. L'approccio e la sequenza temporale sono delineati nel diagramma in Fig. 5A. La percentuale di GFP più neutrofili nelreneè stato confrontato con quello trovato nei topi in tre condizioni di controllo: 1) nessun UV e nessun PA, 2) UV ma nessun PA e 3) nessun UV ma PA. Livelli di espressione di CXCR4 e fenotipo ICAM1hiCXCR1lo all'interno di GFP plus e neutrofili GFP- nella pelle erenesono stati valutati mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi marcati in modo fluorescente specifici per il topo acquistati da Biolegend. Per determinare se la GFP più i neutrofili nelreneoriginato dalla pelle e non dal sangue, la pelle in un gruppo di topi è stata esposta alla luce UV e PA come descritto sopra (Gruppo I), mentre in un altro gruppo la pelle è stata esposta alla luce UV ma la PA è stata eseguita sull'area cutanea adiacente non esposto alla luce UV (Gruppo II) (diagramma nell'appendice SI, Fig. S7A).Renisono stati raccolti ed elaborati per l'analisi di citometria a flusso come descritto sopra.

Espressione genica e analisi proteomiche.Pelle,rene,e i campioni di polmone sono stati conservati in una soluzione RNAlater (QIAGEN). L'RNA è stato estratto mediante RNeasy Kit da QIAGEN e il DNA complementare (cDNA) è stato sintetizzato utilizzando il kit di sintesi del cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems). Le trascrizioni di chemochine infiammatorie, citochine e molecole di adesione sono state quantificate mediante qPCR in tempo reale utilizzando i primer elencati nell'appendice SI, Tabella S1 e normalizzate alla media dei livelli di trascrizione 18S. La dose di luce UVB utilizzata non ha influenzato l'espressione di 18S in nessuno degli organi. L'espressione relativa dei bersagli di mRNA è stata determinata utilizzando la formula standard 2^(-Ct) × coefficiente. I punteggi IFN sono stati derivati ​​dall'espressione di 10 geni rappresentativi stimolati dall'interferone (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 e ifi27l2a) come precedentemente descritto (6). La media e la SD dell'espressione relativa di ciascun ISG sono state determinate nelrenidi topi non esposti alla luce UV (meannoUV e SDnoUV). Questi sono stati quindi utilizzati per standardizzare i livelli di espressione di ciascun ISG nei reni dei topi trattati (isotipo IgG più UVB o a-GCSF più UVB). I livelli di espressione standardizzati sono stati quindi sommati per ciascun topo per ricavare un punteggio di espressione IFN; i=espressione di ciascun ISG; Trattamento genico=livello di espressione genica relativa dopo il trattamento; e Gene inoUV=livello di espressione genica relativa nei topi non esposti alla luce UVB. ∑ 10 i=1=Geneitreatment-meanGeneinoUV SD(GeneinoUV ) . I livelli proteici negli estratti proteici del plasma e del tessuto cutaneo sono stati misurati utilizzando pannelli di analiti definiti LEGENDplex Mouse Inflammation Panel e Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend).

IF Colorazione di tessuti renali congelati.Perfuso con soluzione salinarenisono stati fissati in paraformaldeide al 4% per 1 ora a temperatura ambiente e, dopo l'immersione in saccarosio al 30%, congelati in un mezzo di taglio ottimale (Sakura Finetek). Le sezioni di tessuto 5-μm sono state reidratate in PBS prima della colorazione IF. I tessuti sono stati permeabilizzati con 0,1% Triton X-100 in PBS e successivamente bloccati in PBS più 0,1% Triton X-100/5% BSA (albumina di siero bovino)/5% siero di coniglio . Le cellule NE ed endoteliali sono state rilevate mediante colorazione con NE Cy5 anti-topo (1:100, Bioss) e PECAM{17}}/CD31 Al488 anti-topo (1:100, Bioss), rispettivamente, a 4 gradi durante la notte. Presenza di neutrofili nelreneè stato confermato mediante colorazione con Ly6G Al647 anti-topo (1:100, Biolegend). I tessuti sono stati montati utilizzando ProLong Gold con mezzo di montaggio 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (Invitrogen) e fotografati con microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 90i (Histology and Imaging Core, University of Washington).

Valutazione istologica della pelle.Le sezioni di tessuto cutaneo fissate in formalina e incluse in paraffina (da 4 a 5 μm) sono state colorate con ematossilina ed eosina presso l'Università di Washington Histology and Imaging Core prima dell'UV, giorno 1, giorno 2 e giorno 6 dopo l'irradiazione UVB (n {{ 7}} femmine). La pelle è stata valutata in cieco per i seguenti parametri: infiammazione del derma/sottocutaneo, morte delle cellule epidermiche, acantosi, ipercheratosi, formazione di crosta sierocellulare ed erosione/ulcerazione. Questi parametri sono stati valutati su una scala da 0 a 4 a seconda della gravità e dell'estensione, ad eccezione dell'erosione/ulcerazione, che è stata valutata come presente (1) o assente (0). Le immagini rappresentative sono state scattate utilizzando NIS-Elements BR 3.2 64bit e placcate in Adobe Photoshop con regolazioni dell'illuminazione applicate all'intera immagine. Viene indicato l'ingrandimento originale.

Misurazioni delle urine.I livelli di proteine ​​urinarie sono stati valutati mediante il test delle proteine ​​Bradford (Thermo Fisher Scientific). I campioni di urina sono stati testati con una diluizione 1:40 in PBS e la concentrazione di proteine ​​nelle urine è stata determinata sulla base di diluizioni seriali di concentrazioni note di BSA. Il rapporto albumina/creatinina nelle urine è stato valutato utilizzando il test dell'albumina di Albuwell e il kit Creatinine Companion (Exocell) secondo le istruzioni del produttore.

Raccolta di campioni umani e analisi della citometria a flusso.Questo studio è stato approvato dall'Università di Washington Institution Review Board (STUDY00001145). Il sangue intero è stato raccolto in provette eparinizzate da volontari sani e pazienti con LES previo consenso informato. Neutrofili (PMN) e PBMC sono stati isolati mediante separazione a gradiente discontinuo Ficoll-Paque (GE Healthcare). I PMN sono stati purificati dal pellet di eritrociti mediante sedimentazione di destrano al 5%. Dopo la lisi dei globuli rossi, le cellule sono state colorate con anticorpi marcati in modo fluorescente acquistati da Biolegend e l'espressione di CXCR4 e la percentuale di cellule ICAM1hiCXCR1lo sono state valutate in PMN (CD66b plus) e LDG (CD15 plus, CD14lo e CD10 plus in PBMC (19)). La strategia di gating per LDG e colorazione ICAM1hiCXCR1lo basata su FMO è mostrata nell'appendice SI, Fig. S11. I campioni sono stati elaborati utilizzando il citometro a flusso CytoFLEX (Beckman Coulter) e i dati sono stati analizzati con il software FlowJo versione 10 (Tree Star).

Analisi statistiche.I dati sono stati analizzati utilizzando il software GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.) e presentati come media ± SEM. La differenza statistica tra i due gruppi di dati è stata determinata rispetto ai controlli non irradiati (D-1) utilizzando il test di Student. Per determinare la significatività statistica tra i tre gruppi è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale con confronti multipli e Tukey post hoc.