Invecchiamento e longevità sono sempre stati argomenti seducenti per gli organismi. Come tipo di cellula staminale adulta con capacità di auto-rinnovamento

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Astratto:La senescenza nelle cellule staminali mesenchimali (MSC) non solo ostacola l'applicazione delle MSC nella medicina rigenerativa, ma è anche strettamente correlata all'invecchiamento biologico e allo sviluppo di malattie degenerative. In questo studio, abbiamo studiato gli effetti anti-invecchiamento della curcumina (Cur) sulle MSC (cBMSCs) derivate dal midollo osseo canino e abbiamo ulteriormente chiarito il potenziale meccanismo d'azione basato sulla modulazione dell'autofagia. I cBMSC sono stati ampliati in vitro con procedure standard per costruire un modello cellulare di senescenza prematura.cistance dosaggio redditLa nostra evidenza indica che rispetto al terzo passaggio di cBMSC, molti fenotipi tipici associati alla senescenza sono stati osservati nel sesto passaggio di cBMSC. Il trattamento con Cur può migliorare la sopravvivenza di cBMSC e ritardare la senescenza di cBMSC secondo le osservazioni che il trattamento con Cur(1 uM) può migliorare l'efficienza dei fibroblasti (CFU-Fs) formanti colonie e sovraregolare l'espressione dell'mRNA di fattori di trascrizione pluripotenti (SOX{{5} } e Nanog), oltre a inibire le attività della beta-galattosidasi (SA- -gal) associate alla senescenza e l'espressione di mRNA dei marcatori correlati alla senescenza (pl6 e p21) e delle molecole pro-infiammatorie (fattore di necrosi tumorale- (TNF-a) e interleuchina-6(IL-6)). Inoltre, è stato osservato che Cur（0.1 uM~10μM） aumenta l'attività autofagica, come identificato dalla sovraregolazione della catena leggera 3 della proteina 1 associata ai microtubuli (LC3), unc51-come la chinasi che attiva l'autofagia -1 (ULK1), gene correlato all'autofagia (Atg)7 e Atg12 e la generazione del tipo II della catena leggera 3(LC3-II), aumentando così i vacuoli autofagi e gli organelli vescicolari acidi, come oltre a causare una significativa diminuzione del livello di proteina p62. Inoltre, è stato scoperto che l'attivatore dell'autofagia rapamicina (RAP) e Cur migliorano parzialmente le caratteristiche senescenti delle cBMSC, mentre è stato dimostrato che l'inibitore dell'autofagia 3-metiladenina(3-MA) aggrava la senescenza delle cBMSC e il trattamento con Cur è stato in grado di ripristinare l'autofagia soppressa e contrastare la senescenza cBMSC 3-indotta da MA. Quindi, il nostro studio evidenzia l'importante ruolo dell'autofagia indotta da Cur e i suoi effetti sul miglioramento della senescenza cBMSC e fornisce nuove informazioni per ritardare la senescenza e migliorare il potenziale terapeutico delle MSC.

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Parole chiave:curcumina;senescenza; autofagia; cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo canino

1. Introduzione

L'invecchiamento e la longevità sono sempre stati argomenti seducenti per gli organismi. Come tipo di cellula staminale adulta con capacità di auto-rinnovamento, immunosoppressione, differenziazione e migrazione, le cellule staminali mesenchimali (MSC) risiedono ampiamente all'interno di vari tessuti e organi, come midollo osseo, tessuto adiposo, liquido amniotico, placenta, ombelico cordone ombelicale e muscolare [1,2], e svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi dei tessuti per tutta la durata della vita di un organismo [3,4]. L'evidenza accumulata ha rivelato che l'invecchiamento biologico e lo sviluppo di molte malattie degenerative possono attribuire alla senescenza delle MSC [5,6]. Inoltre, le MSC sono promettenti fonti di terapia rigenerativa basata sulle cellule, ma di solito devono essere ampliate in vitro per raggiungere il numero minimo di trapianto di MSC (20-100 milioni) per i trattamenti [7]. Tuttavia, la coltura in vitro non è in grado di simulare completamente il microambiente in vivo delle MSC e inevitabilmente innesca la senescenza cellulare [8,9] La senescenza nelle cellule mitotiche si verifica in risposta a una varietà di fattori di stress, come la disfunzione dei telomeri [10], il DNA danno [11], stress ossidativo [12] e attivazione dell'oncogene [13] e, infine, porta alla cessazione della divisione cellulare. Inoltre, le MSC senescenti mostrano un effetto negativo sulle funzioni biologiche, inclusa l'immunomodulazione, la differenziazione e la migrazione [14]. Molto lavoro ha tentato di stabilire strategie efficaci per ritardare la senescenza nelle MSC. Recentemente, sono stati suggeriti diversi prodotti derivati ​​dalle erbe per promuovere la salute e la longevità dell'organismo e potrebbero essere strumenti promettenti per ritardare la senescenza delle MSC [15].

Cistanche può antietà

La curcumina (Cur), un polifenolo idrofobo estratto dalla curcuma della medicina tradizionale cinese, ha attirato grande attenzione grazie ai suoi effetti antinfiammatori, antiossidanti, antiapoptotici, antitumorali e antietà nelle cellule dei tessuti e in alcuni modelli di malattie [{ {4}}]. Numerosi studi hanno dimostrato che Cur ha benefici per la salute nelle malattie legate all'età, comprese le malattie osteoarticolari, neurologiche, riproduttive e cardiovascolari [20-24]. L'invecchiamento è associato a cambiamenti muscolo-scheletrici e all'inizio e alla progressione di malattie osteoarticolari. È stato riscontrato che l'intervento dietetico cronico con Cur migliora la funzione motoria della mano e delle dita nelle scimmie di mezza età e ha effetti benefici sul muscolo scheletrico invecchiato [25,26]. I dati disponibili di Buhrmann e colleghi hanno rivelato che il Cur può attenuare l'osteoartrosi di origine ambientale bilanciando la sopravvivenza dei condrociti e le risposte infiammatorie [27,28]. Inoltre, Cur esercita effetti neuroprotettivi mediando l'autofagia e l'infiammazione e può quindi essere una terapia efficace per i pazienti con malattie neurodegenerative, come il morbo di Alexander, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson [29,30].

Infatti, il fatto che Cur possieda attività pleiotropica potrebbe essere attribuito ai loro effetti di attivazione e protezione sulle MSC [31,32]. Diversi studi hanno confermato che Cur è coinvolto nella regolazione delle capacità immunomodulatorie; il potenziale differenziale delle MSC rispetto a diversi lignaggi cellulari (neurociti, condrociti, adipociti e osteoblasti) e in molteplici meccanismi di segnalazione è coinvolto in questo processo [2831,{3}}]. Inoltre, Cur è anche considerato un buon antiossidante con cui migliorare la durata della vita delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratto (ADSC) a causa dell'aumento dell'espressione genica della trascrittasi inversa della telomerasi (TERT) [36]. Uno studio recente ha dimostrato che l'inibizione di p65 da parte di Cur può prevenire la senescenza cellulare e l'attivazione infiammatoria nelle MSC derivate dal cordone ombelicale umano [37].Benefici dell'estratto di cistancheOvviamente, maggiore attenzione è stata concentrata sugli effetti antietà del Cur nelle MSC a causa del loro enorme potenziale terapeutico, ma i meccanismi alla base di questo effetto non sono ancora chiari. Alcune evidenze provenienti da studi in vitro hanno confermato che gli effetti benefici esercitati da Cur dovrebbero essere attribuiti alla sua modulazione dell'autofagia [29,38-41]. Han e colleghi hanno dimostrato che Cur può proteggere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) dal danno ossidativo indotto da H2O2- e che gli effetti positivi si verificano attraverso il potenziamento dell'autofagia tramite il fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)/Akt/ inibizione del bersaglio della rapamicina (mTOR) nei mammiferi [40]. Un altro studio ha mostrato che Cur è in grado di promuovere la sopravvivenza cellulare inibendo l'apoptosi indotta da ipossia/riossigenazione (H/R) e l'eccessiva autofagia tra i cardiomiociti [41]. Pertanto, se Cur si comporta come un regolatore positivo o negativo dell'autofagia dipende dallo stimolo che produce stress e dall'impostazione cellulare e sono necessari maggiori dettagli per determinare se la modulazione dell'autofagia da parte di Cur è una strategia efficace per ritardare la senescenza MSC. Come principio del percorso di degradazione e riciclaggio delle sostanze intracellulari, l'autofagia svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi cellulare e nella resistenza alla pressione ambientale e ha mostrato l'enorme potenziale per ritardare la senescenza cellulare e curare le malattie legate all'età. La disfunzione degli organelli e l'accumulo di metaboliti tossici sono le caratteristiche chiave delle MSC senescenti [42], suggerendo così un potenziale legame tra autofagia e senescenza. Ma e colleghi hanno scoperto che l'attività autofagica dei BMSC invecchiati era ridotta rispetto ai BMSC giovani e che l'inibitore dell'autofagia 3-metiladenina (3-MA) poteva accelerare la senescenza nei giovani MSC; al contrario, hanno scoperto che l'attivatore dell'autofagia rapamicina (RAP) potrebbe ripristinare parzialmente le proprietà biologiche dei BMSC invecchiati[5]. Uno studio recente ha esaminato il ruolo dell'autofagia modulata attraverso l'impiego di RAP e 3-MA nella senescenza di MSC indotta da D-galattosio (D-gal) e ha mostrato che RAP ha notevolmente alleviato la senescenza di MSC [43]. È interessante notare che diversi studi hanno dimostrato che si osserva un aumento dell'autofagia nelle MSC senescenti e che l'autofagia è indispensabile per mantenere i processi di senescenza delle MSC [44,45]. Pertanto, se l'autofagia possa essere considerata un regolatore positivo o negativo della senescenza nelle MSC rimane conflittuale e ambiguo. Di conseguenza, sarebbe interessante studiare la relazione tra autofagia, senescenza delle MSC e Cur, che potrebbe fornire una prospettiva più ampia per ritardare la senescenza e migliorare il potenziale terapeutico delle MSC.

In questo studio, il nostro scopo principale era chiarire se il trattamento con Cur potesse ritardare la senescenza MSC(cBMSC) derivata dal midollo osseo canino e se il meccanismo sottostante fosse correlato alla modulazione dell'autofagia. A tal fine, abbiamo valutato la caratterizzazione fenotipica, l'attività autofagica e l'espressione genica dopo l'esposizione a Cur in cBMSC senescenti, nonché se la relazione tra l'autofagia e i suoi effetti sulla senescenza dei cBMSC è determinata utilizzando 3- MA e RAP .

2. Risultati

2.1. Caratteristiche dei cBMSC

Le cBMSC sono state espanse in vitro con procedure standard e hanno dimostrato di essere trasmesse stabilmente per nove generazioni (dati non mostrati). I cBMSC hanno mostrato un aspetto aderente alla plastica e simile a un fibroblasto durante tutto il processo di coltura (Figura 1A). La capacità di differenziazione dei cBMSC è stata confermata dall'induzione adipogenica e osteogenica (Figura 1B, C). L'immunofenotipo di cBMSCs è stato valutato mediante citometria a flusso. I risultati hanno mostrato che la popolazione cellulare esprimeva positivamente CD90, CD105 e ITGB1 ed esprimeva negativamente CD31, CD34 e CD45, suggerendo la loro origine mesenchimale piuttosto che ematopoietica (Figura 1 e Tabella 1).

2.2.cBMSCs Visualizza progressivamente le caratteristiche senescenti lungo l'espansione in vitro

I cBMSC di primo passaggio (P1 e P3) mostrano una lunga forma fusiforme o triangolare e sono disposti in un vortice dopo la crescita in vitro (Figura 2A). Successivamente, i cBMSC hanno gradualmente mostrato fenotipi associati alla senescenza nel corso della coltivazione a lungo termine in vitro, caratterizzati da una morfologia allargata e piatta e da una riduzione della proliferazione (Figura 2A, B). Inoltre, i risultati di un'analisi del fibroblasto unitario (CFU-F) che formano colonie hanno mostrato che sia il numero di CFU-F che la dimensione delle colonie erano significativamente diminuiti lungo i passaggi di coltura (Figura 2C), coerentemente con l'mRNA sottoregolato espressione di fattori di trascrizione pluripotenti Nanog e SOX-2 nel 6° e 9° passaggio (Figura 2G).

La galattosidasi associata alla senescenza (SA- -gal) è un enzima lisosomiale la cui attività è fortemente correlata alla senescenza cellulare [46]. I risultati della colorazione con SA- -gal hanno indicato che il numero di cellule SA- -gal positive è cresciuto dal 7,5 ± 2,4 percento (P3) a 65.0 ±5.0 percento (P6) e 87,3 ± 3,3 percento (P9), rispettivamente (Figura 2D).cistanche gengis khanInoltre, sono stati rilevati aumenti dell'espressione degli inibitori della chinasi del ciclo cellulare (p21 e p16) e delle molecole pro-infiammatorie (TNF- e IL-6), che agiscono come componenti di un fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP). nel 6° e 9° passaggio (Figura 2E, F). Pertanto, i cBMSC mostrano un aumento dipendente dal passaggio dei fenotipi senescenti e cessano la proliferazione al 9° passaggio.

2.3. Cur allevia lo stato senescente di cBMSCs

Le cBMSC di 6° passaggio sono state incubate in assenza o in presenza di Cur a dosi di 0.1,0.5,1,5 o 10μmol/mL（μM） per 12 ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore e la loro vitalità cellulare è stata valutata utilizzando CCK-8. I risultati hanno mostrato che Cur (0.1-10 uM) non induce un effetto tossico nei cBMSC e ha effetti palpabili sull'aumento della vitalità dei cBMSC dopo 24 ore di trattamento (Figura 3A). Per valutare l'effetto di Cur sulla senescenza cellulare, i cBMSC sono stati esposti a diverse concentrazioni di Cur (0,1,1 e 10 uM) per 24 ore. Il risultato ha mostrato che il numero di cellule SA- -gal-positive era significativamente ridotto nelle cBMSC dopo il trattamento con Cur (1 μM e 10 uM) rispetto al gruppo di controllo (Figura 3B). I saggi CFU-F sono stati utilizzati per valutare gli effetti di Cur sull'efficienza di auto-rinnovamento di cBMSCs(P6). La dose di 1 uM di Cur è risultata essere la concentrazione più efficace per migliorare l'efficienza della CFU-F delle cBMSC. Tuttavia, la dose di 10 μM di Cur ha avuto effetti negativi sull'efficienza di auto-rinnovamento dei cBMSC (Figura 3C). Inoltre, l'effetto di riduzione della senescenza di Cur è stato osservato a una dose di 1 μM, manifestato dalla downregulation di p16, IL-6 e TNF- e sovraregolazione dell'espressione di Nanog e SOX-2 (Figura 3D-F).prolungamento della vita delle cistancePresi insieme, questi risultati indicano che Cur a una dose di 1 uM può esercitare efficacemente effetti citoprotettivi sui cBMSC senescenti.

2.4. Cur Treatment ha migliorato l'attività autofagica nei cBMSC

L'attivazione funzionale del lisosoma gioca un ruolo critico nel corso dell'autofagia e i disturbi dell'acidificazione lisosomiale sono avversi alla funzione di degradazione lisosomiale [38]. Pertanto, l'attività autofagica è stata rilevata per la prima volta dalla colorazione LysoTracker, che può monitorare l'acidificazione lisosomiale. Il risultato ha indicato che il precondizionamento con Cur ha aumentato in modo dose-dipendente l'intensità della fluorescenza rossa nei cBMSC, il che ha suggerito che l'acidificazione del lisosoma era stata aumentata (Figura 4D).

Per valutare ulteriormente gli effetti di Cur sull'autofagia delle cBMSC, abbiamo utilizzato i marcatori dell'autofagosoma proteina 1A/1Belight chain 3 (LC3) e p62/SQSTM1 associati ai microtubuli, che sono marcatori fondamentali per la valutazione del flusso autofagico[47,48 ]. L'aumento dell'attività autofagica è stato osservato nei cBMSC dopo l'esposizione a Cur, come dimostrato da un aumento dose-dipendente della conversione di LC{{10}}I in LC3-II, insieme all'accelerazione di p62 degradazione (Figura 4A). Inoltre, l'espressione di mRNA di ATG7, ATG12.LC3. e ULK1 sono stati sovraregolati dopo il trattamento con Cur (Figura 4B). L'ultrastruttura dei cBMSC è stata esaminata mediante microscopia elettronica a trasmissione. Abbiamo quindi osservato un aumento della formazione di autofagosomi e autolisosomi nei cBMSC dopo il trattamento con Cur a dosi di 0,1, 1 e 10 μM per 24 h (Figura 4C).cistanche nzLa colorazione dell'immunofluorescenza ha anche mostrato che il numero di caratteristici punti fluorescenti puntati di LC3 è stato significativamente aumentato dal trattamento con Cur (Figura 4E). Questi risultati hanno indicato che Cur può promuovere l'acidificazione lisosomiale e l'attivazione dell'autofagia in modo dose-dipendente.

Questo articolo è estratto da Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms