La medicina rigenerativa si è recentemente sviluppata come campo emergente

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Astratto:In precedenza abbiamo riportato che le cellule staminali derivate dal liquido amniotico c-KIT più htaman ottenute da campioni rimanenti della diagnosi prenatale di routine Ⅱ trimestre (hAFS fetale) sono dotate di potenziale paracrino rigenerativo che guida effetti pro-sopravvivenza, anti-fibrotici e proliferativi. have può anche essere isolato da campioni di rifiuti clinici del III trimestre durante i tagli cesarei programmati (hAFS perinatale), offrendo così un'alternativa più facilmente accessibile rispetto all'hAFS fetale. Tuttavia, poco si sa sul profilo paracrino di hAFS perinatale. Qui forniamo una caratterizzazione dettagliata del secretoma totale di hAFS (cioè, la totalità dei fattori paracrini solubili rilasciati dalle cellule nel mezzo condizionato, hAFS-CM) e le vescicole extracellulari ( hAFS-EVs) al suo interno, da cellule perinatali fetali del Ⅱtrimestre rispetto al III trimestre. Le hAFS fetali e perinatali sono state caratterizzate e soggette a precondizionamento ipossico per aumentare il loro potenziale paracrino. Le formulazioni di hAFS-CM e hAFS-EV sono state analizzate per il contenuto di proteine ​​e chemochine/citochine e il carico di EV è stato ulteriormente studiato mediante il sequenziamento dell'RNA. Il fenotipo di hAFS fetale e perinatale, insieme alle corrispondenti formulazioni di secretoma, si sovrapponeva; tuttavia, le hAFS fetali hanno mostrato un'attività di fosforilazione ossidativa immatura rispetto a quelle perinatali. La profilazione del loro carico paracrino ha rivelato alcune differenze in base alla fase gestazionale e al precondizionamento ipossico. Entrambe le fonti cellulari hanno fornito formulazioni arricchite con fattori neurotrofici, immunomodulatori, antifibrotici ed endoteliali e il secretoma fetale immaturo di hAFS è stato definito da un profilo pro-vasculogenico, rigenerativo, pro-risolvente e anti-invecchiamento più pronunciato. Il profilo del piccolo RNA ha mostrato l'arricchimento del microRNA nel carico hAFS-EV sia fetale che perinatale, con un nucleo pro-risolutivo espresso in modo stabile come firma molecolare di riferimento. Qui confermiamo che hAFS rappresenta un'interessante fonte di fattori paracrini rigenerativi; la scelta di formulazioni di secretoma hAFS fetale o perinatale per la futura terapia paracrina dovrebbe essere valutata considerando lo scenario clinico specifico.

Parole chiave:liquido amniotico; cellule staminali; effetti paracrini; vescicole extracellulari; mezzo cellulare; chemochina; citochine; proteomica; sequenziamento dell'RNA; microRNA

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1. Introduzione

La medicina rigenerativa si è recentemente sviluppata come un campo emergente per fornire il ripristino funzionale del tessuto danneggiato mediante diverse strategie. Poiché gli approcci di ingegneria tissutale sono notevolmente avanzati negli ultimi anni, l'indagine sugli effetti paracrini delle cellule staminali si è contemporaneamente sempre più intensificata. È stato ampiamente dimostrato che il potenziale terapeutico delle cellule staminali trapiantate è principalmente mediato dai loro fattori solubili secreti, che possono orchestrare un microambiente pro-rigenerativo nel tessuto ospite mentre innescano l'attivazione di meccanismi endogeni di recupero funzionale [1,2]. Pertanto, la cellula staminale secretoma, la totalità delle molecole trofiche paracrine rilasciate dalle cellule, così come le vescicole extracellulari legate alla membrana, sono state sempre più proposte come medicinale terapeutico innovativo da molteplici studi preclinici indipendenti che hanno come obiettivo cardiovascolare, neurologico e/o infiammatorio patologia. Di conseguenza, le cellule staminali possono essere concepite come fabbriche biologiche per lo sfruttamento del loro secretoma terapeutico offrendo trattamenti rigenerativi pronti per l'uso e pronti all'uso. Applicando una tale strategia basata sulle cellule, ma priva di cellule, molti aspetti limitanti associati alla terapia cellulare canonica possono essere superati, garantendo comunque effetti benefici.cos'è una cistancheIn questa prospettiva, le cellule mesenchimali stromali (MSC) sono state ampiamente testate come potenziali cellule candidate? Infatti, le MSC e le cellule staminali/progenitrici sono state ingegnerizzate e/o stimolate da diverse strategie di precondizionamento per aumentare la loro capacità rigenerativa e il potenziale secretorio [3,4] con un esplicito interesse per la rilevanza biologica delle loro vescicole extracellulari (EVs) secrete.

Gli EV sono particelle di dimensioni nanometriche delimitate da un doppio strato lipidico e secrete attivamente da tutti i tipi di cellule. I veicoli elettrici includono molto piccoli (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); operano come trasportatori biologici critici di segnalazione intercellulare consegnando il loro carico molecolare da una cellula parentale a una cellula rispondente/bersaglio [5,6]. Dato che il loro peculiare potenziale paracrino nell'esercitare effetti benefici è paragonabile alle loro cellule di origine, le cellule staminali EV sono emerse come opzioni terapeutiche interessanti in modelli preclinici di malattie, come ischemia, infiammazione o lesioni, come ampiamente rivisto in [{{3 }}]. Da una prospettiva traslazionale, oltre al potenziale modulatorio cellulare, la fattibilità dell'isolamento e l'elevato auto-rinnovamento sono aspetti chiave della fonte ideale di veicoli elettrici terapeutici e fattori solubili. In tale scenario, le MSC fetali e perinatali possono offrire un'opzione interessante dato il loro potenziale proliferativo e il profilo evolutivamente immaturo con caratteristiche intermedie tra progenitori somatici embrionali e adulti [10,11]. Le MSC fetali possono essere isolate dagli annessi extra-embrionali durante la gestazione come campioni rimanenti ottenuti durante lo screening prenatale (cioè villi coriali [12-14] e liquido amniotico [15,16]) o ottenuti come progenitori perinatali alla nascita, da materiale di scarto clinico (ovvero membrane amniotiche e placentare [17-21], componenti del cordone ombelicale [22-24] e liquido amniotico a termine [25,26]).

Cistanche può antietà

In particolare, le cellule staminali del liquido amniotico umano (hAFS) sono state evidenziate come strategie terapeutiche promettenti nella medicina rigenerativa. e hanno dimostrato di essere ampiamente multipotenti in vitro e in vivo [16,27,28], contribuiscono al lignaggio ematopoietico dopo il trapianto in utero [29] e si innestano negli organi feriti mentre esercitano effetti immunomodulatori [26,30] e attivano risposte riparative endogene, come ampiamente descritto in [31]. Il nostro team e altri hanno ulteriormente dimostrato che hAFS rilascia un secretoma altamente arricchito con molecole trofiche bioattive in grado di colpire diversi meccanismi riparativi. È stato riportato che i fattori paracrini hAFS forniscono stimoli pro-sopravvivenza con l'estinzione dell'infiammazione [32], forniscono cardioprotezione contro l'ischemia prolungata [33.34] e la cardiotossicità [35] e stimolano l'angiogenesi locale con il rientro del ciclo cellulare dei cardiomiociti. 34,36]. Poiché è stato dimostrato che la maggior parte di questi effetti viene ricapitolata dalla sola somministrazione di hAFS-EV, studi indipendenti si sono concentrati sull'analisi del loro profilo rigenerativo rispetto a diversi background patologici, tra cui danno del muscolo scheletrico e cardiaco, malattie renali, osteoartrite, osteoporosi, enterocolite necrotizzante e neurodegenerazione modelli [34,{18}}].

Sebbene l'evidenza possa supportare la traduzione clinica di hAFS-EV per la futura terapia paracrina, è importante considerare che la maggior parte di questi studi ha principalmente studiato il potenziale modulatorio dell'hAFS fetale ottenuto durante lo screening prenatale del Ⅱ trimestre In effetti, un profilo completo del secretoma da la controparte perinatale (cioè dal taglio cesareo del III trimestre) non è stata ancora esplorata in dettaglio. Le hAFS perinatali del terzo trimestre hanno mostrato proprietà regolatorie immunitarie distintive rispetto a quelle del primo e del II trimestre [26], pur mantenendo un rilevante potenziale rigenerativo endoteliale [25].quanta cistanche prendereDa notare, il recente rapporto sulla morfologia eterogenea delle hAFS fetali[45] ha fornito nuove informazioni sulla loro staminalità e sul profilo di espressione genica.bioflavonoidiCiò ha complessivamente gettato nuova luce sul valore rigenerativo delle diverse frazioni cellulari di hAFS[46]. Quindi, la caratterizzazione completa delle diverse sottopopolazioni di hAFS sta attirando una crescente attenzione. In precedenza abbiamo riportato che una stimolazione ipossica e priva di siero di 24 ore rappresenta una strategia efficace per aumentare il potenziale paracrino di hAFS fetale Ⅱ trimestre [34,35,37]. Poiché si sa poco sulla composizione del secretoma del terzo trimestre hAFS, qui riportiamo il confronto completo di Ⅱ rispetto a Ⅲ trimestre hAFS e le loro frazioni di secretoma (compresi i cappelli-EV), al fine di affrontare l'influenza dello stadio gestazionale e delle cellule ipossiche precondizionamento sulle caratteristiche della cellula e del secretoma.

2. Risultati

2.1.HaFS perinatale Presentare una corrispondenza fenotipica ravvicinata con l'ha fetale

Nessuna differenza statisticamente rilevante è stata apprezzata nell'età del donatore tra i campioni di liquido amniotico del trimestre fetale II e del terzo trimestre perinatale. c-KIT* hAFS fetale (f-hAFS da campioni di liquido amniotico del II trimestre) e c-KIT* hAFS perinatale (p-hAFS da rifiuti clinici di liquido amniotico del III trimestre) hanno confermato caratteristiche simili con morfologia simile a un fibroblasto e ovale-rotonda (Figura 1A) e fenotipo stromale mesenchimale (dati non mostrati), come precedentemente riportato [16,25]. Sia f-hAFS che p-hAFS coltivati ​​in vitro fino al passaggio 5 hanno mostrato livelli trascurabili di senescenza dall'attivazione della- -galattosidasi (SA- -Gal) associata alla senescenza in circa il 4% delle cellule (Figura 1B) . Sia f-hAFS che p-hAFS hanno presentato un alto livello di co-espressione dei marcatori mesenchimali CD107a e CD146, che sono stati recentemente segnalati per definire un fenotipo altamente secretorio[47]. Le cellule CD107at CD146* rappresentavano la maggioranza della popolazione f-hAFS (circa il 64%,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Figura 1. Il feto e il perinatale hanno una valutazione fenotipica. (A) Immagini rappresentative di hAFS fetale (f-hAFS, pannello di sinistra) e hAFS perinatale (p-hAFS, pannello di destra) coltivate in vitro in condizioni standard; barra della scala: 200 um. (B) Analisi del marcatore senescente beta-galattosidasi (SA- -Gal, in blu) tramite colorazione citochimica su f-hAFS e p-hAFS dopo 5 passaggi in coltura; le immagini rappresentative sono riportate nel pannello di sinistra, barra della scala: 200 um. La percentuale corrispondente di cellule/campo -Gal-positivi è riportata nel grafico nel pannello di destra (f-hAFS:4,12±0,58 percento e p-hAFS:3,88±2,10 percento ;p=0.1424,n{ {24}} esperimenti). (C) Immunofenotipo di hAFS che esprimono marcatori mesenchimali CD146 e CD107a. Grafici rappresentativi di citometria a flusso di f-hAFS e p-hAFS (pannello di sinistra) e valori corrispondenti riferiti a CD107a doppio positivo più CD146 più cellule; CD107a più CD146* f-hAFS:63,68±5,82 percento,*p{38}}.016 rispetto al restanteg36,32±5,82 percento f-hAFS (Altro);CD107at CD146 più p-hAFS:52,07±6,76% con restante47. 93±56,76% p-hAFS (altro); CD107a più CD146 più f-hAFS vs CD107a più CD146 più p-hAFS p=0.2403,n{65}} esperimenti. Altro: importo totale rimanente di CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS e CD107at CD146-hAFS. Tutti i valori sono espressi come media ± sem di esperimenti indipendenti. SA- -Gal: galattosidasi associata alla senescenza- -.

2.2. L'hAFS fetale mostra un metabolismo diverso dall'hAFS perinatale

Per valutare se la fase gestazionale può influenzare il metabolismo mitocondriale, f-hAFS e p-hAFS sono stati analizzati in condizioni di coltura in vitro standard mediante analisi biochimiche. La valutazione del metabolismo aerobico ha mostrato che il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e la sintesi di ATP erano inferiori in f-hAFS rispetto a p-hAFS, entrambi quando stimolati con piruvato più malato (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Il precondizionamento ipossico non influisce sulla vitalità fetale e perinatale e sostiene la loro attività secretoria

Al fine di definire le formulazioni del secretoma di hAFS, le cellule sono state coltivate in condizioni prive di siero per evitare qualsiasi contaminazione da FBS. In precedenza abbiamo dimostrato che 24 ore senza siero (SF) e condizioni di coltura ipossica all'1% di O2 non hanno alterato in modo significativo la vitalità di Ⅱtrimestre fetale hAFS (f-speranza), mentre hanno supportato il rilascio di fattori paracrini rigenerativi nel loro mezzo condizionato dalle cellule (hAFS-CM) e nelle vescicole extracellulari (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Qui, oltre a profilare per la prima volta le frazioni di secretoma p-hAFS, abbiamo valutato se p-ha presentato un comportamento simile nello stesso regime di precondizionamento, utilizzando la condizione di coltura normossica come controllo. La vitalità di f-hAFS e p-hAFS è stata analizzata dopo 24 h nelle seguenti impostazioni: condizione normossica (20 percento di O2) nel mezzo di coltura di controllo completo (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo e Ctrl p-hAFSnormo), una condizione normossica nel mezzo SF (SF f-hAFSnormo e SF p-hAFSnormo), condizione ipossica (1 percento di O2) nel mezzo di controllo completo (Ctrlf-ha hypo e Ctrl p-hAFSnypo) e condizione ipossica nel mezzo SF (SF f-ha hypo e SF p -ha ipo, Figura 3A). Abbiamo confermato che la vitalità di f-ha era inalterata sia in condizioni Ctrl che SF e sotto stimolazione ipossica, con oltre l'80 percento (fino a quasi l'88 percento) delle cellule totali inalterate. Le cellule apoptotiche precoci e tardive variavano da ca. Dal 13% al 18% in condizioni di SF, senza alcuna rilevanza statisticamente significativa. Allo stesso modo, la vitalità perinatale era nell'intervallo del 80-92 percento e le cellule apoptotiche precoci e tardive rappresentavano fino al 18 percento in condizioni di SF. p-hAFS è stato marginalmente influenzato solo nelle condizioni combinate ipossiche e SF; infatti, mentre il precondizionamento non ha influenzato la sopravvivenza cellulare quando p-hAFS è stato coltivato in un mezzo completo, la corrispondente condizione SF ha mostrato un aumento di ca. 4-piega (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Figura 2. Caratterizzazione metabolica dell'AFS fetale e perinatale. (A) Tasso di consumo di ossigeno (OCR), sintesi di ATP tramite F1-F.ATP sintasi e rapporto P/O in f-ave e-have in presenza di piruvato più malato (P/M) o succinato (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustraliaIl confronto della percentuale di inibizione della sintesi di OCR e ATP in f-e-hAFS dovuta agli inibitori sopra indicati è riportato nel pannello inferiore B. Per gli esperimenti OCR: hAFS più Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Abbiamo quindi valutato la resa delle frazioni di secretoma ottenute da f-hAFS rispetto a p-hAFS in base all'arricchimento proteico. Il totale ha secretoma, come la totalità dei fattori paracrini secreti dalle cellule, è qui rappresentato dall'hAFS-CM. La concentrazione proteica di f-hAFS-CM e p-hAFS-CM nel mezzo SF dopo il precondizionamento delle cellule ipossiche rispetto alla condizione normossica di controllo come riferimento (vale a dire, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P ha-CMnormo e p -hAFS-CMHypo,) è stato valutato mediante saggio BCA e misurato secondo le cellule 10§.cistanciaI risultati acquisiti hanno suggerito che f-has-CM e p-hAFS-CM hanno mostrato un uguale andamento positivo nell'arricchimento proteico dopo il priming ipossico (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 cellule di grado; p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/1{72}} cellule di grado) rispetto alle loro controparti normossiche (f-hAFS-CMnormo: 105,50±19,89 ug/10 cellule di grado; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 gradi cellule） Allo stesso modo, la concentrazione proteica superficiale di hAFS-EVs è stata misurata in f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo e p-hAFS-EVShypo Gli EV hanno mostrato una resa comparabile quando ottenuti da f-hAFS o p-hAFS. Per quanto riguarda le formulazioni hAFS-CM, un trend positivo nell'aumento del contenuto proteico su f-hAFS-EVs e p-hAFS. Gli EV sono stati apprezzati dopo stimolazione ipossica nel corso del condizione normossica corrispondente (f-hAFS-EVSHypo∶2.03±0.67 ug/10 gradi cellule e p-hAFS-EVSHypo∶1.85±0.47 ug/10 gradi cellule; f-have-EVsnormo∶1.28±0.36ug/10 gradi cellule e p -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 celle di grado, Figura 3C).

2.4. Veicoli elettrici a rilascio di hAFS fetali e perinatali con morfologia e distribuzione dimensionale analoghe

L'analisi morfologica mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha accresciuto l'elevata proliferazione EV-secretoria sia di f-hAFS che di p-hAFS (Figura 4). Abbiamo ulteriormente studiato la dimensione e l'area di f-hAFS-EV e p-hAFS-EV (Figura 4B) dopo il precondizionamento ipossico rispetto al basale normossico. Fetale e perinatale hanno rilasciato EV di dimensioni eterogenee, nell'intervallo di 40-250 nm, quindi includendo sia esosomi/piccoli EV che microvescicole/vescicole che cadono. La dimensione media degli EV/campo nei diversi gruppi era comparabile, gli hAFS-EV fetali misuravano 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97,10±10,10 nm) e quelli perinatali misurati 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94,60±19,53 nm; p-hAFS-EVShypo:76,43±4.86 nm, Figura 4B, pannello di sinistra). Per quanto riguarda la resa, hAFS stimolato in ipossia ha mostrato un trend positivo nell'aumento della quantità di piccoli EV, sebbene questo aumento non fosse statisticamente significativo. f-hAFS-EVStypo ha misurato 40-70 nm che era quasi il doppio rispetto alla loro controparte normossica. Perinatal-has-EVSHypo che misurava 40-70 nm,70-100 nm e 100-130 nm erano quasi il triplo di quelli ottenuti nella coltura normossica (Figura 4B).

L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) ha mostrato un numero elevato di particelle sia nelle preparazioni f-hAFS-EV che p-hAFS-EV e ha confermato l'aumento degli EV nei campioni ipossici, come osservato anche dalle analisi precedenti (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'particelle/10 celle di grado; f-have-EVshypo: 3,30±0,22 × particelle di 10 gradi/celle di 10 gradi ; p-hAFS-EVsnormo: 2,43 ± 0,80 × particelle da 10 gradi/celle da 10 gradi; p-hAFS-EVshypo: particelle da 3,05 ± 0,62 × 10 gradi/celle da 10 gradi, Figura 4C).

Figura 4. Caratterizzazione morfologica di EV fetali e perinatali. (A) Immagini rappresentative della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di f-hAFS e p-hAFS (pannello superiore e inferiore sinistro, rispettivamente, con frecce nere che indicano corpi multi-vescicolari intracitoplasmatici con piccoli EV/esosomi al loro interno) e di f -hAFS-EV e p-hAFS-EV (rispettivamente pannello in alto e in basso a destra) rilasciati in condizioni prive di siero e in precondizionamento normossico rispetto a ipossico (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; e rispettivamente f-hAFS-EVshypo), barre della scala: 200 nm. (B) Pannello di sinistra: analisi TEM della distribuzione dimensionale di hAFS-EVs; pannello di destra: è stata considerata la distribuzione del numero f-hAFS-EV e p-hAFS-EV per intervalli di dimensioni del campo da 40 nm fino a 250 nm; i valori sono espressi come media±sem di n=3 esperimenti indipendenti. (C) Analisi di tracciamento delle nanoparticelle per le dimensioni e la distribuzione di hAFS. Pannello di sinistra: immagine rappresentativa dell'output grafico; pannello di destra: concentrazione di hAFS-EVs misurata come particelle di 10 gradi per cellule secernenti 10 gradi; nm: nanometro; ml: ml.

2.5. La caratterizzazione proteomica dell'hAFS fetale rispetto a quella perinatale evidenzia le differenze nella loro composizione del secretoma in base all'età gestazionale e al precondizionamento ipossico

La caratterizzazione proteomica di entrambe le formulazioni del secretoma f-hAFS e p-hAFS è stata eseguita per mezzo di una piattaforma senza etichetta di fucile, basata sull'accoppiamento di cromatografia liquida nano e spettrometria di massa ad alta risoluzione (nLC-HRMS). Quarantotto profili proteomici sono stati acquisiti dall'analisi duplicata di tre replicati biologici di hAFS-CM e hanno-EV da f-hAFS e p-hAFS sottoposti a precondizionamento delle cellule ipossiche rispetto alla condizione normossica come controllo. Un totale di 4179 distinti gruppi proteici sono stati identificati con almeno un peptide unico e con pesi molecolari compresi tra 2 e 3900 kDa e punti isoelettrici da 3,6 a 13. È stata osservata un'espressione proteica media più alta in hAFS-EV rispetto a hAFS-CM . L'allineamento di tutte le liste proteiche ottenute è stato effettuato sulla base delle proteine ​​identificate. Per ciascuna condizione sperimentale, è stato creato un elenco univoco che normalizza e calcola la media[50] dei valori di corrispondenza dello spettro peptidico (PSM) attribuiti alle proteine, che rappresentano il numero di spettri di massa assegnati a ciascuna e rappresentano indirettamente la loro abbondanza nei campioni. L'elenco completo delle proteine ​​identificate nelle formulazioni hAFS-CM e have-EV è riportato nella Tabella S1.

L'applicazione dell'analisi discriminante lineare (LDA[51]) su questo master list ha consentito l'estrazione di proteine ​​statisticamente significative (Fratio maggiore o uguale a 4,5 e** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 nelle formulazioni hAFS-CM e have-EV considerate separatamente. Mentre circa il 69,5% e il 69,9% delle proteine ​​erano condivise rispettivamente tra le condizioni hAFS-EV e hAFS-CM, il contenuto rimanente appariva esclusivo in proporzioni diverse, che vanno dal 3,7% al 13,4%, tra le formulazioni.

Per esaminare quantitativamente i cambiamenti proteomici, è stata eseguita un'analisi differenziale senza etichetta utilizzando il software MAProMa fatto in casa e applicando due algoritmi, DAve (Differential Average) e DCI (Differential Confidence Index, che rappresentano il rapporto e la fiducia nell'espressione differenziale, rispettivamente), sui PSM di ogni singola proteina tra i due termini confrontati. Utilizzando filtri rigorosi per DAve e DCI per massimizzare la sicurezza dell'identificazione e considerare le proteine ​​con una variazione maggiore di una variazione di piega di 1,5, confronti a coppie di f-hAFS-CM rispetto a p-hAFS-CM e di f-hAFS-EV rispetto a p-hAFS-EVs sono stati realizzati in base allo stadio gestazionale cellulare. Un totale di 58 e 109 proteine ​​sono state trovate espresse in modo differenziale nei compartimenti has-CM e have-EV sopra, rispettivamente (Figura S1B, C per dettagli selezionati e tabelle S{17}}S3 in forma estesa). Tra queste, 30 proteine ​​sono risultate sovraregolate in f-hAFS-CM e 28 erano sovraregolate in p-hAFS-CM (Figura S1B); allo stesso modo, 44 ​​proteine ​​​​distinte sono risultate sovraregolate in f-have-EV e 65 sono state sovraregolate in p-hAFS-EV (Figura S1C). In particolare, le proteine ​​che sono risultate sovraregolate in f-hanno sono da considerare sottoregolate in p-ha e viceversa.

i valori sono riportati; vedere la tabella S2 per l'elenco completo e i parametri dettagliati delle proteine ​​​​riportate. (C) Analisi dell'arricchimento dei processi biologici delle proteine ​​identificate con una frequenza di almeno 2 in hAFS-CM fetale (pannello di sinistra) e have-CM perinatale (pannello di destra) in base al precondizionamento ipossico cellulare. Sulla base dello strumento FunRich, i termini dell'ontologia genica sono mostrati in grafici a barre che riportano la percentuale di geni arricchiti per ciascuna categoria (barre rosa per-have-CMnormo, barre viola per f-hAFS-CMhypor barre azzurre per p-hAFS-CMnormo, e palline blu per p-hAFS-CMhypo).comprare cistancheSolo termini di ontologia genica con Bonferroni corretti con*p<0.05 are="">

Questo articolo è estratto da Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms