Dinamiche trascrizionali specifiche dell'alcol del riconsolidamento della memoria e della ricaduta Parte 4

Oltre ad Arc, abbiamo scoperto che i livelli di mRNA di Egr1, ma non di Bdnf, erano aumentati nel DH e nel mPFC mediante recupero della memoria dell'alcol.

Col passare del tempo, le persone acquisiscono gradualmente una nuova comprensione del mistero dell’oblio. In questo processo, una nuova tecnologia di recupero della memoria è gradualmente diventata un punto caldo della ricerca.

Quindi esiste una relazione tra il recupero della memoria dell’alcol e le prestazioni della memoria? Vieni a dare un'occhiata adesso! Prima di tutto, dobbiamo essere chiari: il recupero della memoria dell’alcol non è una tecnologia separata. È una tecnologia che colpisce i neuroni del cervello attraverso l’alcol. Questo processo può attivare alcuni ricordi "dormienti" nel cervello, permettendoci di rinfrescare questi ricordi.

In secondo luogo, dobbiamo sapere che il miglioramento della memoria non ci consente semplicemente di "ricordare" più cose, ma è un processo di recupero e ricostruzione dei ricordi in modi diversi. Questo processo può aiutarci a consolidare e comprendere meglio le conoscenze che abbiamo appreso, migliorando così la nostra memoria.

Pertanto, possiamo concludere che esiste una relazione tra il recupero della memoria dell’alcol e le prestazioni della memoria. Quando utilizziamo questa tecnologia per riestrarre ricordi precedenti dopo aver bevuto alcolici, stiamo subendo un processo di riconsolidamento di questi ricordi, migliorando così in una certa misura la nostra memoria.

Naturalmente, dobbiamo anche notare che il recupero della memoria alcolica non è una tecnica affidabile e duratura per migliorare la memoria. Se vogliamo avere un'ottima memoria per lungo tempo, dobbiamo consolidare e migliorare continuamente la nostra memoria attraverso lo studio e la vita quotidiana, combinati con altre tecniche di allenamento della memoria.

In questo processo, dobbiamo mantenere sempre un atteggiamento ottimista, per stimolare meglio la nostra motivazione all’apprendimento e il potenziale di memoria. Affrontiamo quindi attivamente l'allenamento della memoria, siamo noi stessi incessantemente e andiamo avanti con coraggio sulla strada del miglioramento continuo della memoria! Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentare i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, la carne può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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L'aumento dell'espressione dell'mRNA di Egr1 è stato precedentemente implicato nel riconsolidamento della paura e dei ricordi legati alla droga[19, 21, 48, 61], aumentando la possibilità che questo fattore di trascrizione svolga anche un ruolo nel riconsolidamento dei ricordi dell'alcol.

Mentre il ruolo di Bdnf nel riconsolidamento della memoria rimane controverso [19, 49], è noto che l'induzione di Bdnf è cruciale per l'acquisizione della memoria e l'apprendimento dell'estinzione [19, 62]. Pertanto, la mancanza di cambiamenti nell'espressione di Bdnf nel nostro studio potrebbe suggerire che la nostra procedura di recupero della memoria non ha avviato l'apprendimento per estinzione in parallelo con il recupero della memoria.

Inoltre, abbiamo recentemente riportato che, sebbene i livelli di mRNA di Bdnf nel DH non siano aumentati dal recupero della memoria alcolica di per sé, l'espressione del fattore di crescita era elevata quando il recupero è seguito da un controcondizionamento avversivo che ha impedito la ricaduta [44], suggerendo un ruolo complesso di Bdnf nelle dinamiche della memoria dell’alcol.

I nostri risultati indicano che gli aumenti nell’espressione IEG non sono esclusivi del riconsolidamento dei ricordi legati all’alcol.

Infatti, ARC ed EGR1 erano precedentemente implicati nel consolidamento di diversi tipi di ricordi, inclusi ricordi di paura [19, 46, 47, 62], ricordi di riconoscimento [21] e ricordi associati a diverse droghe d'abuso [20, 22, 61].

Tuttavia, vi sono anche prove crescenti che alcuni dei meccanismi alla base della ricerca di alcol possono differire da quelli che controllano la ricerca della ricompensa naturale [5, 27, 28, 63]. Inoltre, ci sono prove che i ricordi relativi a ricompense diverse (e a farmaci diversi, in particolare) vengono elaborati in modo differenziale [29-32]. I risultati della nostra analisi RNAseq hanno infatti rivelato la firma trascrittomica unica indotta dal recupero della memoria dell’alcol.

Nello specifico, abbiamo trovato 44 geni nel DH e un diverso insieme di 9 geni nel PFC, che mostrava cambiamenti significativi in ​​seguito al recupero della memoria dell'alcol. Dopo un'ulteriore validazione dei dati, ci siamo concentrati su un gene nel mPFC (Fkbp5) e tre geni nel DH (Adcy8, Scl8a3 e Neto1) e abbiamo scoperto che la loro espressione non era influenzata dal recupero dei ricordi associati al saccarosio.

Ciò suggerisce che, a differenza di Arc ed Egr1, questi 4 geni specifici probabilmente non svolgono un ruolo generale nell'elaborazione dei ricordi di ricompensa, ma potrebbero piuttosto svolgere ruoli selettivi nell'elaborazione dei ricordi dell'alcol.

È interessante notare che questi quattro geni erano precedentemente implicati nel disturbo da uso di alcol, nell’apprendimento e nella memoria. Pertanto, Fkbp5 codifica la proteina legante FK506 5, un regolatore del sistema neuroendocrino dello stress [64].

Le varianti FKBP5 modulano la gravità della sindrome da astinenza da alcol [65] e predicono la propensione al consumo eccessivo di alcol negli esseri umani [66-68]. È stato dimostrato che la delezione di Fkbp5 aumenta la gravità dell'astinenza da alcol [65] e il consumo di alcol [67] nei topi, mentre l'inibizione farmacologica della proteina ha ridotto il consumo moderato di alcol e il ripristino del CPP nei topi [69] e ha ridotto il consumo di alcol nei ratti maschi stressati [70].

I livelli di mRNA di Adcy8, che codifica per l’adenilatociclasi 8 (AC8) che catalizza la formazione di cAMP in risposta all’afflusso di calcio e recentemente indicato come possibile regolatore dell’assunzione di alcol [28, 71], erano diminuiti nelle cellule del sangue di alcolisti astinenti da lungo tempo [72].

In precedenza è stato dimostrato che la delezione di Adcy8 riduce il consumo di alcol e aumenta la sensibilità agli effetti sedativi dell'alcol nei topi [73]. Inoltre, l’esposizione cronica all’alcol nei ratti ha sovraregolato l’espressione cerebrale della famiglia di trasportatori di soluti 8 (scambiatore sodio/calcio), membro 3 (NCX3), la proteina codificata da Scl8a3 [74, 75].

Il consumo di alcol nei ratti è stato anche associato a una ridotta espressione nel tronco encefalico di Neto1[76], che codifica per la neuropilina tolloid-like 1 (NRP1), un componente del complesso del recettore NMDA [77].

Questa proteina è coinvolta nella riorganizzazione sinaptica e nella trasmissione nell'ippocampo [78] ed è necessaria per l'apprendimento spaziale e la memoria [77].

Pertanto, i nostri risultati mostrano che il semplice recupero dei ricordi legati all’alcol, anche senza alcun effetto farmacologico dell’alcol, influenza l’espressione di questi geni. Tuttavia, il loro ruolo specifico nel riconsolidamento della memoria alcolica e nelle ricadute resta da testare.

Una limitazione del presente studio è che il test RNA-seq è stato condotto sulla maggior parte dei tessuti mPFC e DH, piuttosto che su singole cellule attivate dal recupero della memoria. Nello specifico, studi recenti hanno suggerito che i ricordi in generale [79, 80], e in particolare i ricordi legati all'alcol [32, 81, 82], sono codificati tramite l'attivazione di insiemi neuronali composti da un piccolo numero di neuroni, che possono essere identificati tramite marcatori di attivazione neuronale ( ad esempio, cFOS) [80].

In effetti, modelli di attivazione IEG (cFOS) simili mediante il recupero di ricordi di alcol e dolce ricompensa condizionati dall'operante sono stati trovati nell'mPFC e in altre regioni mesolimbiche nel cervello del ratto [32, 81]. Pertanto, è possibile che l'esecuzione selettiva del test RNA-seq sull'insieme neuronale attivato dal recupero della memoria avrebbe prodotto risultati più accurati.

In sintesi, i nostri risultati suggeriscono che il recupero della memoria dell’alcol induce due programmi di trascrizione paralleli. Un programma, trasmesso attraverso meccanismi molecolari comuni di apprendimento e memoria, inclusi gli IEG Arc ed Egr1, è impegnato nel consolidamento dei ricordi, in generale.

L'altro programma di trascrizione, avviato dal recupero della memoria dell'alcol, è controllato da geni che promuovono specificamente comportamenti legati all'alcol. Questo modello di doppia elaborazione per le memorie dell'alcol solleva la possibilità che il riconsolidamento della memoria per ricordi diversi possa avere meccanismi molecolari simili di doppia elaborazione, con alcuni componenti condivisi da più ricordi e altri unici per ciascun tipo di memoria.

Questo modello ipotetico resta da valutare testando se la manipolazione di questi geni influenza in modo differenziale il riconsolidamento della memoria di alcol e saccarosio. Se così fosse, ciò suggerirebbe che potrebbe essere possibile mirare a bersagli molecolari specifici della ricompensa per trattare i disturbi legati ai ricordi patogeni, come la dipendenza, piuttosto che interrompere i principali meccanismi molecolari essenziali per molte funzioni oltre al riconsolidamento della memoria dell’alcol.

MATERIALI E METODI

Vedere Informazioni supplementari per dettagli sull'apparato, farmaci e reagenti, progettazione e preparazione dell'oligodeossinucleotide (ODN), analisi westernblot e qRT-PCR e preparazione della libreria RNA-seq.

Animali

Topi C57BL/JRccHsd maschi e femmine (25–30 g), ospitati 3–4 per gabbia, allevati presso la struttura per animali dell'Università di Tel-Aviv (Israele) e tenuti sotto un ciclo luce-buio di 12 ore (luci accese alle 7 del mattino), con cibo e acqua disponibili ad libitum.

Negli esperimenti che prevedevano il condizionamento del luogo del saccarosio, l'accesso al cibo è stato limitato per 6 ore prima delle sessioni di allenamento per aumentare la motivazione dei topi a raccogliere pellet di saccarosio. Questa breve durata della deprivazione alimentare si basa sui risultati che durante il giorno, un digiuno di 2-6 ore non influenza il comportamento alimentare [83] e non innesca uno spostamento significativo nei marcatori metabolici [84], minimizzando così gli effetti della restrizione alimentare di per sé. .

I topi sono stati pesati due volte a settimana per controllare la perdita di peso. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati e conformi alle linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Tel Aviv e alle linee guida NIH (numero di garanzia del benessere degli animali A5010-01). Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati.

Procedure comportamentali

Condizionamento del luogo

Preferenza di luogo condizionata dall'alcol (CPP): tutti i topi sono stati abituati a iniezioni quotidiane di soluzione salina ip per 3 giorni.

Test di base (giorno 1): il primo giorno, la porta scorrevole è stata retratta e ai topi è stato permesso di esplorare liberamente l'intero apparato per 30 minuti. Condizionamento del luogo con alcol (giorni 2-9): l'addestramento è iniziato 24 ore dopo il test di base con una sessione somministrato al giorno per 8 giorni, con la porta scorrevole chiusa. Nei giorni 3, 5, 7 e 9, i topi hanno ricevuto alcol (1,8 g/kg, 20% v/v; ip) e sono stati immediatamente confinati nel compartimento accoppiato per 5 minuti.

È stato precedentemente dimostrato che questa dose e la durata del condizionamento producono CPP indotta dall’alcol [42, 85]. A giorni alterni (cioè giorni 2, 4, 6 e 8), i topi hanno ricevuto una soluzione salina e sono stati confinati nel compartimento non accoppiato per la stessa durata del giorno di condizionamento con alcol.

I compartimenti accoppiati erano controbilanciati. Test di preferenza di luogo 1 (giorno 10): il test di preferenza di luogo era come descritto per il test di base e serviva a indicizzare alcol-CPP [41]. La preferenza è stata definita come un aumento della percentuale di tempo trascorso nel compartimento abbinato all'alcol durante il test di preferenza del posto 1, rispetto al test di base.

Recupero della memoria (giorno 11): prima di questa fase, i topi sono stati assegnati a diverse condizioni sperimentali (abbinati per punteggi CPP e sesso). Durante una sessione di recupero della memoria, i topi sono stati confinati nel compartimento accoppiato con l'alcol per 3 minuti e poi sono tornati nelle loro gabbie domestiche. I topi di controllo sono stati maneggiati brevemente. Test di preferenza di luogo 2 (giorno 12): i topi sono stati sottoposti a un test di preferenza di luogo identico al test di preferenza di luogo 1.

CPP su saccarosio: pre-addestramento su saccarosio (giorni 1–6): nei giorni 1–3, i topi erano abituati a raccogliere 5–6 pellet di saccarosio (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, USA) in gabbie domestiche . Nei giorni 4-6, i topi sono stati addestrati a raccogliere 3 pellet in una scatola di plexiglas vuota durante sessioni di 30-minuti. I topi che hanno raccolto meno di sei pellet (su un totale di nove pellet nei 3 giorni) durante l'addestramento al saccarosio sono stati esclusi dall'esperimento (2 topi su 32).

Test di base (giorno 7): il settimo giorno, la porta scorrevole in una camera CPP è stata retratta e ai topi è stato permesso di esplorare l'intero apparato per 30 minuti. Anche in questo caso è stato adottato un approccio imparziale/assegnazione imparziale, come descritto nella procedura alcol-CPP. Condizionamento del luogo del saccarosio (giorni 8-15): la formazione è iniziata 24 ore dopo il test di base con una sessione al giorno per 8 giorni, con lo scorrimento porta chiusa. Nei giorni 9, 11, 13 e 15, i topi furono posti nello scomparto accoppiato e un minuto dopo, tre pellet di saccarosio furono sparsi sul pavimento.
I topi sono stati riportati nelle loro gabbie domestiche 15 minuti dopo. A giorni alterni (cioè giorni 8, 10, 12 e 14), i topi sono stati posti nel compartimento non accoppiato per 15 minuti senza alcuna interferenza.

I compartimenti accoppiati erano controbilanciati. Test di preferenza di luogo 1 (giorno 16): il test di preferenza di luogo era come descritto per il test di base ed è servito a indicizzare il saccarosio-CPP. La preferenza è stata definita come un aumento della percentuale di tempo trascorso nel compartimento accoppiato con saccarosio durante il test di preferenza del posto 1, rispetto al test di base. Recupero della memoria (giorni 17): la procedura di recupero della memoria con saccarosio era identica alla procedura di recupero della memoria con l'alcol (vedere sopra ).

Convalida dell'oligodeossinucleotide (ODN).

La progettazione dell'ODN antisenso ad arco (AS-ODN) e dell'ODN criptato (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israele) ha seguito le linee guida descritte in precedenza [56, 86].

Convalida funzionale Arc AS-ODN. Arc AS-ODN (2 nmol/μl, 0,5 µl, 0,25 µl/min) è stato infuso nel DH in un emisfero e SCR-ODN (2 nmol/μl, { {9}},5 µl, 0,25 µl/min) è stato infuso nell'altro emisfero (i lati erano controbilanciati). Due o quattro ore dopo, i topi trattati hanno esplorato un contesto non familiare (compartimento CPP, vedere la descrizione dell'apparato, sopra) per 5 minuti per indurre l'espressione ARC dipendente dalla novità. I topi sono stati soppressi un'ora dopo (cioè 3 o 5 ore dopo l'infusione di ODN), sono stati raccolti i tessuti cerebrali e i livelli di proteina ARC sono stati valutati mediante analisi Western blot (Figura S4).

Chirurgia e microinfusione intra-ippocampale La chirurgia e le microinfusioni sono state condotte come descritto in precedenza[42, 87].

Chirurgia. Gli interventi stereotassici sono stati condotti in anestesia con isoflurano. I topi sono stati posizionati in un telaio stereotassico (RWD Life Science, Shenzhen, Cina) e le cannule guida bilaterali (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) sono state puntate verso il DH a le seguenti coordinate (−2 mm posteriormente al bregma, ± 1,3 mm mediolaterale, −1,45 mm ventrale rispetto alla superficie del cranio). Le cannule sono state fissate con acrilico dentale. Cannule fittizie corrispondenti (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) sono state inserite nelle cannule guida e sormontate da coppe antipolvere per mantenere il sito dell'iniettore coperto e libero da detriti. Ai topi è stato permesso di riprendersi per 7-10 giorni prima dell'allenamento con alcol-CPP.

Infusioni intra-ippocampali. Actinomicina D (4 µg/μl, 0,5 µl per lato, 0,25 µl/min, in DMSO) [19] o un volume equivalente di veicolo è stato microiniettato nel DH immediatamente dopo il recupero della memoria . È stato dimostrato che l'infusione di actinomicina D nell'ippocampo a una concentrazione simile interrompe il riconsolidamento della memoria [19]. Arc AS-ODN o controllo SCR-ODN (2nmol/μl, 0,5 µl/lato, 0,25 µl/min; in PBS) è stato microiniettato nella DH 4 ore 2 ore prima o 4 ore dopo il recupero della memoria.

Dopo la rimozione del contenitore per la polvere e delle cannule fittizie, è stata condotta una microinfusione per 2 minuti su topi immobilizzati in modo sveglio, utilizzando cannule per iniezione (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) che si estendevano per 0 0,5 mm oltre la guida punta della cannula. Le cannule di iniezione sono state lasciate in sede per altri 2 minuti. Dopo l'infusione, le finte cannule sono state inserite nelle cannule guida, fissate con il contenitore per la polvere, e gli animali sono stati riportati alle loro gabbie. Le localizzazioni delle cannule sono state verificate in sezioni coronali spesse 30 μm di tessuto fissato con paraformaldeide colorato con viola cresilico.

Analisi dei dati

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >Il 75% del tempo trascorso in uno dei compartimenti durante il test di base è stato escluso dallo studio (9 su 267). La determinazione del CPP è stata confermata confrontando i punteggi CPP tra il basale e il test CPP 1 ed è stata analizzata mediante un t-test appaiato. Poiché l'espressione del CPP (cioè la formazione della memoria) è necessaria per il recupero della memoria, i dati dei topi che non mostravano CPP (un aumento minimo del 5% nella preferenza tra il basale e il Test 1) sono stati esclusi dall'esperimento (48 su 258).

L'alcol-CPP in seguito all'interferenza con il riconsolidamento della memoria è stato analizzato mediante un'ANOVA a modello misto con un fattore di trattamento tra soggetti (actinomicina D o ODN) e un fattore di test entro soggetti (test CPP 1, test CPP 2). Le interazioni significative sono state analizzate mediante un test post hoc di Student-Newman-Keuls. Le densità dei livelli di proteina ARC immunoreattiva del Western blot sono state normalizzate a quelle GAPDH e analizzate mediante un'ANOVA unidirezionale con un fattore di trattamento tra soggetti, seguito dal test post hoc di Dunnett. I dati di espressione dell'mRNA qRT-PCR sono stati normalizzati in Gapdh ed espressi come percentuale dell'espressione di un gruppo di controllo.

I dati di tutti i geni per ciascuna regione del cervello sono stati analizzati mediante un'ANOVA unidirezionale con un fattore di trattamento tra soggetti, seguito dal test di Dunnett per ciascun gene, per il confronto con i dati ottenuti da un gruppo di controllo (nessun recupero). Per RNA-seq, abbiamo raggruppato i tessuti di 3 animali per ciascuna replica e preparato il seguente numero di repliche: 3 per l'ippocampo dorsale (DH)-nessun recupero, 2 per DH-recupero, 3 per la corteccia prefrontale (PFC)-nessun recupero e 2 per ( PFC)-recupero. Dopo l'isolamento totale dell'RNA con Trizol, sono state generate librerie di sequenziamento utilizzando il metodo da noi sviluppato [88].

Le librerie sono state sottoposte a sequenziamento single-end a 50 bp con IlluminaHiseq 2000. Dopo aver confermato la qualità dei dati di sequenziamento mediante FastQC, le letture sono state mappate sul genoma di riferimento mm9 utilizzando Bowtie2 [89] e annotate con Tophat2 [90].

Le letture mappate sui geni sono state quantificate da FeatureCounts [91]. Abbiamo escluso Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a e il cromosoma mitocondriale per evitare conteggi di geni sovraamplificati che potrebbero distorcere la normalizzazione della libreria come precedentemente descritto [92]. DESeq2 [58] è stato utilizzato per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) nel gruppo Retrieval, rispetto al gruppo di controllo No Retrieval, con un valore p aggiustato per il cutoff di significatività (p(adj) < 0.05).

DISPONIBILITÀ DEI DATI I dati RNA-seq sono disponibili presso NCBI Gene Expression Omnibus all'indirizzo https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) con un token di revisione:knyfwwiorbutvuv.

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