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Alterazioni nella traduzione delle proteine ​​e processi catabolici dell'acido carbossilico nella malattia renale diabetica

Jul 05, 2024

Astratto: Malattia renale diabetica (DKD)rimane la causa principale dimalattia renale allo stadio terminalenonostante decenni di studio. Alterazioni nelglomerulo e tubuli renalientrambi contribuiscono allapatogenesi della DKDsebbene la maggior parte degli sforzi investigativi si sia concentrata sul glomerulo. Abbiamo cercato di esaminare la firma dell'espressione differenziale della DKD umana nel glomerulo e nel tubulo prossimale e di corroborare i nostri risultati nel modello murino di diabete db/db. Un'analisi della rete del trascrittogramma dei dati RNAseq dal glomerulo umano microdissezionato al laser (LMD) e dal tubulo prossimale di DKD enefrectomia di riferimentoi campioni hanno rivelato percorsi arricchiti tra cui recettori simili alla rodopsina, segnalazione olfattiva e ribosoma (traduzione delle proteine) nel tubulo prossimale dei campioni di biopsia DKD umana. Anche il percorso di traduzione è stato arricchito nel glomerulo. Maggiore traduzione inrene diabeticos è stato convalidato utilizzando la profilazione poliribosomiale nel modello murino di diabete db/db. Utilizzando il sequenziamento di RNA nucleare singolo (RNA-Seq) di reni di topi db/db, abbiamo dato priorità a ulteriori percorsi identificati nella DKD umana. Il percorso sovrapposto superiore identificato nei cluster di tubuli prossimali snRNAseq murini e nel tubulo prossimale LMD umanocompartimento era il catabolismo dell'acido carbossilico. Utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alte prestazioni, si è scoperto che anche il percorso del catabolismo degli acidi grassi è disregolato nel modello murino db/db. Il metabolita acetil-CoA era sottoregolato nei topi db/db, allineandosi con l’espressione differenziale umana dei geni ACOX1 e ACACB. In sintesi, i nostri risultati dimostrano che le alterazioni tubulari prossimali nella traduzione delle proteine ​​eCatabolismo degli acidi carbossilicisono caratteristiche chiave sia nell'uomo che nelDKD murino. 



Parole chiave:firma dell'espressione genica; sequenziamento di RNA nucleare singolo;metabolomica; profilazione ribosomiale

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NUOVE ERBE PERRENE DIABETICO


1. Introduzione

Il diabete mellito (DM) colpisce oltre 400 milioni di persone in tutto il mondo [1] e oltre 30 milioni negli Stati Uniti [2]. La malattia renale diabetica (DKD) è una delle complicanze più gravi del diabete mellito, colpisce 19 milioni di persone negli Stati Uniti [3] ed è la principale causa dimalattia renale allo stadio terminale(ESKD) [4]. La DKD è classicamente vista come una malattia glomerulare; tuttavia, concentrandosi esclusivamente sulla patologia glomerulare come sede primaria della lesione, si trascurano le principali alterazioni biologiche nel compartimento tubulointerstiziale che contribuiscono alla fisiopatologia della DKD [5]. Infatti, la prognosi e la progressione della DKD spesso vanno di pari passo con l’atrofia tubulare e l’estensione della malattia interstiziale [6,7]. Ulteriore attinenza a questo punto è la prova che il targeting del tubulo prossimale con gli inibitori SGLT2 rallenta la progressione della DKD [8].

I meccanismi cellulari che portano allo sviluppo e alla progressione della DKD sono certamente complessi. L’ambiente diabetico è caratterizzato da anomalie metaboliche, infiammazione, stress ossidativo e alterazioni dell’omeostasi proteica. Tutti questi disturbi contribuiscono allo stress cellulare e allo sviluppo della DKD. Esistono prove crescenti che la traduzione alterata, il passaggio fondamentale nell’espressione genica che crea proteine ​​funzionali, è importante sia nel rispondere che nel contribuire allo stress cellulare [9,10]. Le alterazioni nella traduzione contribuiscono agli squilibri nell’omeostasi delle proteine ​​e hanno un impatto sulla salute e sulle malattie umane [11-14].

L'interrogatorio di campioni bioptici di reni umani utilizza abitualmente la microscopia ottica, la microscopia elettronica a trasmissione e le immunoreazioni per consentire al patologo di fornire una diagnosi e una prognosi. Tuttavia, questi strumenti diagnostici presentano limitazioni nello scoprire i meccanismi molecolari alla base della malattia renale, inclusa la DKD. Di conseguenza, i modelli animali di DM sono stati storicamente utilizzati per studiare i meccanismi fisiopatologici della DKD; tuttavia, nessuno di questi modelli simula adeguatamente la DKD umana [15]. Sebbene i recenti sforzi per applicare tecniche di interrogazione molecolare più avanzate a campioni di biopsia renale umana siano incoraggianti [16], riteniamo che l’utilizzo di modelli animali in parallelo con il tessuto renale umano rimanga un importante approccio sperimentale per fornire informazioni uniche sulle basi molecolari della DKD.

Abbiamo cercato di esaminare la firma dell'espressione differenziale della DKD umana nel glomerulo e nel tubulo prossimale. Abbiamo ipotizzato che la firma trascrittomica del tubulo prossimale, oltre a quella del glomerulo, determini anche gli esiti della DKD. Abbiamo affrontato questa ipotesi interrogando campioni di biopsia renale umana con microdissezione laser delle regioni tubulari glomerulari e prossimali per identificare i percorsi associati alla DKD e alla sua progressione. Successivamente, i percorsi chiave sono stati confermati in un modello murino diabetico utilizzando un approccio multimodale di sequenziamento di RNA nucleare singolo (RNA-Seq), profilazione poliribosomiale e metabolomica. Oltre agli squilibri nella traduzione delle proteine, i nostri risultati supportano il potenziale ruolo del metabolismo dell’acido carbossilico come fattore chiave nella progressione della malattia renale diabetica.

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2. Materiali e metodi

2.1. Soggetti umani

Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board della Indiana University School of Medicine (IRB n. 190657223). Ventisette campioni di reni sono stati ottenuti dal Kidney Precision Medicine Project Consortium e dalla Biopsy Biobank Cohort dell’Indiana [17]. Le biopsie renali erano biopsie indicative per proteinuria o declino della funzionalità renale in soggetti con diabete mellito. Diciotto campioni sono stati acquisiti da adulti con malattia renale diabetica e senza una seconda lesione glomerulare. Nove campioni di riferimento senza evidenza istologica di DKD sono stati acquisiti da parenchima non neoplastico di campioni di nefrectomia o donatori deceduti. Le variabili cliniche e istopatologiche sono state estratte dalla cartella clinica elettronica. La velocità di filtrazione glomerulare stimata al basale (eGFR) è stata definita come il valore più vicino alla data della biopsia, a meno che un calo pari o superiore al 20% dell’eGFR non abbia accelerato l’invio alla biopsia. In questo scenario, un eGFR entro 1 anno prima della biopsia e prima del calo del 20% è stato impostato come base per i calcoli della progressione.


2.2. Microdissezione laser del tessuto renale umano e sequenziamento dell'RNA

Criosezioni di 12 µm di spessore sono state tagliate da blocchi di tessuto congelato conservati in un mezzo a temperatura di taglio ottimale, fatti aderire a vetrini con membrana in polifenilene solfuro (PPS) e trattati utilizzando un protocollo di colorazione rapida come descritto in precedenza [18,19]. È stata sezionata un'area minima di 500,000 µm2 per i compartimenti tubulari glomerulari e prossimali utilizzando il laser UV pulsato sul Leica LMD6500 e un obiettivo 20×. Il tessuto sezionato è stato raccolto in una provetta sterile priva di RNAsi contenente tampone di estrazione dell'RNA e l'RNA è stato isolato secondo le istruzioni del produttore (Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit, ThermoFisher, Waltham, MA, USA). La qualità dell'RNA è stata determinata utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100.

Il sequenziamento è stato eseguito presso l'Indiana University Center for Medical Genomics Core. L'RNA ribosomiale è stato impoverito utilizzando il protocollo RiboGone-Mammalian Kit (Cat n. 634847, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA). Il protocollo SMARTer Universal Low Input RNA Kit v2 (Cat n. 634938, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA) è stato utilizzato per la sintesi del cDNA e la costruzione della libreria. Il sequenziamento è stato eseguito con una configurazione bidirezionale da 2 × 75 bp su Illumina HiSeq 4000 utilizzando il kit HiSeq 3000/4000 PE SBS e i dati sequenziati sono stati mappati sul genoma hg38 utilizzando STAR. Le letture di sequenziamento mappate in modo univoco sono state assegnate ai geni del genoma di riferimento hg38 utilizzando Rsubread featureCounts [20,21].

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2.3. Approvazioni per studi sugli animali

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura degli animali dell'Università dell'Indiana e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Per il sequenziamento dell'RNA in massa, la profilazione poliribosomiale e la metabolomica, i topi maschi del ceppo C57BL/6J (#000664, controllo di fondo/topi C57) e B6.BKS–Leprdb/J (#000697, topi db) sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory ( Bar Harbor, Massachusetts, USA). I topi avevano un'età compresa tra 9 e 12 settimane e pesavano circa 30 g (topi C57) o 40-50 g (topi db). I topi sono stati sacrificati e sono stati raccolti i reni (n=4 o 5 per gruppo).


2.4. Isolamento del tessuto renale del topo e sequenziamento dell'RNA in massa

I reni sono stati congelati e l'RNA è stato estratto utilizzando un kit QIAGEN RNeasy Plus Midi con una colonna di rimozione del DNA genomico. La qualità dell'RNA è stata determinata utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100. Per la costruzione della libreria è stato utilizzato il kit Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep. Il sequenziamento è stato eseguito con una configurazione bidirezionale da 2 × 75 bp su Illumina HiSeq 4000 utilizzando il kit HiSeq 3000/4000 PE SBS e i dati sequenziati sono stati mappati sul genoma mm10 utilizzando STAR. Le letture di sequenziamento mappate in modo univoco sono state assegnate ai geni del genoma di riferimento mm10 utilizzando i conteggi delle funzionalità Rsubread.



2.5. Isolamento del tessuto renale del topo e sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo

Sono stati valutati topi di età di 5, 8, 11, 16 e 20 settimane (n=5 in totale, BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J #000642). Gli eterozigoti dello stesso ceppo sono stati utilizzati come controlli di fondo (n=3). L'albumina urinaria è stata misurata con un kit ELISA per l'albumina di topo (Bethyl Laboratories, E99-134, Montgomery, TX, USA) e la creatinina urinaria è stata misurata con un kit per il dosaggio della creatinina QuantiChrom (Bioassay System, DICT-500, Hayward , California, Stati Uniti). Sul ghiaccio, una porzione di ciascun rene è stata aggiunta a 1 ml di tampone di lisi Nuclei EZ integrato con il 2% di inibitore della proteasi (Thermofisher) e l'1% di Superase (Thermofisher). Dopo la triturazione, è stato aggiunto 1 mL di tampone e il tessuto è stato omogeneizzato utilizzando il KONTES Dounce Tissue Grinder (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA). L'omogenato è stato delicatamente miscelato con 2 ml di tampone e incubato in ghiaccio per 5 minuti. L'omogenato è stato filtrato attraverso un filtro da 40 µm e trattato con tampone di lisi integrato con Superbase all'1%, quindi filtrato nuovamente attraverso un30 µm, e successivamente risospesi in PBS addizionato con BSA al 2% e BSA all'1%Superare. Questa sospensione è stata poi filtrata attraverso un filtro 5µfiltro m e la concentrazioneè stato regolato a 1–3 milioni di nuclei/mL prima dell'invio per il sequenziamento.
Il sequenziamento dell'RNA 30 nucleare singolo è stato eseguito presso l'Indiana University Center for Medical Genomics Core utilizzando il sistema unicellulare Chromium versione 3 (10× Genomics, San Francisco, CA, USA) e il Sequenziatore NovaSeq6000 (Illumina, San Diego, CA, USA). Cell Ranger 4.0 è stato utilizzato per generare file FASTQ specifici del campione e le letture sono state allineate al genoma di riferimento mm10 utilizzando STAR. Seurat v 3.0.1 è stato utilizzato per integrare i campioni utilizzando le seguenti metriche di controllo di qualità: conteggi di geni inclusi tra 200 e 3000 e percentuale di geni mitocondriali inferiore al 50%. In totale, sono state conservate 58.405 cellule per l'analisi a valle. Sono state eseguite la preelaborazione standard, la selezione delle caratteristiche, la riduzione delle dimensioni (20 componenti principali), l'identificazione degli ancoraggi tra i campioni e l'integrazioneeseguito secondo i metodi di ancoraggio Seurat v3.I cluster sono stati annotati in base amarcatori comuni di espressione genica [22] e utilizzando Kidney Cell Explorer [23]. 

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2.6. Isolamento di tessuti renali di topo e profilazione poliribosomiale

I topi controllo di fondo e db sono stati sacrificati a 9 e 12 settimane di età. La perfusione cardiaca attraverso il ventricolo sinistro è stata eseguita con 6 mL di cicloesimide (100 µg/mL in PBS). I reni raccolti sono stati immediatamente posti in un tampone di lisi costituito da 1% Triton X-100, 0,1% desossicolato, 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, compressa cocktail inibitore della proteasi priva di EDTA (Roche, Penzberg , Germania), 50 µg/mL di cicloesimide e RNAsina (diluizione 1:500). I tessuti sono stati omogeneizzati a 4 ◦C utilizzando un omogeneizzatore per tessuti Precellys (Precellys, Montigny-le-Bretonneux, Francia). Gli omogenati di tessuto sono stati incubati in ghiaccio per 10 minuti, quindi centrifugati a 9600×g per 10 minuti. Il surnatante è stato aggiunto sopra un gradiente di saccarosio generato da BioComp Gradient Master (saccarosio al 10%sopra il 50% di saccarosio in Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl 5 mM2e 50 mg/mlcicloesimide) e centrifugato a 284,000× g per 2 ore alle 4◦C. I gradienti sono stati raccoltidall'alto in una raccoglitrice Biocomp (Biocomp Instruments, Fredericton, NB, Canada),e il contenuto di RNA delle frazioni ribosomiali eluite è stato continuamente monitorato con UVassorbanza a 254 nm.



2.7. Metabolomica

Per valutare le firme metabolomiche, campioni di controllo di fondo e topi db (n=5 per gruppo) sono stati preparati utilizzando il sistema automatizzato MicroLab STAR® (Hamilton Company, Reno, NV, USA). L'analisi metabolomica è stata eseguita presso Metabolon Inc. In breve, i tessuti renali congelati sono stati elaborati seguendo il metodo di estrazione standard Metabolon secondo il protocollo aziendale. Gli estratti sono stati analizzati su una cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) Waters ACQUITY con una colonna C18 (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1,7 µm) e un sistema Thermo Scientific Q-Exactive ad alta risoluzione/accurato spettrometro di massa interfacciato con una sorgente di ionizzazione elettrospray riscaldata (HESI-II) e un analizzatore di massa Orbitrap operante con una risoluzione di massa di 35,000.

I dati grezzi sono stati estratti, identificati i picchi ed elaborati tramite controllo qualità utilizzando l'hardware e il software Metabolon (Durham, NC, USA). I picchi sono stati quantificati utilizzando l'area sotto la curva. Le analisi statistiche standard con il test t di Welch a due campioni sono state eseguite in ArrayStudio su dati trasformati in log.




2.8. Espressione genica differenziale, analisi del percorso e statistica

I dati sull'espressione del tessuto renale umano e del rene di topo ottenuti dal sequenziamento dell'RNA sono stati normalizzati quantili e l'espressione differenziale è stata determinata utilizzando un test esatto in edgeR con valori p < 0.05 considerato statisticamente significativo dopo Benjamini–Hochberg falso correzione dei test multipli del tasso di scoperta (FDR). Per i campioni di rene di topo sottoposti a sequenziamento dell'snRNA, l'espressione differenziale è stata determinata utilizzando un test Wilcoxon Rank Sum con valori p aggiustati di Bonferroni < 0.05 considerati statisticamente significativi. Tuttavia, nel manoscritto sono forniti valori p non corretti. I dati sull'espressione genica sono stati studiati per percorsi arricchiti in Gene Ontology, Kegg e Reactome utilizzando un'analisi di rete di trascrittogramma come precedentemente descritto [19,24–26]. In breve, tutti i geni codificanti proteine, indipendentemente dal valore p, sono ordinati da reti di interazione proteina-proteina. È stato utilizzato un algoritmo Monte Carlo per raggruppare i geni in base a funzioni biologiche condivise. La significatività viene determinata utilizzando il test t di Welch a due code dopo 500 permutazioni casuali per stimare il tasso di false scoperte con valori p <0,05 considerati statisticamente significativi. Poiché solo un sottoinsieme di geni è espresso in una determinata cellula per i dati snRNA-seq, il metodo del trascrittogramma non è fattibile per questo tipo di dati. L'analisi del percorso per snRNA-seq ha coinvolto l'arricchimento di geni espressi in modo differenziale in Gene Ontology, Kegg e Reactome secondo il test esatto di Fisher, senza tenere conto delle interazioni della rete proteina-proteina. Tutti i cluster di cellule tubulari prossimali in tutti i punti temporali sono stati uniti per identificare i geni arricchiti tra topi di controllo e db. Anche il singolo cluster di podociti è stato unito attraverso i punti temporali. Questo metodo è stato applicato anche ai dati RNA-seq umani quando si valutava la sovrapposizione con il set di dati snRNA-seq. I valori p corretti da FDR per i percorsi sono stati utilizzati per identificare la sovrapposizione tra sottosegmenti corrispondenti. PAM (partizionamento intornomedoids) è stato utilizzato per raggruppare campioni umani diabetici in base ai geni coinvolti in ciascun percorso sovrapposto. Le caratteristiche cliniche differenziali sono state determinate utilizzando il test Wilcoxon Rank Sum tra i gruppi raggruppati.














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