Lo SNP Rs708727 associato alla malattia di Alzheimer in SLC41A1 può aumentare il rischio di malattia di Parkinson: rapporto dello studio slovacco allargato, parte 2

2.2. Analisi genetiche

Le analisi genetiche sono state eseguite sugli SNP A1 rs11240569, rs708727 e rs823156 nella coorte di 508 pazienti con PD (contro 150 pazienti nello studio pilota) e nella coorte di 472 controlli (contro 120 controlli nello studio pilota) [37]. Pertanto, il numero dei pazienti con PD e dei probandi di controllo è aumentato in questo studio rispettivamente di 3,4-volte e 3,9 volte, rispetto allo studio pilota.

Molte persone sperimentano una perdita di memoria con l'avanzare dell'età, ma per le persone con malattia di Parkinson, i cambiamenti della memoria possono essere più pronunciati. Tuttavia, non dovremmo pensare che le persone con malattia di Parkinson siano destinate a soffrire di declino della memoria, perché ci sono cose che possiamo fare per aiutarle a mantenere la memoria.

In primo luogo, svolgere costantemente alcune attività di allenamento del cervello può aiutare le persone con malattia di Parkinson a migliorare la propria memoria. Queste attività possono includere: fare Sudoku, giocare a giochi da tavolo, risolvere enigmi e altro ancora. Attraverso queste attività, possono esercitare la memoria, migliorare la funzione cerebrale e aiutarli a mantenere il loro stato mentale.

In secondo luogo, anche la dieta ha un impatto molto importante sulla memoria dei pazienti affetti dal morbo di Parkinson. Nella dieta possiamo aggiungere alcuni alimenti ricchi di proteine ​​e sostanze nutritive, come pesce, fagioli, noci, ecc. Questi alimenti possono aiutarci a rimanere in salute e a migliorare la nostra memoria.

Infine, l'esercizio fisico regolare può anche aiutare le persone affette dal morbo di Parkinson a migliorare la loro memoria. L’esercizio fisico non solo ci aiuta a rimanere sani fisicamente ma, cosa ancora più importante, migliora la nostra funzione cerebrale. Attraverso l’esercizio fisico regolare, possono aumentare la loro funzione cardiopolmonare, migliorare l’elasticità dei muscoli e delle ossa e migliorare la memoria.

Tutto sommato, se le persone con malattia di Parkinson sperimentano un declino della memoria dipende dal loro stile di vita e dalle loro abitudini alimentari, nonché dal fatto che prestino attenzione a cose come l'allenamento del cervello e l'esercizio fisico. Finché prestiamo attenzione a questi aspetti, credo che la memoria dei pazienti con malattia di Parkinson possa essere effettivamente migliorata. Si può vedere che dobbiamo migliorare la nostra memoria. La Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria perché la Cistanche deserticola è un materiale medicinale tradizionale cinese con molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia della carne macinata deriva da una varietà di principi attivi in ​​essa contenuti, tra cui acido carbossilico, polisaccaridi, flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello attraverso vari canali.

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In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) nella nostra coorte totale (casi PD + probandi di controllo), approssimativamente paragonabile all'intervallo fq della popolazione totale degli alleli minori (MATPFR) riportato dai database gnomAD ed ExAC, come segue: fqo (osservato) vs. per (riportato) {{1 }}% ​​contro 29-30%.

L'allele minore fq per rs708727 (G > A) nella nostra coorte totale era superiore a MATPFR nei database gnomAD ed ExAC (fq, vs. per=40% vs. 29-30%) ma era paragonabile a l'allele minore rs708727 fq riportato per la popolazione europea nel database ALFA (41%). Il fq dell'allele minore rs823156 (A > G) nella nostra coorte totale era del 17% ed era quindi inferiore a MATPFR nei database gnomAD ed ExAC (23-30%), ma era paragonabile al fq dell'allele minore rs823156 riportato per la popolazione europea in la banca dati ALFA (18%).

La frequenza dell'allele minore di rs9438393 (A > G) nella coorte totale era del 40% ed era, quindi, notevolmente superiore al MATPFR del 26-29% riportato nei database gnomAD e TOPMED, ma era paragonabile all'allele minore rs9438393 frequenza allelica riportata nel database ALFA per la popolazione europea (41%). L'allele minore di rs56152218 (T > C) nella coorte totale era presente con un fq del 38%, che rientra nel MATPFR del 32-46% riportato dai database ALSPAC, TOPMED e ALFA (popolazione europea).

È interessante notare che nelle popolazioni vietnamita, coreana e del Qatar, l'allele minore è T e non C, come osservato nella popolazione europea [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{{0} }rs56152218, accesso il 2 agosto 2021)]. Il fq dell'allele minore in rs61822602 (G > T) è risultato pari al 12%. Ciò è paragonabile alle frequenze dell'allele T riportate dai database ALSPAC e TWINSUK (rispettivamente 12% e 13%), ma è di gran lunga superiore alla fq dell'allele T riportata nella popolazione europea nel database ALFA (6%).

Tutti gli SNP A1 testati nelle nostre coorti PD e di controllo erano in equilibrio di Hardy-Weinberg (HWE; Tabella 4).

Successivamente, abbiamo calcolato gli odds ratio (OR) dell'allele minore e dei genotipi contenenti l'allele minore per ciascun SNP testato. Questi risultati sono riepilogati nella Tabella 5. Il genotipo GA in rs708727 era associato a PD (OR=1.42 (1.08–1.87), p=0.01) nella nostra popolazione. Inoltre, abbiamo testato l'associazione di particolari combinazioni genotipiche per ciascun SNP testato con PD in modelli genetici recessivi, dominanti e completamente sovradominanti (Tabella 6). Coerentemente con i dati precedenti, abbiamo identificato un'associazione dell'allele minore rs708727 (A) con la PD nei modelli genetici dominanti (GG vs. GA + AA) e completamente sovradominanti (GG + AA vs. GA) (ORD {{16} }.36 (1.05–1.77), p=0.02 e ORCOD=1.34 (1.04–1.72), p=0.02, rispettivamente). I restanti SNP non hanno mostrato alcuna associazione con la PD nei modelli genetici testati (Tabella 6).

Abbiamo anche testato l'uguaglianza delle proporzioni della popolazione di qualsiasi combinazione genotipica composta da doppiette, triplette, quadruple, quintine o sestine degli SNP testati nella coorte PD (N {{0}}) e nella coorte di controlli ( N=100) per esaminare la dimensione dell'effetto delle interazioni tra gli SNP A1 testati verso la suscettibilità allo sviluppo della PD nella nostra popolazione. In totale, un totale di 12 combinazioni genotipiche (due doppiette, sette triplette e tre quadruple, Tabella 7) con significativamente (p < 0.05, 10 genotipi; p < 0,06, due genotipi ) sono stati identificati conteggi diversi nelle coorti PD e di controllo (Tabella 7). Seguendo i criteri di Cohen [39], che descrivono le differenze nelle proporzioni, solo la tripletta GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) dei 12 genotipi ha mostrato la differenza di dimensione "media" definita dal valore h(2arcsin√ prp1 di Cohen –2arcsin√ prp2) Maggiore o uguale a 0,5.

Il valore h per i rimanenti 11 genotipi variava tra 0.32 e 0.46 ed era quindi all'interno dell'intervallo h da 0.2 a 0.5, che definisce piccole differenze nelle proporzioni (Tabella 7) [39]. Pertanto, la tripletta GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) potrebbe essere clinicamente significativa e dovrebbero essere condotti esami futuri di questo genotipo sulla suscettibilità alla PD. Per rs11240569, rs708727 e rs823156, abbiamo eseguito lo stesso tipo di analisi con dati di origine provenienti dalla coorte di 508 pazienti con PD e dalla coorte di 472 controlli. Quattro genotipi, due gemelli (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) e due tripletti (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AA(rs823156), (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AG(rs823156)), con conteggi significativamente diversi (p < 0,05) nelle coorti PD e di controllo. L'h di Cohen calcolata per ciascuno dei quattro genotipi era inferiore alla soglia di 0,2 [39], e quindi, la differenza tra le proporzioni della popolazione tra i gruppi testati era, in tutti e quattro i casi, trascurabile.

L’invecchiamento, seguito dal sesso maschile, è considerato il fattore di rischio più importante per l’insorgenza della malattia di Parkinson idiopatica [37]. Nel nostro studio pilota, l'età di insorgenza della PD idiopatica nella coorte di 150 pazienti con PD non era correlata con la presenza di alcuna combinazione genotipica per gli SNP rs11240569, rs708727 e rs823156 [37]. Qui, abbiamo correlato l'età di insorgenza della PD con (1) la presenza di ciascuna combinazione genotipica per gli SNP rs11240569, rs708727 e rs823156 nel gruppo di 508 pazienti con PD (Figura 2) e (2) con la presenza di ciascuno combinazione genotipica per gli SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 e rs61822602, nella sotto-coorte di pazienti con PD, selezionati casualmente dalla coorte PD per il sequenziamento del promotore A1 (Figura 3). Circa l’età di esordio, un’analisi ANOVA a una via ha rivelato che non vi era alcuna differenza significativa (p <0,05) tra le sottopopolazioni genotipiche per ciascuno degli SNP testati sia nell’ampia coorte di PD che nella sotto-coorte di PD pazienti. Pertanto, qualsiasi genotipo particolare negli SNP testati non influenza l’età di esordio della forma idiopatica della PD. Ciò è in pieno accordo con la conclusione tratta nel nostro studio pilota [37].

Abbiamo anche eseguito lo stesso tipo di analisi per ciascuno degli SNP testati in sottopopolazioni di donne e uomini derivate dalla grande coorte (N=508) e dalla sotto-coorte (N=96 ) dei pazienti con malattia di Parkinson. Come dimostrato nelle Figure supplementari S1-S3, nessuna associazione significativa (p <0.05) tra l'età di esordio e la presenza di qualsiasi particolare combinazione di genotipo negli SNP testati rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218, e rs61822602 nei sottogruppi divisi per genere è stato derivato dall'ampia coorte PD (NM=306, NF=202) o dalla sotto-coorte PD selezionata per il sequenziamento del promotore A1 (NM {{20} }, NF=42).

2.3. Apprendimento automatico di RandomForest (RF-ML)

Tutti gli SNP A1 sono stati testati per la loro capacità di discriminare tra pazienti con PD e controlli con RF-ML. L'algoritmo RF-ML è stato addestrato utilizzando i nostri dati ed è stata valutata l'importanza discriminativa dei singoli SNP mediante un costrutto tecnico, noto come profondità del grafico [37,40]. Come nel nostro studio pilota [37], la capacità predittiva degli SNP testati è stata visualizzata e quantificata rispettivamente dalle curve ROC (caratteristica operativa del ricevitore) e dall'AUC (area sotto la curva ROC). La capacità discriminativa dei predittori è data nell'intervallo dell'AUC dal 100% (capacità discriminativa massima) fino al 50% (capacità discriminativa minima); Un'AUC < 50% corrisponde a nessuna capacità discriminativa.

L'algoritmo RF è stato addestrato nelle seguenti modalità: (1) con tre o sei (Tabella 8) particolari SNP A1 (ciascun SNP, tre genotipi (AMAM/AMAm/AmAm, dove AM sta per allele maggiore e Am per allele minore), come predittore (tre o sei modelli RF, uno per ciascun SNP), (2) con doppiette genotipiche degli SNP accoppiati come predittori (tre modelli RF (tre SNP) o 15 modelli RF (sei SNP), uno per ciascuna coppia di SNP; Tabella 8), (3) con triplette genotipiche dei tre SNP come predittori (un modello RF (tre SNP) o 20 modelli RF (sei SNP), uno per ciascuna tripletta di SNP; Tabella 8), (4) con quadruple genotipiche dei sei SNP come predittori (15 modelli RF, uno per ciascuna quadrupla; Tabella 8), (5) con quintine genotipiche dei sei SNP come predittori (sei modelli RF, uno per ciascuna quintina; Tabella 8) e ( 6) con una sestina genotipica (un modello RF, Tabella 8).

Pertanto, quando singoli, gemelli, terzini, quadrupli, quintuple e la sestina di SNP A1 venivano utilizzati come predittori, non avevano alcuna capacità di discriminare tra i pazienti con PD e i controlli (Tabella 8). Pertanto, secondo l’analisi RF-ML e in accordo con lo studio pilota [37], gli SNP A1 non hanno il potenziale per fungere da discriminatori tra controlli e pazienti con PD e, riguardo alla PD, non hanno alcun valore predittivo o diagnostico nella popolazione slovacca. .

3. Discussione

Il locus PARK16 ha attirato l'attenzione della comunità scientifica a causa della sua associazione con la malattia di Parkinson e del suo ruolo discusso nel definire la suscettibilità a questa complessa malattia. Nel 2019, abbiamo riportato uno studio pilota in cui abbiamo analizzato l'associazione dei tre SNP A1, vale a dire rs11240569, rs708727 e rs823156, con la forma idiopatica della malattia di Parkinson nella popolazione slovacca (slavi occidentali). L’associazione riportata di rs11240569 e rs823156 con suscettibilità alla malattia di Parkinson principalmente nelle popolazioni asiatiche/orientali non è stata trovata nel nostro studio [37]. Nessuna associazione ha potuto essere confermata utilizzando la statistica frequentista (analisi genetica conservativa) o l'analisi RF-ML [37].

La limitazione principale del nostro studio pilota è stata, tuttavia, il numero relativamente basso di pazienti/probandi nelle coorti PD e di controllo (150 e 120, rispettivamente). Abbiamo sottolineato che, da un punto di vista statistico, i dati dovevano essere interpretati con cautela a causa della piccola dimensione del campione in entrambe le coorti e a causa del basso potere statistico delle analisi eseguite [37]. Tuttavia, utilizzando l'approccio ML, che richiede dimensioni del campione notevolmente inferiori rispetto alle statistiche frequentiste convenzionali o al calcolo bayesiano approssimativo, siamo stati in grado di esaminare con sicurezza la capacità di particolari SNP A1 di discriminare tra pazienti con PD e controlli. In tutti i casi, l’approccio ML ha rivelato una rilevanza diagnostica e predittiva sostanzialmente nulla degli SNP rs11240569, rs708727 e rs823156 nella popolazione slovacca [37].

In questo studio, abbiamo esaminato non solo i tre SNP sopra menzionati, ma anche i tre SNP (rs9438393, rs56152218 e rs61822602) localizzati all'interno della regione del promotore di A1. Questi SNP sono stati identificati mediante il sequenziamento di 96 campioni PD seguito dall'analisi RFLP dei campioni di controllo e dalla verifica RFLP dei campioni PD sequenziati. Le nostre analisi genetiche non hanno rivelato essenzialmente alcuna associazione tra nessuno dei tre SNP recentemente studiati e la malattia di Parkinson. Lo stesso vale per rs11240569 e rs823156, che sono stati analizzati nelle sottocoorti PD e di controllo (96/100) e anche nelle coorti di 508 pazienti PD e 472 controlli. Questi risultati sono in completo accordo con l’esito dello studio pilota [37]. Tuttavia, nelle coorti più ampie, rs708727 è associato ad un aumento del rischio di PD nella popolazione slovacca.

Per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha ancora associato direttamente A1 SNP rs708727 con un rischio alterato di sviluppare la malattia di Parkinson [19,37]. Nel nostro studio ampliato (rispetto allo studio pilota [37]), l’allele minore A in rs708727 è associato ad un aumento del rischio di insorgenza della malattia di Parkinson quando testato in dominante [40] (ORD=1.36 (1,05– 1,77), p=0.02) o completamente sovradominante [41] (modelli ORCOD=1.34 (1,04–1,72), p=0.02) (Tabella 5). Pertanto, la presenza dell'allele minore (A) in rs708727 potrebbe essere associata ad un aumento del rischio di sviluppare la malattia di Parkinson. Mentre Sanchez-Mut et al. [27] e Wang et al. [42] hanno chiaramente dimostrato che la presenza dell'allele minore A in rs708727 altera la metilazione del promotore PM20D1 (e, quindi, la sua espressione) in modo dose-dipendente (quantitativo), i modelli genetici più adatti nel nostro studio indicano che la presenza di un allele A rs708727 è sufficiente per alterare la suscettibilità all'insorgenza della PD. La suscettibilità alla PD (fenotipo), ovvero se una o due copie dell'allele minore sono presenti in rs708727 (genotipo), resta da chiarire ulteriormente in dettaglio.
Sanchez-Mut et al. hanno identificato PM20D1 (localizzato all'interno del locus PARK16 e codificante per il dominio della peptidasi M20- contenente la proteina un enzima con attività sia idrolasi che peptidasi; N-grasso acil aminoacido sintasi/idrolasi) come un tratto quantitativo di metilazione ed espressione locus (mQTL) accoppiato a un aplotipo associato al rischio di AD, che mostra caratteristiche simili al potenziatore e contatta il promotore PM20D1 tramite un loop di cromatina mediato dal fattore di trascrizione CTCF (associazione CCCTC) aplotipo-dipendente [27]. Confrontando campioni provenienti da controlli sani e pazienti con AD in stadio avanzato, hanno scoperto che PM20D1 mostra costantemente l'ipermetilazione del promotore nei pazienti con AD [27]. A1 SNP rs708727 è correlato ai livelli di metilazione del DNA PM20D1 nella corteccia frontale umana e nell'ippocampo [27], così come SNP rs960603 [27]. Wang e colleghi, nel loro lavoro sul sangue periferico, hanno acquisito dati che confermano che PM20D1 è un mQTL mediato principalmente dall'SNP A1 rs708727 associato al rischio di AD [42].

Inoltre, i loro dati longitudinali dimostrano che l’ipometilazione avviene prima dell’inizio sintomatico dell’AD, presumibilmente per facilitare la crescente espressione di PM20D1 per attivare la sua funzione protettiva [42]. Il progresso dell'AD è caratterizzato da un crescente livello di metilazione nelle isole CpG nella DMR (regione differenzialmente metilata) del promotore PM20D1 nei pazienti con AD, che alla fine porta all'inibizione della trascrizione e dell'espressione genica [27,42,43]. PM20D1 è stato anche associato al diabete [44], all'obesità [45] e alla sclerosi multipla [46] e, poiché è localizzato all'interno del locus PARK16, si presume il suo possibile coinvolgimento/associazione con la malattia di Parkinson [47].

Nonostante la mancanza di analisi meccanicistiche molecolari, ipotizziamo, alla luce dei nostri dati attuali, che l'AD e la PD (e altre malattie neurodegenerative meno frequenti) condividano non solo meccanismi fisiopatologici "ben noti" (ad esempio, mitofagia disturbata, retromero e proteasoma). funzioni), ma anche meccanismi epigenetici, come la regolazione dipendente da A1 rs708727-dell'espressione di PM20D1 [27,42]. Il nostro lavoro si aggiunge indirettamente alla necessità di una delucidazione dettagliata del ruolo degli amminoacidi N-acil endogeni (NAA) che vengono metabolizzati dal PM20D1 nella patobiologia della malattia di Parkinson e di altri disturbi neurodegenerativi. È ormai noto che gli NAA e i coniugati N-acilici dei neurotrasmettitori (NAAN) svolgono un ruolo importante nella neuromodulazione [48,49]. La prova che collega l'espressione di PM20D1 con la N-acil dopamina (NADA) è stata fornita dal recente lavoro di Song et al. Questi autori hanno dimostrato che la delezione di kir6.2 (una subunità che forma pori dei canali K+ sensibili all'ATP) porta ad una riduzione del conteggio dei mitocondri e ad una diminuzione della produzione di ATP attraverso un aumento dei livelli di PM20D1 e degli agenti che disaccoppiano la respirazione mitocondriale , incluso NADA, nel mesencefalo murino [49].

NADA è un potente inibitore della 5-lipossigenasi (5-LOX) e ha una distribuzione limitata al cervello con livelli più alti nello striato e molto bassi altrove [48,50,51]. 5-LOX catalizza la sintesi del leucotriene o 5-HpETE (5-acido idroperossiicosatetraenoico) dall'acido arachidonico ed è stato associato alla neurodegenerazione (AD e PD) attraverso il suo coinvolgimento nella neuroinfiammazione [51, 52]. Suggeriamo quindi che la ridotta espressione di PM20D1, la conseguente minore abbondanza di NADA e l'aumentata attività di 5-LOX contribuiscano in modo significativo alla patologia del PD (e di altre malattie neurodegenerative).

Sanchez-Mut e colleghi hanno dimostrato che la sovraespressione di PM20D1 nell'ippocampo murino di AD determina un miglioramento dell'apprendimento, mentre il suo abbattimento aumenta il carico della placca amiloide [27]. Sia la patologia di tipo Lewy che quella di tipo Alzheimer sono importanti nella demenza correlata alla malattia di Parkinson [53]. Un gruppo significativo di pazienti con PD soffre di un peggioramento della demenza durante la malattia [54]. Prendendo in considerazione queste osservazioni, ipotizziamo se l'attività collegata a rs708727-che silenzia PM20D1 contribuisca all'insorgenza della demenza PD e se il monitoraggio dell'attività PM20D1 possa servire come parametro prognostico per l'insorgenza della demenza PD.

Lavori precedentemente pubblicati hanno suggerito il coinvolgimento dei trasportatori Mg2+ nella patobiologia del PD [18–22,55]. A1, essendo l'attore chiave nell'omeostasi del Mg delle cellule somatiche, è stato collegato direttamente al PD [20–22]. Mutazioni puntiformi in A1 che portano alle sostituzioni p.A350V, p.R244H e p.R285Q sono state presumibilmente associate alla PD, e si presume che sia la mancanza di funzione che la perdita di funzione delle mutazioni in A1 abbiano conseguenze dannose sui neuroni, quindi contribuendo al fenotipo PD [20-22]. Questo lavoro indica indirettamente la possibilità che non solo le perturbazioni della funzione principale di A1 (scambio Na+/Mg2+), ma anche la regolazione epigenetica A1-linked (rs708727) dell'espressione (e dell'attività) di PM20D1, contribuiscano a la patobiologia del PD.

In questo studio, abbiamo identificato la tripletta genotipica GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) come potenzialmente clinicamente significativa (h maggiore o uguale a 0,5). È interessante notare che rs708727 con genotipo GG fa parte della tripletta. Tuttavia, alla luce delle ricerche precedenti, ci si aspetterebbe che il genotipo contenente l'allele minore A in rs708727 fosse collegato a un potenziale rischio di malattia di Parkinson associato a questa tripletta. Attualmente, non siamo in grado di commentare alcuna interazione molecolare/genetica/epigenetica che coinvolga gli SNP nella tripletta GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602), e quindi, su qualsiasi presunto contributo di questa tripletta ad una somma del rischio di insorgenza della PD.

Nel nostro studio pilota, abbiamo utilizzato RF-ML per valutare e interpretare i nostri dati [37]. Il vantaggio principale dell'analisi dei dati RF-ML è duplice, come segue: (1) consente di quantificare la capacità discriminativa degli SNP tra pazienti con PD e controlli [37] e (2) richiede dimensioni del campione inferiori per la valutazione di l'importanza discriminativa dei singoli SNP o delle loro combinazioni [37]. Inoltre, RF-ML aggira il problema del valore p spesso associato a campioni più grandi, anche quando sono disponibili [56]. Come nel nostro precedente rapporto, nessuno degli SNP A1 testati ha dimostrato di avere il potere di discriminare tra pazienti con PD e probandi non PD nella nostra coorte (Tabella 8). Pertanto, possiamo supporre che nessuno degli SNP A1 testati sia adatto a fungere da discriminatore PD/non-PD nella popolazione slovacca.

Per quanto riguarda l'associazione di A1 rs708727 con un rischio alterato di PD, il risultato della nostra analisi RF-ML sembra essere, a prima vista, contraddittorio (Tabelle 5 e 6 rispetto alla Tabella 8). Jakobsdottir et al. nella loro regressione logistica e le analisi della curva ROC hanno mostrato che anche forti associazioni genetiche non garantiscono automaticamente un'efficace discriminazione tra casi e controlli [57]. Nonostante siano scarsi classificatori, gli SNP con OR significativo potrebbero essere molto utili per stabilire ipotesi eziologiche [57]. Nel nostro caso, A1 SNP rs708727 non ha alcun potere di classificazione per quanto riguarda la PD, quindi non ha alcuna importanza clinica. Tuttavia, la sua debole, ma significativa associazione con il rischio alterato di PD ci ha permesso di speculare sul coinvolgimento di rs708727 nella patobiologia del PD in modo simile o uguale a come è coinvolto nell'AD [27].

4. Materiali e metodi

4.1. Partecipanti allo studio (caratteristiche di base)

In totale, sono stati inclusi nello studio 980 probandi (508 pazienti con malattia di Parkinson e 472 controlli, che soddisfacevano i criteri inclusivi). La forma idiopatica della malattia di Parkinson è stata diagnosticata dai neurologi in cinque centri diagnostici della malattia di Parkinson (a Martin, Bratislava, Trencin, Zvolen e Kosice) secondo i criteri diagnostici della malattia di Parkinson della MDS (Movement Disorder Society). Tutti i pazienti sono stati trattati con terapia anti-PD standard. L'età media dei pazienti con PD era di 68,4 ± 9,6 anni. L'età media di insorgenza della malattia era di 61,7 ± 10,7 anni. Il caso più giovane è stato diagnosticato all’età di 34 anni e il caso più anziano a 89 anni. Il gruppo PD era composto da 202 pazienti di sesso femminile (F) e 306 di sesso maschile (M) e, quindi, il rapporto F: M era 1:1,5.

La coorte di controllo dei probandi era composta da pazienti in uscita e in arrivo dalla Clinica di Medicina del Lavoro e Tossicologia (Ospedale Universitario Martin (UHM)) e dalla Clinica Neurologica (UHM). Solo i pazienti a cui non era stata precedentemente diagnosticata alcuna malattia neurodegenerativa e neuropsichiatrica, come il diabete mellito o l'osteoporosi (tutte malattie presumibilmente associate all'alterata espressione di A1 e alla deregolazione della funzione A1), sono stati arruolati nel gruppo di studio di controllo. L'età media dei probandi di controllo era di 68,3 ± 11,6 anni. Il gruppo di controllo era composto da 208 individui di sesso femminile e 264 di sesso maschile e, quindi, il rapporto F:M era 1:1,3 nel gruppo di controllo.

La sotto-coorte di pazienti con PD, in cui è stata sequenziata la regione del promotore A1, era composta da 96 soggetti selezionati casualmente. Il rapporto F:M era 1:1,3 (42 femmine e 54 maschi). L'età media dei pazienti nella sotto-coorte PD era di 67,{{10}} ± 9,5 anni. La sottocoorte di controllo era composta da 41 femmine e 59 maschi, quindi il rapporto F:M era 1:1,4. L'età media dei probandi nella sotto-coorte di controllo era di 59,8 ± 5,0 anni.

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina Jessenius, Università Comenius (JFM CU). L'approvazione è stata registrata con l'ID: EK 66/2019. Tutti i partecipanti allo studio hanno firmato moduli di consenso informato.

4.2. Elaborazione del campione

I campioni di sangue sono stati raccolti in provette BD Vacutainer® trattate con EDTA (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA). Il DNA genomico è stato isolato da campioni di sangue fresco (UHM) o congelato (altri centri PD) utilizzando il kit di purificazione del DNA genomico Wizard® (Promega Corporation, Maddison, WI, USA) secondo il protocollo del produttore. I campioni di DNA isolati sono stati conservati a -80 ◦C.

4.3. Genotipizzazione

La genotipizzazione è stata eseguita su 358 campioni PD e 352 campioni di controllo. I risultati di questi esperimenti sono stati analizzati insieme ai risultati precedentemente riportati da Cibulka et al. [37]. Gli SNP rs11240569, rs708727 e rs823156 sono stati analizzati utilizzando le sonde di genotipizzazione TaqMan® C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 e C_9238453_10/rs708727 (tutte Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA) nello stesso modo riportato in precedenza [37].

4.4. Sequenza di Sanger

La regione del promotore è stata divisa in quattro frammenti/ampliconi sovrapposti, poiché era troppo lunga per una singola corsa di sequenziamento. Prima di essere sequenziate, le regioni target sono state amplificate. I primer sono stati progettati utilizzando lo strumento online Primer3Plus [https://primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (accesso il 3 maggio 2018)]. Ciascuna coppia di primer è stata controllata per la presenza di più prodotti di amplificazione mediante lo strumento online PCR UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (accesso il 3 maggio 2018)].

I primer e i programmi PCR utilizzati per l'amplificazione dei quattro frammenti sono riepilogati nelle Tabelle supplementari S1 e S2. Le composizioni delle master mix per ciascun frammento sono riepilogate in SA3. I frammenti 3 e 4 hanno un alto contenuto di nucleotidi G e C (rispettivamente 67,4% e 71,9%). La resa della reazione è stata aumentata mediante l'aggiunta del 10× GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Tartu, Estonia). Il prodotto PCR è stato purificato utilizzando NucleoSpinTM Gel e un kit di pulizia PCR (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Germania). Nella fase successiva, il prodotto PCR purificato è stato diluito a una concentrazione appropriata per il pre-sequenziamento della PCR (SA4, SA5). Nella PCR di pre-sequenziamento sono stati utilizzati solo primer forward (fw). La miscela di reazione includeva anche BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) e dideossinucleotidi.

Come risultato, abbiamo ottenuto una miscela di prodotti di varie dimensioni terminati da dideossinucleotidi marcati con fluorescenza. I prodotti sono stati successivamente purificati utilizzando il kit SigmaSpin Sequencing Reaction Clean-Up (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) secondo il protocollo del produttore. Un volume di 3 µl di prodotto purificato è stato trasferito in una piastra a pozzetti 96- insieme a 12 µl di formammide deionizzata di alta qualità (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). La miscela è stata denaturata per 5 minuti a 95 ◦C in un termociclatore. I frammenti sono stati separati sul 8-dispositivo microcapillare ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Le sequenze sono state esportate e visualizzate dal software Chromas (Technelysium Pty Ltd., South Brisbane, Australia). I file FASTA sono stati caricati su BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) e allineati al genoma umano di riferimento (versione GRCh38.p12).

La previsione dei siti di legame dei fattori di trascrizione e delle loro alterazioni è stata eseguita dallo strumento online ConSite [disponibile su: http://consite.genereg.net/ (accesso il 3 settembre 2020)] [38]. Sono state caricate le sequenze con l'allele maggiore e l'allele minore e sono stati generati gli spettri dei fattori di trascrizione (TF). L'analisi è stata eseguita senza preimpostare la specificità minima. Le modifiche nei profili di legame TF in base alla presenza di varianti sono riepilogate nella Tabella 2.

4.5. Analisi RFLP (Polimorfismo della Lunghezza dei Frammenti di Restrizione).

I componenti della miscela di reazione e le condizioni della PCR amplificata sono riepilogati in SA6 e SA7. Lo strumento online in silico NEBCutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (accesso effettuato il 14 febbraio 2020)] è stato utilizzato per progettare le restrizioni degli ampliconi. Per l'analisi RFLP sono stati scelti i seguenti enzimi di restrizione: Hpy166II (rilevamento di rs9438393), NIaIII (rilevamento di rs56152218) e BmrI (rilevamento di rs61822602). Tutti gli enzimi sono stati acquistati dai Biolab del New England. Per la variante rs144056491, non siamo stati in grado di progettare un esperimento RFLP poiché non era disponibile alcun enzima adatto. A seguito della restrizione, ci aspettavamo che i frammenti riassunti in SA8 formassero la resa. Dopo la restrizione, i prodotti sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio (gel NIaIII e Hpy166II 1%; gel BmrI 2%) e quindi visualizzati su uno strumento PharosFX (Bio-Rad Laboratories). Sono stati determinati i genotipi per ciascun SNV.

4.6. Analisi dei dati

I dati sono stati esplorati e analizzati utilizzando R [R Core Team (2021); R: un linguaggio e un ambiente per il calcolo statistico. Fondazione R per il calcolo statistico, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/, ver. 4.0.5 (2021-03-31)]. Uno studio di associazione genetica (GAS) e un'analisi di potenza sono stati eseguiti utilizzando le librerie R HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Esplorazione dei marcatori genetici diallelici: il pacchetto HardyWeinberg. Giornale del software statistico, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli et al. (2021); DescTools: strumenti per statistiche descrittive. Versione del pacchetto R 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Strumenti di epidemiologia. Pacchetto R versione 0.5-10.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stephane Champely (2020); pwr: funzioni di base per l'analisi della potenza. Pacchetto R versione 1.3-0. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] e un codice sviluppato internamente. La modellazione predittiva di RandomForest è stata eseguita con la libreria R randomForestSRC [Ishwaran H. e Kogalur UB (2021); Fast Unified RandomForests for Survival, Regression, and Classification (RF-SRC), pacchetto R versione 2.11.0.]. I dati sono stati visualizzati dalla libreria R beeswarm [Aron Eklund (2021); beeswarm: il grafico dello sciame di api, un'alternativa a Stripchart. Pacchetto R versione 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. L'ANOVA a una via è stata utilizzata per testare l'ipotesi nulla di uguaglianza dell'età media di insorgenza della popolazione per le sottopopolazioni di tre genotipi per ciascun SNP. I risultati con un valore p inferiore a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

5. Conclusioni

In sintesi, i nostri dati suggeriscono un'associazione debole, ma significativa, di A1 SNP rs708727 con PD in modelli genetici dominanti e sovradominanti in una popolazione slovacca. Nessuno degli altri SNP A1 testati (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 e rs61822602) era associato alla malattia in nessuno dei modelli genetici testati. Le analisi RF-ML hanno identificato tutti gli SNP A1 testati come scarsi classificatori/predittori della malattia di Parkinson, pertanto il loro utilizzo nella pratica clinica come marcatori diagnostici o prognostici rimane trascurabile. Tuttavia, l'associazione di rs708727 con la malattia di Parkinson ci ha permesso di ipotizzare che l'allele minore associato al rischio di malattia di Parkinson (G > A) in rs708727 contribuisca all'insorgenza e alla progressione della malattia attraverso lo squilibrio della regolazione epigenetica dell'espressione PM20D1, il meccanismo noto per svolgere un ruolo in patobiologia dell'AD. Questa ipotesi dovrebbe essere ulteriormente esaminata per fare una dichiarazione conclusiva. Inoltre, dovrebbe essere chiarita una possibile associazione tra demenza associata alla malattia di Parkinson e rs708727.

Contributi dell'autore:

Concettualizzazione, MK; metodologia, MK, MC, MG (Marian Grendar) e MB; software, MG (Marian Grendar); convalida, MC, MB e MK; analisi formale, MK, MG (Marian Grendar), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS e MG (Milan Grofik); indagine, MC e MB; data curation, MC, MB, MG (Marian Grendar), MG (Milan Grofik), JN, VN ed EK; scrittura: preparazione della bozza originale, MK; scrittura: revisione e editing, MC, MG (Marian Grendar) e ZP; visualizzazione, MK, MC e MG (Marian Grendar); supervisione, MK; amministrazione del progetto, MC, MK, MG (Milano Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS e BV; acquisizione di finanziamenti, MK Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento:

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia slovacca per la ricerca e lo sviluppo, numero di sovvenzione APVV-19-0222, e dall'Agenzia per i finanziamenti scientifici del Ministero dell'Istruzione, della scienza, della ricerca e dello sport della Repubblica slovacca e dall'Accademia slovacca delle scienze, numero di sovvenzione VEGA 1/0554/19, entrambi a MK

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale:

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina Jessenius, Università Comenius (JFM CU). L'approvazione è stata registrata con l'ID: EK 66/2019.

Dichiarazione di consenso informato:

Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati:

Il dataset completo è contenuto all'interno dell'articolo. La natura e la portata dei dati inclusi consentono ulteriori meta-analisi. Qualsiasi informazione riguardante lo studio è disponibile su richiesta presso l'autore corrispondente.

Ringraziamenti:

Ringraziamo tutti i partecipanti allo studio e i loro familiari. Estendiamo i nostri ringraziamenti anche a Martin Marak (JFM CU) per il suo competente supporto tecnico al progetto, a Jan Radvanszky e Rastislav Hekel (entrambi GENETON sro) per gli utili consigli sulle analisi del promotore A1, e a Theresa Jones per l'editing linguistico del manoscritto.

Conflitto di interessi:

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

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