Profilo aminoacidico e proprietà biologiche del bozzolo di seta come influenzato dall'estrazione di acqua ed enzimi Parte 1

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Astratto:Abbiamo confrontato l'efficacia per l'estrazione proteica dell'acqua rispetto all'estrazione enzimatica. La composizione aminoacidica, attività inibitoria nei confronti degli enzimi-amilasie-glucosidasie sono state determinate le attività anti-glicazione dell'estratto di proteine ​​della seta (SPE). Abbiamo usato l'estrazione dell'acqua (100 gradi, sei ore) e proteasi-enzimaticoestrazione. La microstruttura delle fibre di seta era ovviamente diversa dopo l'estrazione. I risultati hanno mostrato che l'estrazione enzimatica ha dato i maggiori valori di contenuto proteico, aminoacidi, contenuto fenolico totale (TPC) eflavonoidecontenuto (TFC), così come tutti i parametri delle attività biologiche testati, ma ha anche fornito un sapore più amaro nell'estratto: aminoacidi che contribuiscono al 51% (arginina, fenilalanina, istidina, valina, triptofano, isoleucina e leucina) e meno dolce e umami che contribuiscono agli amminoacidi rispetto all'estrazione dell'acqua, che potrebbe essere più adatta per essere utilizzata come nutraceutici concentrati.

Parole chiave:proteine ​​della seta; proteasi; serina;acido glutammico; o-amilasi; sapore amaro

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1. Introduzione

La seta è una fibra proteica composta da sericina e fibroina; di questi, la proteina della fibroina comprende dal 70% all'80% della fibra di seta. Ha domini amorfi e cristallini con brevi catene amminoacidiche che gli consentono di mantenere la sua struttura compatta [1]. La sericina è una proteina globulare che costituisce circa il 20-30 percento della fibra di seta. Il suo ruolo è quello di rivestire e collegare insieme i filamenti di fibroina nei bozzoli del baco da seta [2]. Le proteine, sericina e fibroina, sono state ampiamente studiate per applicazioni mediche grazie alle loro buone proprietà fisico-chimiche e attività biologiche, come antiossidante, antinfiammatorio, biocompatibilità, accelerazione della proliferazione cellulare e attivazione della sintesi del collagene. Nell'industria della seta, la sericina viene rimossa dalla fibroina e successivamente scartata. Tuttavia, è stato dimostrato che questa proteina presenta proprietà interessanti, che possono permetterne l'applicazione in diversi campi. Per le sue capacità idratanti e antirughe, la sericina è un composto interessante nell'industria cosmetica [3,4]. Inoltre, la sericina è stata studiata per i suoi scopi biomedici, come un biomateriale e per la somministrazione di farmaci [5-8], principalmente perché è stato segnalato che è immunologicamente inerte [6]. L'attività antiossidante della sericina è una delle sue proprietà più significative perché potrebbe fornire effetti positivi per la salute umana e nell'industria alimentare come conservante alimentare naturale [9].

Cistanche può migliorare l'immunità

Il nostro studio precedente ha mostrato che i bozzoli di seta, estratti con acqua bollente per sei ore, fornivano i migliori risultati per quanto riguarda i profili aminoacidici, il contenuto fenolico e flavonoide totale e le proprietà biologiche, tra cui anti-glicazione, o-amilasi e c- inibizione della glucosidasi [10]. Tuttavia, sebbene i nostri risultati abbiano rivelato che tempi di estrazione più lunghi offrivano valori biologici maggiori, l'estratto più concentrato è necessario per la produzione di nutraceutici o cosmetici oltre agli alimenti funzionali. Per esplorare più potenziali usi dei componenti del bozzolo di seta, è necessario impiegare altri metodi di estrazione, come (1)l'estrazione con detergenti e saponi che portano alla denaturalizzazione delle proteine ​​e all'idrolisi parziale delle catene dei filamenti di seta [5]: carbonato di sodio[11] , idrossido di calcio [12] e detergenti non ionici [13] sono stati utilizzati per il processo di sgommatura, (2) estrazione con vapore mediante autoclave: a causa dell'elevata temperatura applicata, i legami idrogeno tra i gruppi ossidrilici diventano instabili consentendo all'acqua di interagiscono con gli amminoacidi polari della sericina [14]. Il peso molecolare dei campioni ottenuti è compreso tra 27 e 200 kDa[15],(3)estrazione enzimatica, ecc. L'estrazione enzimatica è normalmente utilizzata per il frazionamento di materia prima vegetale e per l'estrazione di molecole in un maniera innocua [16].

nutraceutici o cosmetici oltre agli alimenti funzionali. Per esplorare più potenziali usi dei componenti del bozzolo di seta, è necessario utilizzare altri metodi di estrazione, come (1)l'estrazione con detergenti e saponi che portano alla denaturalizzazione delle proteine ​​e all'idrolisi parziale delle catene dei filamenti di seta[5]: carbonato di sodio[11] , idrossido di calcio [12] e detergenti non ionici [13] sono stati utilizzati per il processo di sgommatura, (2) estrazione con vapore mediante autoclave: a causa dell'elevata temperatura applicata, i legami idrogeno tra i gruppi ossidrilici diventano instabili consentendo all'acqua di interagiscono con gli amminoacidi polari della sericina [14]. Il peso molecolare dei campioni ottenuti è compreso tra 27 e 200 kDa [15], (3) estrazione enzimatica, ecc. L'estrazione enzimatica è normalmente utilizzata per il frazionamento di materia prima vegetale e per l'estrazione di molecole in un maniera innocua [16].

Ci sono stati molti studi che utilizzano l'estrazione enzimatica per il miglioramento della qualità. Ad esempio, Sangwong et al. [17] hanno utilizzato un enzima proteasi per modificare la sericina estratta dai bozzoli; i risultati ottenuti in questo studio suggeriscono che la proteina sericina, modificata mediante un enzima proteasi, potrebbe essere adottata come ingrediente in applicazioni alimentari e cosmetiche. Il dosaggio dell'enzima e il tempo di trattamento influenzano la cinetica del processo. Inoltre, le proprietà chimiche dei peptidi di sericina solubili variano a seconda dell'enzima utilizzato. Si ottengono peptidi nell'intervallo da 5 a 20 kDa e questi sono privi di alcali e acidi grassi [18]. Mentre questo approccio è leggermente più costoso delle tecniche sopra descritte, è richiesta meno energia. Di conseguenza, questo processo diventa più sostenibile [19]. È stato inoltre valutato l'uso combinato di enzimi (savinasi e alcalde) e ultrasuoni per estrarre la sericina dalla fibra di seta. In questo caso, l'efficacia del processo di sgommatura è aumentata insieme al tempo di trattamento. Tuttavia, l'integrità della sericina isolata non è stata studiata [13]. Allo stesso modo, è stata recentemente isolata una serina proteasi alcalina termostabile da un batterio (Bacillus hallodurans) in grado di rimuovere la sericina dalla seta. Questa nuova proteasi ha mostrato una maggiore capacità di sgommatura rispetto alle proteasi Alcalasi commerciali [20]. Tuttavia, ci sono poche informazioni riportate sul confronto della composizione chimica e delle proprietà biologiche dei bozzoli di seta tailandesi dall'acqua e dall'estrazione enzimatica.

Pertanto, abbiamo mirato a confrontare l'estrazione dell'acqua rispetto a quella enzimatica sui profili amminoacidici, il contenuto fenolico totale e flavonoidi, le proprietà biologiche, l'inibizione dell'anti-glicazione, della x-amilasi e della -glucosidasi rispetto all'ottimizzazione del metodo di estrazione delle proteine ​​della seta. Il ceppo Nangtui è stato selezionato come il più popolare coltivato nel nord-est della Thailandia (Bombyx mori; bozzolo giallo). Ci aspettavamo di generare informazioni utili per usi più ampi di questo estratto proteico della seta. Questo studio dovrebbe anche fornire una base utile per migliorare la lavorazione e la produzione di prodotti alimentari funzionali.

2. Risultati e discussione 2.1. Microstruttura delle fibre di seta

La microstruttura delle fibre di seta era ovviamente diversa dopo l'estrazione. Il SEM e le dimensioni dell'immagine espanse a 200 × e 1200 × hanno mostrato che le fibre di seta risultanti differivano confrontando i metodi di estrazione dell'acqua e degli enzimi. È possibile osservare che il controllo ha una superficie ampia e liscia rispetto all'estrazione con acqua, che ha prodotto un filo di seta che si è ristretto, con qualche frattura, rispetto all'estrazione enzimatica. Quest'ultimo metodo ha prodotto fili molto piccoli e rimpiccioliti (Figura 1). Questi risultati erano in accordo con Wongpinyochit et al. [21], che ipotizzano che gli enzimi proteolitici abbiano disturbato la geometria dell'imballaggio della seta, consentendo un maggiore ingresso di acqua, con conseguente rigonfiamento delle particelle. Contemporaneamente, la degradazione ha ridotto le cariche superficiali, consentendo ai prodotti di degradazione di accumularsi liberamente sulla superficie delle particelle rimanenti.

2.2. La differenza dovuta al metodo di estrazione sul contenuto di aminoacidi dell'estratto di proteine ​​della seta (SPE) e sul contenuto proteico

L'estrazione di SPE con enzimi fornisce un valore totale di aminoacidi essenziali tre volte superiore rispetto ai metodi di estrazione con acqua (Tabella 1), grazie all'uso di un enzima proteasi che ha rotto i legami peptidici delle molecole proteiche producendo aminoacidi liberi e peptidi più corti. La degradazione delle proteine ​​ha il vantaggio che gli enzimi sono altamente specifici per il rispettivo substrato. Pertanto, non sono necessarie grandi quantità di enzimi e possono degradare le proteine ​​in condizioni lievi. Inoltre, l'uso di enzimi ha un tasso di degradazione delle proteine ​​relativamente alto rispetto all'uso di acidi o alcali. Gli enzimi sono catalizzatori biologici che accelerano le velocità di un'ampia varietà di reazioni chimiche. Enzimi diversi possono causare reazioni di idrolisi, riduzione, ossidazione, coagulazione e decomposizione. Gli enzimi proteolitici o proteasi sono quegli enzimi che scindono idroliticamente il legame peptidico che lega insieme gli amminoacidi nelle catene polipeptidiche, degradando così le proteine ​​in molecole più piccole, come peptoni, peptidi e amminoacidi. Questi prodotti dei processi biotecnologici stanno trovando applicazioni più ampie nella medicina e nell'industria; l'uso di vari enzimi proteolitici è, quindi, aumentato enormemente negli ultimi anni [22-24]. Il risultato dell'aminoacido che ha portato all'estrazione enzimatica ha anche un contenuto proteico più elevato. L'estrazione per enzima fornisce il valore del contenuto proteico di 3 mg/g (Tabella 1). La resa di estrazione di SPE nell'acqua e nell'idrolizzato utilizzando l'enzima era rispettivamente del 43,31 e del 94,61 percento. L'estrazione dei bozzoli dall'acqua richiede molto tempo, facendo evaporare molta acqua con conseguente minore resa. In contrasto con l'uso di enzimi, sono state ottenute rese più elevate.

2.3.L'effetto del metodo di estrazione sui contributi di amminoacidi al gusto

La SPE ottenuta per estrazione con acqua o con enzima ha influenzato gli apporti al gusto (alanina, glicina e serina hanno un sapore dolce, arginina, fenilalanina, istidina, valina, triptofano, isoleucina e leucina hanno un sapore amaro e acido glutammico e acido aspartico sono umami). Le differenze di gusto risultanti (1; dolce, 2; umami: è il quinto gusto di base, oltre al gusto acido, dolce, salato e amaro che produce un gusto delizioso e 3; amaro) sono mostrate nella Figura 2. Estrazione con l'acqua o l'enzima danno i valori di sapore dolce, umami e amaro rispettivamente del 40, 33, 27 percento e 32,17, 51 percento. Tuttavia, l'idrolisi enzimatica delle proteine ​​può produrre composti con un sapore più amaro rispetto all'estrazione dell'acqua a causa della liberazione enzimatica di gruppi idrofobici di amminoacidi, come isoleucina, fenilalanina, triptofano, tirosina e valina [25]. Le proteasi con un'ampia specificità hanno la tendenza a idrolizzarsi ai residui di amminoacidi idrofobici, lasciando un residuo di amminoacido non polare al C-terminale del peptide formato. Questo porta a un'amarezza relativamente maggiore [26].

2.4. L'effetto del metodo di estrazione sul contenuto fenolico totale e sul contenuto totale di flavonoidi L'estrazione enzimatica di SPE ha mostrato il contenuto fenolico totale (TPC) e il contenuto totale di flavonoidi (TFC) più elevati rispettivamente di 87,65 mg GAE/g DW e 52,02 mg RE/g DW, rispettivamente (Figura 3) rispetto all'estrazione dell'acqua (con differenze significative tra il metodo (p<0.05). the="" phenolic="" and="" flavonoid="" profiles="" were="" also="" studied.="" the="" main="" phenolic="" acids="" found="" were="" gallic="" acid,="" protocatechuic="" acid,="" p-hydroxybenzoic="" acid,="" ferulic="" acid,="" and="" sinapic="" acid,="" whereas="" the="" major="" flavonoids="" found="" were="" rutin="" and="" myricetin="" (data="" not="" shown).="" protease="" treatment="" of="" spe="" significantly="" increased="" polyphenol="" and="" flavonoid="" contents.="" many="" reports="" have="" reported="" that="" the="" physiological="" function="" of="" natural="" foods="" can="" be="" attributed="" to="" the="" antioxidative="" capacity="" of="" their="" antioxidant="" components.="" the="" protease="" may="" have="" acted="" by="" catalyzing="" the="" hydrolytic="" degradation="" of="" intracellular="" organelles="" and="" cell="" membranes="" of="" protein="" nature="" [27-29].="" the="" increased="" release="" of="" polyphenols="" for="" the="" enzyme="" preparations="" suggests="" that="" these="" enzymes="" may="" contain="" activities="" that="" directly="" promote="" the="" selective="" release="" of="" antioxidant="" phenols="" or="" modify="" released="" phenols="" to="" become="" more="" potent="" antioxidant="" compounds.="" aside="" from="" the="" favorable="" effects="" of="" enzyme-aided="" extraction="" on="" bioactive="" compounds,="" a="" decrease="" in="" the="" anthocyanin="" content="" has="" been="" reported="" in="" fruit="" juice="">

2.5. Gli effetti del metodo di estrazione sull'attività di scavenging radicale DPPH, ABTS plus e il saggio FRAP

L'attività antiossidante di SPE con diversi metodi di estrazione è stata valutata determinando i radicali DPPH, ABTS plus e FRAP Assay, come mostrato nella Figura 4. Le attività di scavenging dei radicali liberi di SPE con diversi metodi di estrazione sono indicate dalla percentuale di inibizione. SPE dall'estrazione enzimatica ha mostrato i livelli più alti di radicali DPPH, ABTSf e FRAP di 26,32, 32.08 e 6,24% di inibizione, rispettivamente, mentre l'estrazione di acqua ha mostrato il più basso di 24,85, 30,19 e 5,01% di inibizione , rispettivamente (con differenze significative tra il metodo (p < 0,05).="" ci="" sono="" molte="" segnalazioni="" che="" il="" metodo="" di="" estrazione="" induce="" cambiamenti="" conformazionali="" e="" funzionali="" nelle="" proteine,="" inclusa="" l'attività="" antiossidante="" [17,30].="" è="" stato="" riportato="" che="" l'estrazione="" assistita="" da="" enzimi="" ha="" entrambi="" effetti="" negativi="" e="" favorevoli="" sui="" composti="" bioattivi.="" molti="" studi="" hanno="" riportato="" aumenti="" dell'attività="" antiossidante="" mediante="" estrazione="" assistita="" da="" enzimi,="" principalmente="" nelle="" piante="" [31].="" ad="" esempio,="" sanyo="" et="" al.="" [32]="" hanno="" riportato="" che="" la="" buccia="" di="" riso="" macinata="" trattata="" con="" cellulasi="" potrebbe="" migliorare="" le="" sue="" attività="" biologiche,="" fornendo="" così="" un="" prodotto="" più="" accettabile="" l'aumento="" o="" la="" diminuzione="" del="" potere="" ferrico="" riducente="" per="" gli="" idrolizzati="" proteici="" può="" essere="" correlato="" all'esposizione="" della="" catena="" laterale="" di="" amminoacidi="" elettron-densi="" gruppi,="" come="" le="" parti="" polari="" o="" cariche="" durante="" l'idrolisi="">

2.6. Attività inibitoria contro l'attività di formazione di a-amilasi, -glucosidasi e anti-AGE in SPE

La SPE aveva attività inibitoria contro gli enzimi c-amilasi e a-glucosidasi. Questa attività era più alta per l'estrazione enzimatica, che forniva una migliore inibizione rispetto alla proteina estratta dall'acqua (Figura 5). L'attività inibitoria contro la -amilasi e la -glucosidasi di SPE dall'acqua e dall'estrazione enzimatica erano rispettivamente del 29,18 e dell'11,23% di inibizione e le estrazioni enzimatiche erano rispettivamente del 31.{12}} e del 12,69% di inibizione (con differenze significative tra il metodo (pag<0.05). some="" researchers="" have="" reported="" that="" several="" amino="" acids="" act="" as="" α-glucosidase="" inhibitors.="" suzuki="" et="" al.="">

aveva inizialmente testato gli effetti inibitori di Gly o Ser e ha mostrato una certa attività di inibizione della -glucosidasi. Vari saggi in vitro hanno dimostrato che molti polifenoli vegetali possiedono attività inibitorie dell'enzima idrolizzante dei carboidrati. Alcuni composti, come i polifenoli del tè verde, gli antociani della patata dolce, l'isoflavone genisteina della soia e diversi flavonoidi, inibiscono le attività della -glucosidasi e della -amilasi [35,36]. Queste attività inibitorie dei fitochimici vegetali contro gli enzimi idrolizzanti dei carboidrati contribuiscono a ridurre l'iperglicemia postprandiale. Gli inibitori della glucosidasi, come l'acarbosio, si legano in modo competitivo al sito di legame degli oligosaccaridi della -glucosidasi o della -amilasi, che impedisce il legame e l'idrolisi enzimatica del substrato dell'oligosaccaride [37]. È quindi possibile che le attività inibitorie della -glucosidasi di questi composti derivino dal gruppo fenolico dell'acarbosio e dai polifenoli che si legano a questi enzimi.

Figura 5. L'effetto del metodo di estrazione sull'attività inibitoria contro l'enzima x-amilasi e -glucosidasi e le attività antiglicative di SPE. I valori sono espressi come media±deviazione standard (n=3). Le medie con lettere diverse su barre diverse erano significativamente diverse tra i trattamenti a p<>

Questo articolo è estratto da Molecules 2021, 26, 3455. https://doi.org/10.3390/molecules26113455 https://www.mdpi.com/journal/molecules