La gossipitrin, un flavonoide presente in natura, attenua il danno neuronale e mitocondriale indotto dal ferro: parte 2

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2.5. Rilevamento di complessi Gos-Fe(I).

Un'ipotesi plausibile per spiegare i risultati di cui sopra è che Gos formi un complesso transitorio con Fe(ll) che ne facilita l'ossidazione da parte dell'ossigeno. Questo complesso di transizione potrebbe fornire i suoi elettroni più prontamente del Fe()-citrato, generando un complesso più stabile con Fe(Ill). La Figura 6A mostra uno spettro tipico di Gos con assorbimento massimo a 276, 332 e 380 nm (linea nera). L'aggiunta di Fe() ha indotto un calo dipendente dalla concentrazione dei picchi di assorbimento massimi e la comparsa di uno nuovo vicino a 500 nm (Figura 6A). La presenza di un array di spettri originati dallo spettro Gos è stata confermata dalla presenza di un punto isosbestico a λiso{8}} nm （vedi punti neri）, che indica un equilibrio chimico (complessazione) tra Gos libero e complessato. L'inserto (Figura 6A) mostra la formazione di un complesso con stechiometria 2:1 (Gos-iron). La stechiometria di tali complessi Gos-ferro è stata determinata con il metodo di Job che mostra un punto di rottura con un rapporto molare di 0,5.

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Ulteriori prove sulla correlazione tra ferro e Gos sono state ottenute mediante spettroscopia IR (Figura 6B). Per il Gos libero e il suo complesso di ferro, la banda larga situata nell'intervallo di 3000-4000 cm-è stata considerata come lo stiramento dell'idrogeno- gruppi ossidrilici legati per la presenza di molecole d'acqua. La modalità di allungamento v(C=O) del Gos libero si verifica a 1654 cm-I, che è stata spostata verso la formazione del complesso di 1636 cm-Iupon. Questo risultato suggerisce che Fe(Ⅱ) è correlato all'ossigeno carbonilico [31]. Inoltre, la presenza della vibrazione di stiramento v(Fe-O) a 630 cm-I corrobora la formazione del complesso ferro-Gos, poiché il Gos libero non presenta tale banda.

Figura 6.(A)Effetti di Fe(II) sullo spettro Gos UV-VIS (200-600 nm). Miscela di incubazione contenente saccarosio 125 mM, KCl 65 mM, tampone HEPES 10 mM (pH 7,2), citrato 2 mM e Gos 1,6 μM. Le concentrazioni di Fe（I） dall'alto verso il basso erano {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96 e 1.12 μM.Inset∶ Grafico di Job per il complesso Gos-Fe（II） a una concentrazione totale costante 【Fe（D）】 più 【Gos】=1.6 μM. Il punto nero indica il punto isosbestico. Le frecce verso il basso e verso l'alto indicano una diminuzione e un aumento dei valori di assorbanza rispettivamente a 380 e 500 nm. Gli esperimenti sono stati condotti a 28 gradi. La velocità di scansione era di 2 nm/sA di riferimento è stata stabilita con la miscela di incubazione più 1,6 μM di Fe（I）.（B）Spettri a infrarossi di Gos e Gos-Fe（I）. Vengono mostrati esempi tipici.

2.6. Gos ha impedito la riduzione del Fe(III) da parte dell'ascorbato

Lo stato ferrico del ferro promosso dal Gos rappresenta un plausibile meccanismo antiossidante poiché ostacola l'attività catalitica del Fe(II). Tuttavia, il Fe(III) potrebbe ancora essere ridotto alla sua forma ferrosa da agenti riducenti naturali come l'ascorbato. Quest'ultimo potrebbe ricaricare i sistemi biologici con Fe(II), che partecipa alle reazioni di Fenton-Haber-Weiss, generando il radicale·OH estremamente reattivo. Per esaminare queste possibilità, abbiamo utilizzato 1,{3}}fenantrolina per misurare i livelli di formazione di Fe（II） da una soluzione di Gos （100 μM） trattata con 2 mM di ascorbato e diverse concentrazioni di Fe（II） （{{6} } μM）. La Figura 7 mostra che l'assenza di Gos ha consentito un tasso di riduzione massimo da Fe(II) a Fe(II) (linea nera con una pendenza di 5,85×{10}}); tuttavia questo processo è stato rallentato dalla presenza di Gos (1-min incubazione, linea verde) e dopo 5 min di incubazione con Gos, il tasso di riduzione di Fe(I) da parte dell'ascorbato è diminuito di quasi 3 volte (linea rossa con una pendenza di 2,04× 10-3). Questo risultato mostra la capacità di Gos di inibire la riduzione di Fe() mediata dall'ascorbato a Fe(I)

Figura 7. Gos inibisce la riduzione di Fe(ⅢI) da parte dell'ascorbato in assenza di mitocondri del fegato di ratto. Condizioni sperimentali: saccarosio 125 mM, KCl 65 mM, buffer HEPES 10 mM (pH7.2), citrato 1 mM, Gos 100μM. Gli esperimenti sono stati condotti a 28 gradi. Ascorbato（4 mM） e 5 mM 1,{13}}fenantrolina sono stati aggiunti dopo 1 min o 5 min di incubazione Gos-Fe(I). Le linee sono rappresentative di tre saggi.

2.7. Gos protegge dalla 2-degradazione ossidativa del desossiribosio

Per documentare la capacità di Gos di agire preferenzialmente sul ferro invece che sui radicali liberi, sono stati condotti studi di concorrenza per valutare l'efficacia di Gos e due·OH scavenger (DMSO e salicilato) nel proteggere 2,8 o 28 mM 2-deossiribosio dal ferro -danno ossidativo mediato (Figura 8). Gli scavenger di ·OH a 20 mM hanno protetto 28 mM 2-deossiribosio significativamente inferiore a 2,8 mM2-deossiribosio (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Figura 8. Effetto degli scavenger di Gos e·OH dimetilsolfossido (DMSO) e salicilato sul danno ossidativo a 2,8 o 28 mM 2-deossiribosio indotto da Fe(II)-EDTA più ascorbato. Le soluzioni sono state incubate per 30 min a 37 gradi e contenevano 10 mM di tampone fosfato (pH7,2),2-desossiribosio (2,8 o 28 mM）, 150 μM EDTA e 50 μM Fe（ⅢI） . Le reazioni sono state avviate mediante l'aggiunta di ascorbato a una concentrazione finale di 2 mM.Le barre mostrano la media±SD (n=3).I controlli contengono solo DMSO (0,001 percento), che è la concentrazione di solvente nei campioni di Gos. Il test t a una coda è stato utilizzato per*p<0.05, n.s.,="">

3. Discussione

Il ferro rilasciato in diverse condizioni neurodegenerative, tra cui ictus ischemico ed emorragico, provoca la deregolazione dell'omeostasi del ferro cerebrale, portando alla fisiopatologia del danno neurologico [4,32-34]. A livello subcellulare, la compromissione mitocondriale sembra essere coinvolta nella morte neuronale mediata dal ferro [10,15,{5}}]. L'evidenza preclinica supporta il vantaggio dell'uso di chelanti del ferro, principalmente deferoxamina mesilato, contro la neurodegenerazione, inclusi tutti i tipi di ictus [7,16]. Tuttavia, il loro costo elevato e la loro indisponibilità, e l'ampia gamma di effetti avversi dei chelanti del ferro classici, hanno portato all'uso di chelanti naturali per la gestione del ferro nella disomeostasi [39,40].

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L'azione protettiva di Gos è mostrata sulle cellule HT-22 e sui mitocondri del cervello di ratto incubati con una miscela di ferro/citrato, dove abbiamo trovato una forte protezione contro il danno ossidativo indotto dal ferro. Le cellule HT dell'ippocampo di topo -22 esposte a sovraccarico di ferro (24 h) hanno mostrato una ridotta vitalità, strettamente associata alla dissipazione del potenziale della membrana mitocondriale precoce e alla riduzione dell'ATP (Figura 2A-C, rispettivamente). Ciò suggerisce che la compromissione mitocondriale contribuisce alla letalità neuronale. Infatti, nelle nostre condizioni, almeno una parte di Fe(II) caricata sui neuroni dovrebbe raggiungere gli organelli, poiché la morte neuronale indotta dal ferro è stata preceduta dalla perdita della funzione mitocondriale. Pertanto, è stato dimostrato che il sovraccarico di ferro induce la morte cellulare dell'ippocampo di topo HT-22 e la frammentazione mitocondriale [41,42]. Allo stesso modo, l'esposizione prolungata al ferro aumenta i livelli di ROS mitocondriali nelle cellule SHSY5Y del neuroblastoma dopaminergico [43]. Inoltre, dopo l'esposizione a 100 uM di ferro ferroso, sono stati verificati un ampio afflusso di ferro nei neuroni dell'ippocampo, nonché un danno mitocondriale [36]. Qui abbiamo osservato che la conservazione indotta da Gos della vitalità dei neuroni dell'ippocampo colpiti dal ferro è strettamente correlata alla conservazione del loro potenziale di membrana mitocondriale e dei livelli di ATP.

Come nelle cellule intatte, l'esposizione mitocondriale diretta al ferro ferroso ha provocato l'esteso rigonfiamento dell'organello, la dissipazione del potenziale di membrana e la perdita di ATP (Figura 3A-C, rispettivamente). In questo ambiente sperimentale, Gos è stato in grado di proteggere il mitocondri sovraccarichi di ferro, che è stato espresso dalla conservazione dei parametri sopra menzionati. In questo senso, è stato osservato che i mitocondri carichi di una concentrazione micromolare di ferro subiscono l'apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale e △Y dissipazione in modo sensibile alla chelazione del ferro ma non dipendente dall'azione antiossidante della catalasi |44]. È interessante notare che l'antiossidante Mito-Tempo è stato segnalato per proteggere dai danni da sovraccarico di ferro nei neuroni dell'ippocampo eliminando il radicale anione superossido mitocondriale e preservando l'integrità morfologica mitocondriale e il potenziale di membrana [36]. Abbiamo recentemente descritto gli effetti antiossidanti di questo flavonoide e la sua capacità di proteggere le cellule PC12 dalla morte indotta dall'ipossia chimica [29], dove si è concluso che la capacità antiossidante e scavenging dei radicali liberi del Gos è in parte coinvolta nella protezione contro il ferro mediata HT-22 e danno mitocondriale. Tuttavia, la migliore efficacia di Gos contro la lipoperossidazione mediata dal ferro rispetto alla lipoperossidazione mediata da tertbutil idroperossido (Figura 4A, B, rispettivamente) suggerisce fortemente che la sua capacità di interazione con il ferro è il meccanismo principale contro il danno indotto dal ferro.

Per caratterizzare ulteriormente l'interazione Gos-Fe, sono stati eseguiti diversi esperimenti senza cellule e senza mitocondri. Abbiamo osservato che quando il polifenolo è stato co-incubato con Fe (II), la concentrazione degli ioni metallici diminuisce, mentre si è verificato un corrispondente aumento del tasso di consumo di ossigeno (Figura 5A-C). Questi effetti suggeriscono che Gos rimuove Fe(II) dal complesso citrato e lo ossida in una forma ferrica in un processo che richiede O2 come accettore di elettroni. Di conseguenza, il Gos promuove il declino della concentrazione di Fe(II) che può ostacolare i radicali idrossilici attraverso le reazioni di Fenton. Poiché il complesso Gos-Fe(II) consente l'ossidazione di agenti riducenti rilevanti come l'ascorbato, con conseguente formazione/rigenerazione di Fe(II), siamo stati in grado di dimostrare che il Gos inibisce la riduzione mediata dall'ascorbato di Fe(II) a Fe(II).

L'ipotesi che Gos interagisca fortemente con il ferro è stata anche qui confermata attraverso tecniche spettroscopiche e ha corroborato risultati precedenti in cui diversi array di

La stechiometria del complesso Gos-iron è stata caratterizzata mediante spettroscopia di massa a ionizzazione di spin elettronico [45].

Questi risultati hanno evidenziato gli effetti protettivi di Gos contro il danno neuronale mediato dal ferro, probabilmente interagendo con ioni ferrosi, ostacolando il suo coinvolgimento nella formazione di specie catalitiche reattive dell'ossigeno. Inoltre, ciò suggerisce la formazione di un complesso transitorio di trasferimento di carica tra Fe(Ⅱ) e Gos, accelerando l'ossidazione di Fe(II) e la formazione di un complesso Fe(III)-Gos più stabile che non può partecipare alla fase di propagazione dei lipidi perossidazione. Inoltre, un agente riducente biologicamente rilevante come l'ascorbato non è stato in grado di ridurre il ferro ferrico in presenza di Gos, limitando una caratteristica pro-ossidante di alcuni flavonoidi coinvolti nel riciclo degli ioni ferrosi. [30]. Gos a concentrazioni micromolari si è dimostrato più efficace dei classici scavenger nel prevenire l'ossidazione mediata dal ferro del 2-desossiribosio. Questa elevata efficacia può essere attribuita alla formazione di un Gos-Fe(II)/() redox-attivo, come abbiamo osservato in precedenza per altri polifenoli che hanno migliorato le loro prestazioni come antiossidanti sulla loro interazione con il ferro in diversi paradigmi in vitro di danno ossidativo. 22,46-48].

È stato stabilito che gli agenti chelanti che contengono ossigeno come ligando (oxo ligando, O{0}}) possono chelare il ferro e promuovere l'ossidazione di Fe(I), la stabilizzazione di Fe(II), e di conseguenza produrre una diminuzione di il suo potenziale riducente49]. A pH fisiologico, i catecoli formano facilmente bis complessi termodinamicamente stabili con il ferro ferrico, favoriti dalle basse concentrazioni dei ligandi. La presenza di una frazione catecola nella struttura del Gos suggerisce un meccanismo di interazione simile con il ferro, che potrebbe spiegare la protezione ottenuta contro il danno indotto dal ferro delle cellule neuronali e dei mitocondri. A questo proposito, abbiamo anche dimostrato in precedenza che la mangiferina e il guttiferone A stimolano l'ossidazione del ferro ferroso e ostacolano la riduzione del ferro ferrico [23,24,{5}}].

La capacità di Gos di chelare il ferro può anche indurre vie di segnalazione che contribuiscono alla neuroprotezione. Ad esempio, gli enzimi del dominio della prolilidrossilasi (PHD), i classici enzimi Hypoxia Inducible Factor-lalpha(HIF-1o) in normossia, sono stati identificati come i bersagli critici dei chelanti del ferro che sono clinicamente benefici in molti disturbi neurologici [50,51]. È comprensibile poiché il PHD dipende dal ferro bivalente come fattore di accoppiamento [52]. Diversi geni coinvolti nella neuroprotezione sono regolati da HIF-la, come eNOS, VEGF ed EPO[53]. Inoltre, l'attivazione di HIF risultante dall'inibizione del PHD potrebbe prevenire il deterioramento mitocondriale mediato dallo stress ossidativo e l'apoptosi, indipendentemente dal suo ruolo come fattore di trascrizione [54].

La ferroptosi, la morte cellulare regolata ferro-dipendente recentemente caratterizzata, è stata proposta come il meccanismo attraverso il quale i neuroni esposti al danno emorragico muoiono [8]. La disfunzione mitocondriale è stata recentemente correlata alla morte delle cellule di ferroptosi [55]. Pertanto, l'inibizione della ferroptosi, che salva la funzione mitocondriale dal danno del ferro, potrebbe anche essere un meccanismo plausibile per la neuroprotezione contro i disturbi neurologici mediati dal ferro protetti da Gos, che meriterebbe ulteriore attenzione. Ulteriori ricerche sui presunti effetti benefici del Gos su modelli animali in vivo di neurodegenerazione ferro-associata devono essere effettuate, al fine di proporre questo flavonoide come intervento terapeutico contro il danno tissutale cerebrale indotto dalla deregolazione dell'omeostasi del ferro.