Un estratto etanolico di semi di Cucurbita Pepo L. modifica l'interruzione neuroendocrina nei ratti stressati cronici e l'espressione surrenale di marcatori infiammatori e HSP70

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hailah M. Almohaimeed1, Shereen Hamed2, Hanan S. Seleem3,4, Ashwaq H. Batawi 5, Zuhair M. Mohammedsaleh6, Maha Jameal Balgoon7, Soad S. Ali 8,9, Soad Al Jaouni 9,10 e Nasra Ayuob11*

Sfondo: Zucche(Cucurbita pepo L.) sono stati descritti per avereantiossidante,effetti antinfiammatori, anti-fatica e simil-antidepressivi. La ghiandola surrenale è un importante organo sensibile allo stress che mantiene l'omeostasi durante lo stress.

Obiettivi:Questo studio mirava a valutare l'efficacia della somministrazione dell'estratto di Cucurbitapepo L. (CP) nell'alleviare i cambiamenti comportamentali, biochimici e strutturali nella ghiandola surrenale indotti dall'esposizione a stress lieve imprevedibile cronico (CUMS) e ad esplorare il meccanismo alla base di questo impatto.

Materiali e metodi:Quaranta ratti albini maschi sono stati divisi in 4 gruppi (n=10): gruppi di controllo, CUMS, trattati con fluoxetina e trattati con CP. Cambiamenti comportamentali, livello di corticosterone, citochine pro-infiammatorie TNF- e IL-6 e ossidante/antiossidanteprofilo sono stati valutati nel siero alla fine dell'esperimento. Le ghiandole surrenali sono state elaborate per la valutazione istopatologica e immunoistochimica. L'espressione genica della caspasi{0}} e del Ki67 e la proteina 70 da shock termico (HSP70) sono state valutate nelle ghiandole surrenali mediante RT-PCR.

Risultati:L'estratto di CP ha ridotto significativamente il livello di corticosterone (p <{0}}.001), il="" tempo="" di="" immobilità="" (p=""><0,001) e="" i="" cambiamenti="" infiammatori="" e="" ossidativi="" associati="" alla="" depressione="" indotta="" da="" cums="" rispetto="" al="" gruppo="" non="" trattato.="" l'estratto="" di="" cp="" ha="" alleviato="" i="" cambiamenti="" istopatologici="" surrenali="" indotti="" da="" cums="" e="" si="" è="" ridotto="">apoptosi(p < 0.001) e notevolmente sovraregolatoantiossidantelivelli nel siero.

Conclusione:Cucurbita pepo L. ha efficacemente migliorato i cambiamenti strutturali comportamentali, biochimici e surrenali indotti dallo stress cronico principalmente attraverso il suoantiossidanteed effetti antinfiammatori.

Parole chiave: zucca, stress, depressione, caspase-3, ki67, Hsp70,apoptosi

Cistanche, un'erba cinese, ha una funzione antiossidante.

INTRODUZIONE

Più di 264 milioni di persone di tutte le età soffrono di depressione in tutto il mondo (OMS, 2020). Le prestazioni della persona depressa sono generalmente scarse a scuola, al lavoro e in famiglia. La depressione può portare al suicidio; quindi, è considerata la seconda causa di morte tra 15- e 29- anni (OMS, 2020). I mammiferi possono sopravvivere a eventi stressanti attivando risposte fisiologiche appropriate a questi eventi. La ghiandola surrenale fa parte dell'asse ipotalamo-ipofisi-adrenocorticale (HPA) e dell'asse simpatia-adrenomidollare che mantiene l'omeostasi durante lo stress (Ulrich-Lai et al., 2006). È stato riportato che l'esposizione allo stress termico provoca una rapida espressione di HSP70 nella corteccia surrenale (Huang et al., 2001). Queste proteine ​​condividono il traffico intracellulare, la presentazione dell'antigene,apoptosi, e molte altre azioni (Khar et al., 2001). È stato descritto che gli ormoni esogeni o l'interferenza con gli ormoni endogeni, durante i periodi critici dello sviluppo, possono avere effetti permanenti sui percorsi fisiologici e comportamentali regolati dai circuiti ipotalamici neuroendocrini (Gore e Patisaul, 2010). includere l'intera ampiezza della fisiologia integrativa; quindi, è qualcosa di più di un disturbo ormonale (Waye e Trudeau, 2011).

I cambiamenti nella regolazione neuroendocrina, nel metabolismo e nella dieta/microbiota sono considerati fattori scatenanti dell'infiammazione e della predisposizione allo sviluppo della depressione (Huang et al., 2019). È stato ipotizzato che la depressione, uno dei disturbi neuropsichiatrici, e l'infiammazione abbiano una relazione a due vie. Mentre la depressione promuove reazioni infiammatorie, l'infiammazione promuove disturbi neuropsichiatrici inclusa la depressione (Bauer e Teixeira, 2019).

La fluoxetina, un classico antidepressivo, è tra i farmaci disponibili sul mercato per il trattamento della depressione. Attualmente è considerato un disgregatore neuroendocrino emergente. Questo effetto della fluoxetina è un effetto collaterale, piuttosto che il principale bersaglio terapeutico nei mammiferi (León-Olea et al., 2014). Pertanto, sono necessari antidepressivi più sicuri senza effetti collaterali sullo stato neuroendocrino.

Zucche(Cucurbita pepo L.) sono specie economicamente importanti coltivate in tutto il mondo. Hanno benefici nutrizionali e per la salute in quanto sono ricchi di fenolici, flavonoidi, aminoacidi, carboidrati e vitamine (Wang et al., 2002). Diversi studi di ricerca hanno rivelato che le zucche hanno ampie bioattività, come antidiabetiche, antitumorali,antiossidante, effetti antinfiammatori, anti-fatica e antidepressivi (Wang et al., 2012; Zhanget al., 2012; Nawirska-Olszańska et al., 2013; Kim Nr et al., 2016). Medicina tradizionale principalmente ayurvedica sistemi e medicina cinese hanno utilizzato diverse parti della zucca, compresa la polpa dei frutti e dei semi (Perez Gutierrez, 2016). L'efficacia antidepressiva di Sweetme Sweet Pumpkin (SSP) e Cucurbita moschata Duch è stata precedentemente testata in uno studio in vivo utilizzando un modello di depressione animale indotta da test di nuoto forzato (FST) ed è stata confrontata con fluoxetina (Kim Nr et al., 2016). In una delle revisioni relativamente recenti è stato riassunto che gli alimenti antidepressivi, come i semi di zucca, sono stati descritti per avere un punteggio alimentare antidepressivo del 47 percento, fornendo il suo effetto antidepressivo (Lachance e Ramsey, 2018). Di recente, Dotto e Chacha hanno approvato la conduzione di ulteriori studi di ricerca basati su studi clinici e su animali al fine di confermare l'effetto migliorativo dei semi di zucca contro la pressione (Dotto e Chacha, 2020).

Questi rapporti sono stati incoraggianti per testare l'efficacia dizucchenell'alleviare l'impatto dello stress cronico sulle ghiandole surrenali. Pertanto, questo studio è stato condotto per valutare l'effetto della somministrazione orale dell'estratto di Cucurbita pepo L. (CP) sull'alleviare la struttura comportamentale, biochimica e surrenale indotta da stress lieve e imprevedibile cronico e per esplorare il meccanismo alla base di questo impatto.

estratto di cistanche del deserto: antiossidante

MATERIALI E METODI

Estrazione e Dosaggio di Zucca

La Cucurbita pepo L. (esemplare buono: AQJ_95) è stata acquistata al mercato locale di Jeddah, in Arabia Saudita. Sono stati identificati nell'erbario della King Abdulaziz University utilizzando esemplari di erbario e della flora dell'Arabia Saudita (Chaudhary, 2001). I campioni di voucher sono stati depositati nell'erbario. CP è stato identificato dagli autori e verificato da un botanico della Facoltà di Scienze, Università KingAbdulaziz.

L'estrazione di CP è stata eseguita secondo gli studi precedenti (Wang et al., 2012). I frutti crudi con la buccia sono stati tagliati con affettatrice ed essiccati utilizzando un liofilizzatore (FD5508; ilShinBioBase Co., Ltd., Corea) e quindi frantumati utilizzando una rettificatrice elettrica. La polvere è stata passata attraverso un 40-setaccio a rete per ottenere una polvere fine e conservata in un contenitore ermetico. La polvere essiccata (50 g) è stata miscelata con 450 ml di etanolo all'80% e lasciata per 1 giorno a 37 gradi in uno shaker (JSSI-100T; JS Research Inc., Compact ShakingIncubator., Korea) e quindi è stata filtrata con cotone e carta da filtro il secondo giorno. Questo processo di estrazione è stato ripetuto due volte a 37 gradi per ottenere un estratto di etanolo.

Identificazione dei Costituenti di CP

La composizione chimica del PE è stata analizzata utilizzando uno spettrometro di massa gascromatografico GC-TSQ evo 8000 (ThermoScientific, Austin, TX, Stati Uniti) con una colonna capillare diretta TG–5MS (30 m × spessore della pellicola di 0,25 mm × 0,25 µm). La temperatura del forno a colonna è stata inizialmente impostata a 50 gradi e poi aumentata di 5 gradi/min fino a 250 gradi e mantenuta per 2 minuti e quindi aumentata ad una temperatura finale di 300 gradi per 25 gradi/minuto e mantenuta per 2 minuti. Le temperature dell'iniettore e della linea di trasferimento MS sono state mantenute rispettivamente a 270 e 260 gradi; l'elio è stato utilizzato come gas di trasporto a una portata costante di 1 ml/min. Il ritardo del solvente era di 4 minuti e campioni diluiti di 3 µl sono stati iniettati automaticamente utilizzando un autocampionatore AS1300 accoppiato con GC in modalità splitless in un iniettore PTV. Gli spettri di massa EI sono stati raccolti a 70 tensioni di eVionizzazione nell'intervallo di m/z 50–650 in modalità di scansione completa. La temperatura della sorgente ionica è stata fissata a 250 gradi. I componenti sono stati identificati confrontando i loro spettri di massa con quelli dei database spettrali di massa WILEY 09 e NIST 14 utilizzati per identificare e studiare la composizione chimica di componenti sconosciuti in qualsiasi estratto (Wiley, 2006; Mikaia et al., 2014). L'analisi è stata eseguita di tipo inqualitativo utilizzando il software Thermo Scientific™ Xcalibur™ 2.2 e tutti i valori sono stati riportati in percentuale relativa (Abd El-Kareem et al., 2016).

Design sperimentale

Questo studio è stato approvato dal Comitato per l'etica della ricerca biomedica presso la Facoltà di Medicina dell'Università King Abdulaziz, Jeddah, KSA (numero di riferimento {{0}}}). In questo studio, quaranta ratti albini maschi del peso di 150-200 ge di età compresa tra 2 e 3 mesi sono stati ottenuti dal King Fahd MedicalResearch Center (KFMRC). Prima di iniziare l'esperimento, i ratti sono stati lasciati acclimatarsi alle condizioni di laboratorio per 1 settimana. Dieci ratti sono stati assegnati come gruppo di controllo che è stato lasciato non esposto a CUMS. Gli altri trenta ratti sono stati sottoposti alla procedura di CUMS per 4 settimane che includeva diversi tipi di fattori di stress in diversi momenti della giornata al fine di prevenire l'assuefazione allo stress. La procedura CUMS è stata completamente descritta in lavori precedenti (Ayuob et al., 2016; Ali et al.,2017) ed è stata mostrata nella Tabella 1. I ratti esposti a CUMS sono stati divisi in 3 gruppi (n 10). Il gruppo non trattato (CUMS) ha ricevuto il veicolo 0,03 percento di carbossimetilcellulosa (CMC-Na) mediante sonda gastrica per 2 settimane. Il gruppo trattato con FLU ha ricevuto FLU (Dar Al Dawa Pharmaceuticals Co., Ltd., Amman, Jordan), un antidepressivo utilizzato per la validazione farmacologica, disciolto in CMC-Na 0,03 per cento ata dose di 20 mg/kg mediante sonda gastrica (Li et al. , 2014). Il gruppo trattato con CP ha ricevuto l'estratto di CP sciolto in acqua distillata alla dose di 100 mg/kg mediante sonda gastrica per 2 settimane secondo Wang et al. (2012).

Valutazione dei cambiamenti comportamentali

La FST è stata eseguita dopo 4 settimane per confermare l'effetto di CUMS sui ratti (Ali et al., 2017). Durante questo test, ogni ratto è stato posto in un contenitore cilindrico vetroso (altezza 20 cm, diametro 14 cm) con 15 cm di acqua a 25 ± 2 gradi. Il ratto è stato videoregistrato per 6 minuti utilizzando un software comportamentale (Noldus InformationTechnology, EthoVision XT®) e il tempo totale trascorso immobile durante i 6 minuti è stato misurato da un tecnico cieco ai gruppi sperimentali. Il tempo totale, in secondi, trascorso dai ratti senza movimento degli arti, ad eccezione del movimento minore necessario per mantenere a galla il topo, è stato determinato il "tempo di immobilità" durante i 6 minuti.

Tecniche biochimiche

Ventiquattro ore dopo aver terminato il test comportamentale, sono stati prelevati campioni di sangue dal seno intraorbitale di ratti dopo essere stati anestetizzati con isoflurano al 4% (SEDICO Pharmaceuticals Company, Cairo, Egitto) al 100% di ossigeno. Successivamente, i ratti sono stati soppressi per lussazione cervicale. I campioni di sangue sono stati centrifugati a 3,{5}} rpm per 15 minuti a 4 gradi per ottenere il siero e sono stati mantenuti a -18 gradi per la valutazione biochimica.

Il livello di corticosterone (ALPCO Diagnostics, Orangeburg, NY, Stati Uniti) è stato valutato utilizzando kit di test immunoassorbenti legati agli enzimi secondo le istruzioni del produttore. Secondo le istruzioni del produttore, TNF- e IL-6 (sistema di ricerca e sviluppo Quantakin, kit USA) sono stati valutati utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico. La densità ottica di ciascun campione è stata determinata in duplicato con un lettore ELISA per micropiastre impostato a 450 nm.

Il kit di analisi delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS) (Biodiagnostic; Egitto) è stato utilizzato per misurare spettrofotometricamente il livello di malondialdeide (MDA) a 535 nm (Gamal et al., 2018). Il livello di superossido dismutasi (SOD) è stato misurato utilizzando il kit di test SOD (Biodiagnostic; Egitto) (Packer, 2002). La valutazione del livello di glutatione perossidasi (GPX) è stata eseguita utilizzando il kit GPX (Randox Labs, Crumlin, Regno Unito). Per quantificare l'attività della catalasi (CAT), è stata generata una curva di calibrazione per il test e tutti i campioni, utilizzando kit di test (Biodiagnostic; Egitto). Il metodo è stato precedentemente descritto (Gamal et al., 2018).

Benefici dell'estratto di cistanche del deserto: antinfiammatorio

PCR quantitativa in tempo reale

L'estrazione dell'RNA dai campioni di tessuto è stata effettuata utilizzando il reagente TriFast™ (PeqLab, Germania, Cat No.: 30-2010), come descritto nel protocollo del produttore. La concentrazione dell'RNA purificato è stata stimata utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Stati Uniti). L'RNA estratto da ciascun campione è stato trascritto inversamente utilizzando il kit di sintesi del cDNA SensiFAST™ per RT-qPCR (Bioline USA Inc., Stati Uniti, Cat No.: BIO-65053), seguendo le istruzioni del produttore. Il sintetizzatocDNA è stato conservato a -80 gradi fino all'utilizzo per qRT-PCR.

Le reazioni qRT-PCR sono state eseguite utilizzando il kit SensiFAST™ SYBR Lo-ROX (Bioline USA Inc., United States, Cat No.: BIO-94002) su Applied Biosystems 7500real -time PCR detection system (Life technology, Stati Uniti). I primer gene-specifici per ratti, utilizzati in questo studio, sono stati progettati dal software Primer3 (v.0.4.0) e la loro specificità è stata verificata utilizzando il programma NCBI/Primer-BLAST. I primer sono stati quindi acquistati da Willowfort™ (Regno Unito). I primers erano GAPDH (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′), caspase-3 (avanti 5- TGTATGCTTACTCTACCGCACCCG-3, indietro {{ 20}}GCGCAAAGTGACTGGATGAACC-3), HSP70 (5′-ACGAGGGTCTCAAGGGCAAG-3′, 5′-CTCTTTCTCAGCCAGCGTGTTAG-3′).

Ki67 (avanti 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA-3, indietro 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA 3). La miscela PCR è stata preparata come segue: 10 µl di miscela SensiFASTTM SYBRLo-ROX, 0,8 µl di primer diretto, 0,8 µl di primer inverso, 2 µl di cDNA del modello e 6,4 µl di acqua priva di nucleasi. La miscela di reazione è stata trasferita a un termociclatore che era stato precedentemente programmato per mantenere a 95 gradi per 2 minuti, seguiti da 40 cicli di 95 gradi per 15 s, e poi 60 gradi per 30 s. In ogni esperimento è stata eseguita una reazione di controllo negativa contenente nessun modello.

L'analisi della curva di fusione è stata eseguita per dimostrare la specificità dei prodotti della PCR e il valore Ct per ciascuna reazione è stato ottenuto dai grafici di amplificazione. La quantificazione relativa per ciascuna espressione genica nei campioni di tessuto è stata calcolata utilizzando il metodo della soglia comparativa (ΔΔCt) con GAPDH come gene di controllo interno. Per il cambio di piega complessivo, è stato calcolato e linearizzato dalla formula aritmetica 2−ΔΔCt.

Tecniche istologiche

Alla fine dell'esperimento e dopo che i ratti sono stati anestetizzati, l'addome è stato aperto e la ghiandola surrenale destra è stata sezionata. Per ottenere blocchi di paraffina, sono stati eseguiti il ​​fissaggio della ghiandola surrenale in formalina tamponata neutra al 10% e sono stati eseguiti ulteriori processi. Le sezioni di paraffina di4-μm di spessore sono state preparate e colorate con ematossilina ed eosina (H&E). Inoltre, altre sezioni di paraffina sono state colorate immunoistochimicamente utilizzando la tecnica della streptavidina-biotina-perossidasi. I vetrini sono stati incubati per una notte a 4 gradi, quindi sono stati incubati con anti-Ki67 monoclonale (Dako Cytomation, Stati Uniti, a diluizione 1:1,000) ​​per la dimostrazione della proliferazione cellulare. Inoltre, per il rilevamento diapoptosi. È stato anche utilizzato un anticorpo policlonale contro la proteina da shock termico-70 (HSP70) (Dako, Carpinteria, CA, Stati Uniti, alla diluizione 1:1,000). È stato utilizzato l'anticorpo secondario coniugato biotinilato corrispondente dal sistema di colorazione Dako. I vetrini colorati solo con l'anticorpo secondario sono stati utilizzati come controlli negativi.

I nuclei sono stati colorati di contrasto con ematossilina. La colorazione brunocitoplasmatica è stata considerata una reazione positiva. Le sezioni colorate sono state esaminate e fotografate utilizzando un microscopio Olympus BX{{0}} (Olympus) collegato a una fotocamera digitale e un computer. L'analisi semiquantitativa dell'immunoreattività dell'anticorpo è stata eseguita dal software di analisi delle immagini Pro Plus. L'area percentuale della reazione immunopositiva è stata valutata in 30 campi con ingrandimento × 400. Le cellule positive sono state contate per 1,0 mm2 di area, come descritto da Zhou et al. (2016). Sono stati esaminati almeno cinque campi di ciascuna diapositiva e la media è stata calcolata per ciascun animale.

Per l'analisi morfometrica, sono state esaminate quattro sezioni per ogni animale (ingrandimento × 100). Lo spessore delle diverse zone della ghiandola surrenale è stato misurato in micrometri. Lo spessore della corteccia surrenale è stato ottenuto misurando la distanza tra il midollo e la capsula surrenale in linea retta, viene effettuata una misurazione in ciascun quadrante della corteccia surrenale.

Analisi statistica

I dati comportamentali, biochimici e immunoistochimici sono stati analizzati dal Pacchetto statistico per le scienze sociali (SPSS) versione 16. Le variabili dello studio sono state influenzate da due fattori indipendenti: esposizione allo stress e trattamento. Pertanto, è stata eseguita l'analisi utilizzando un ANOVA a due vie a modello misto basato su Bonferroni post hoc. La significatività statistica è stata considerata a p <>

Benefici del cistanche del deserto: antietà

RISULTATI

Risultati comportamentali

Il tempo di immobilità durante la FST era significativamente più alto (p=0.03) nel gruppo CUMS rispetto al controllo, mentre era significativamente più basso (p=0.01, p{4}}.001) nei gruppi trattati con influenza e CP rispetto al gruppo CUMS (Figura 1A).

Risultati dell'analisi dell'estratto CP utilizzando GC-MS

I principali composti rilevati in CP includono principalmente acido oleico (circa 56 percento), acido palmitico (circa 8,9 percento), acido linolenico 3,5 percento e acido linoleico 2,8 percento oltre a molti altri composti (Tabella 2; Figura 2). Tra i composti di CP che sono stati segnalati per avere un effetto antinfiammatorio, ci sono acido oleico, acido palmitico, acido linolenico, betulina e acido linoleico, mentre quelli con unantiossidantegli effetti sono acido palmitico,{0}}acido ottadecenoico e estere metilico.

Valutazione biochimica

Livello di corticosterone nel siero

Il livello di corticosterone è aumentato significativamente (p <{0}}.001) nei ratti non trattati esposti a CUMS rispetto a quello dei ratti di controllo, mentre quelli trattati con FLU e CP hanno mostrato una riduzione significativa (p <0.001) nel corticosterone sierico livello rispetto a quello dei ratti non trattati esposti a CUMS (Figura 1B).

Livelli di TNF e IL-6 nel siero

Alla fine dell'esperimento, la valutazione di TNF- e IL-6 sierici ha mostrato che erano significativamente elevati (p < 0.001) nel gruppo CUMS, mentre hanno mostrato una riduzione significativa (p< 0.001)="" in="" flu-="" and="" cp-treated="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figures="" 1c,="">

Livelli MDA, SOD, GPX e CAT nel siero

È stato notato che il livello di MDA sierico era significativamente più alto (p <{0}}.001) nel="" gruppo="" cums="" rispetto="" ai="" ratti="" di="" controllo,="" mentre="" quello="" nei="" gruppi="" trattati="" con="" cp="" era="" significativamente="" più="" basso="" (p="0,003)" rispetto="" a="" quello="" nei="" ratti="" non="" trattati="" esposti="" a="" cums.="" la="" somministrazione="" di="" flu="" non="" ha="" potuto="" ridurre="" significativamente="" il="" livello="" di="" mda="" nei="" ratti="" esposti="" a="" cums="" (figura="">

Al contrario, i livelli di SOD, GPX e CAT nel siero del gruppo CUMS erano significativamente più bassi (p < {{0}}.001,="" p="">< 0,001,="" p="0" .002)="" rispetto="" a="" quelli="" nel="" siero="" del="" gruppo="" di="" controllo,="" mentre="" i="" loro="" livelli="" hanno="" mostrato="" un="" aumento="" significativo="" (p="0.01," p="0.003," p="" 0.03)="" nel="" gruppo="" trattato="" con="" cp="" rispetto="" a="" quelli="" nel="" gruppo="" esposto="" al="" cums.="" la="" somministrazione="" di="" flu="" non="" ha="" potuto="" aumentare="" significativamente="" sod,="" gpx="" e="" cat="" nei="" ratti="" esposti="" a="" cums="" (figure="">

Espressione genica di Ki67, Caspase-3 e HSP70

La RT-PCR ha rivelato un'espressione genica Ki67 insignificantemente alta (p=0.14) nelle ghiandole surrenali del gruppo CUMS rispetto al gruppo di controllo, mentre quella dei gruppi trattati con FLU e CP ha mostrato un'espressione significativamente alta (p {{6 }}.02, p 0.01) rispetto a quello del gruppo esposto a CUMS (Figura 3E). Per quanto riguarda la caspasi-3, la sua espressione genica è stata notevolmente aumentata (p < 0,001) nelle ghiandole surrenali del gruppo CUMS rispetto al gruppo di controllo, mentre quella dei gruppi trattati con FLU e CP ha mostrato una diminuzione significativa (p=0.03, p=0.04) rispetto a quello del gruppo esposto a CUMS (Figura 3F). Quando si trattava dell'espressione genica di HSP70, registrava livelli significativamente più alti (p <0,001) nelle ghiandole surrenali del gruppo CUMS rispetto al gruppo di controllo, mentre quello di FLU e I gruppi trattati con CP hanno mostrato una diminuzione insignificante (p=0.07,p=0.08) rispetto a quella del gruppo esposto a CUMS (Figura 3G).

Valutazione istopatologica

Le ghiandole surrenali dei ratti di controllo hanno una struttura intatta con un'architettura della corteccia conservata, inclusa la zona glomerulosa, la zona fasciculata e la zona reticolare, nonché il midollo (Figura 4). Le ghiandole surrenali di ratti esposti a CUMS mostravano molte cellule nella ZG, ZF e ZR con vacuolazione evidente e nuclei degenerati e talvolta nuclei colorati in profondità con ispessimento moderato nella capsula e nelle trabecole del tessuto connettivo. Molte cellule della ZR apparivano scure con pigmenti brownlipofuscin. D'altra parte, le ghiandole surrenali dei ratti trattati con CP hanno mostrato meno cellule ovviamente vacuolate e nuclei profondamente colorati nella ZG, e ZF e ZR hanno rivelato poche cellule scure.

Le misurazioni morfometriche hanno mostrato che lo spessore di ZG e ZR ha mostrato un aumento insignificante dopo l'esposizione a CUMS, mentre erano aumentati significativamente in FLU- (p 0.01,p 0.02) e gruppi trattati con CP (p=0.02, p=0.001), rispettivamente. Per quanto riguarda lo spessore della ZF, è stato significativamente aumentato (p=0,02) nel gruppo esposto a CUMS ed è stato ulteriormente aumentato, ma in modo insignificante, nei gruppi trattati con FLU e CP rispetto a quello nel gruppo CUMS non trattato.

Al fine di determinare se l'iperplasia cellulare fosse limitata a una specifica sottoregione della ghiandola surrenale, è stata utilizzata l'etichettatura immunoistochimica per Ki67 (il marker della cellula in divisione). Il numero di cellule Ki67-proliferanti positive è aumentato significativamente (p < 0.001)="" nella="" zf="" dopo="" l'esposizione="" a="" cums,="" mentre="" il="" trattamento="" con="" flu="" e="" cp="" è="" aumentato="" in="" modo="" non="" significativo="" rispetto="" al="" gruppo="" cums="" non="" trattato.="" sebbene="" il="" numero="" di="" cellule="" proliferanti="" fosse="" aumentato="" in="" modo="" non="" significativo="" nella="" zg="" e="" zr="" e="" diminuito="" in="" modo="" insignificante="" nel="" midollo="" del="" gruppo="" cums="" rispetto="" al="" gruppo="" di="" controllo,="" il="" trattamento="" con="" flu="" e="" cp="" ha="" aumentato="" significativamente="" il="" numero="" di="" cellule="" proliferanti="" nella="" zg="" (p="0.001" ,="" p="0.003)," zr="" (p="">< 0,001)="" e="" midollo="" (p="0.004," p="0.003)" rispetto="" al="" gruppo="" cums="" non="" trattato="" (figure="" 4,="">

Per valutare è stata eseguita la colorazione immunoistochimica mediante caspasi-3apoptosi(Figura 6). È stato notato che l'area percentuale dell'espressione della caspasi-3 è aumentata significativamente (p < 0.001)="" in="" tutte="" le="" zone="" della="" ghiandola="" in="" seguito="" all'esposizione="" a="" cums="" per="" 4="" settimane="" in="" confronto="" con="" quello="" del="" gruppo="" di="" controllo.="" il="" gruppo="" trattato="" con="" cp="" ha="" mostrato="" una="" significativa="" riduzione="" dell'espressione="" della="" caspasi-3="" in="" zg="" (p="">< 0,001),="" zf="" (p="">< 0,001),="" zr="">< 0.001,="" p=""
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La percentuale dell'area dell'espressione di HSP70 è aumentata significativamente (p < 0,001) in tutte le zone della corteccia e nel midollo della ghiandola surrenale del gruppo CUMS rispetto a quella del gruppo di controllo, mentre è stata ridotta in modo insignificante in tutte le zone e il midollo dei gruppi trattati con FLU e CP rispetto a quello del gruppo CUMS (Figure 5).

Fette di Cistanche tubulosa essiccate

DISCUSSIONE

La società moderna è ovviamente piena di stress che possono derivare da problemi quotidiani, assistenza sanitaria e questioni legate al lavoro. Questi fattori di stress possono causare i cosiddetti disturbi legati allo stress (Clayton e McCance, 2014). In questo studio, l'estratto etanolico della carne e della buccia di Cucurbita pepo L. è stato utilizzato per studiarne il potenziale nell'alleviare il comportamento depressivo indotto da CUMS e il suo impatto sulla ghiandola surrenale. Ciò è stato dimostrato da un aumento significativo del livello sierico di corticosterone e verificato da un tempo di immobilità prolungato durante la FST. Questi risultati erano coerenti con quelli precedentemente riportati (Tang et al., 2015).

È stato segnalato che sia il TNF- che l'IL-6 sono coinvolti nella patogenesi della depressione (Taraz et al., 2015; Pedraz-Petrozziet al., 2020). È stato riportato che i topi carenti di recettori IL-6 o TNF- sono resistenti ai comportamenti depressivi (Viana et al., 2010). Pertanto, sono stati valutati in questo studio ed è stato osservato che sia TNF- che IL{ {9}} sono stati significativamente aumentati nel serum di ratti esposti a CUMS per 4 settimane, indicando che erano depressi. Questa scoperta è stata supportata da Numakawa et al.(2014) in topi con disperazione comportamentale e da Taraz et al. (2015)in pazienti con depressione.

In questo studio, la somministrazione dell'estratto di zucca è stata associata al miglioramento del comportamento depressivo, evidenziato dalla significativa riduzione del tempo di immobilità della FST e confermato dalla significativa riduzione dell'incorticosterone e delle citochine infiammatorie TNF- e IL-6 nel siero. Questi risultati sono stati supportati da Kim Nr et al. (2016) che hanno riferito che la SSP per 28 giorni ha ridotto il livello di citochine infiammatorie nei ratti depressi. L'attività antinfiammatoria dizuccapotrebbe essere attribuito ai composti attivi della zucca come gli acidi oleico e palmitico e l'estradiolo.

La downregulation di acido oleico, acido palmitico e acido linoleico è stata descritta nella depressione (Conklin et al., 2010; Martín et al.,2010). È stato riportato che la neuroprotezione mediata dall'acido oleico è collegata al suo effetto antinfiammatorio mediato dall'attivazione del recettore gamma (PPAR-) attivato dal perossisomeproliferatore (Song et al., 2019). In aggiunta a ciò, è stato riportato che l'acido palmitico inibisce la fosfolipasi A(2) e quindi. considerato un composto anantinfiammatorio (Aparna et al., 2012). L'estradiolo era uno dei composti della zucca rilevati in questo studio. È stato riportato che l'estradiolo induce un effetto antinfiammatorio e successivamente allevia il comportamento depressivo (Xu et al., 2015). Un altro meccanismo mediante il quale l'estradiolo può indurre un effetto antidepressivo è la sovraregolazione del espressione del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e della fosforilazione di ERK mediante l'attivazione di ER- nel cervello (Yang et al., 2010).

In questo studio, il livello sierico di MDA è stato aumentato, mentre i livelli di SOD, GPX e CAT sono stati ridotti nei ratti esposti al CUMS. Cambiamenti simili sono stati documentati in seguito all'esposizione a CUMS in studi precedenti e hanno aggiunto che questi cambiamenti biochimici hanno provocato stress ossidativo e compromissione dell'HPA (Nabavi et al., 2015). Liu T. et al. (2015) hanno anche riferito che lo sviluppo della depressione può essere attribuito al basso contenuto di antiossidanti nel corpo. Le proprietà antiossidanti delzuccaestratti di frutta sono stati frequentemente segnalati (Bahramsoltani et al., 2017). Inoltre, è stato segnalato che la polpa e la buccia della Cucurbita pepo L. elaborano un'attività antiossidante più elevata rispetto alle altre parti, ad esempio i semi (Oyeleke et al., 2019). La somministrazione di estratto di zucca, in molti studi precedenti, ha aumentato significativamente i livelli di SOD e GPX e ridotto l'MDA nel siero dei topi (Guo-Huaet al., 2000; Dang, 2004), e questo effetto è stato anche documentato in questo studio. quindi, ilantiossidantel'attività delle zucche potrebbe essere alla base del suo effetto antidepressivo evidente in questo studio. Ciò è in linea con le osservazioni di Kim Nr et al. (2016). È stato segnalato che i prodotti naturali con antinfiammatori,antiossidante, e gli effetti anti-fatica hanno anche un effetto simile a un antidepressivo (Jeong et al., 2015). Tutte queste attività precedenti sono state dimostratezucche.

Cistanche ha un effetto antietà

L'aumento della vacuolizzazione citoplasmatica delle cellule corticali surrenali, osservata nel gruppo CUMS in questo studio, potrebbe essere attribuita alla crescente domanda di lipidi, che costituiscono la pietra angolare della sintesi del cortisolo. Cigankova et al. (2005) hanno osservato che l'iperdinamica sperimentale di lunga durata ha portato alla coalescenza di più goccioline lipidiche citoplasmatiche delle cellule corticali. Queste goccioline lipidiche contengono colesterolo, che è il principale precursore nella sintesi degli ormoni steroidei. Tuttavia, Koldysheva e Lushnikova (2008) hanno riferito che lo stress ha provocato una significativa diminuzione delle goccioline lipidiche nelle cellule della corteccia surrenale, in particolare ZF (Koldysheva e Lushnikova, 2008). È stato descritto che dopo l'esposizione a stress fisico, gli stimoli dolorosi vengono trasmessi all'ipotalamo, determinando la secrezione di CRH nel sistema portale ipofisario, che aumenta la secrezione di ACTH e stimola i suoi recettori nella ZF e ZR ad aumentare la secrezione di cortisolo (Patti et al., 2018). La capsula surrenale addensata e le trabecole osservate nei ratti esposti a CUMS erano state precedentemente segnalate (El-Desouki et al., 2011; Altayeb e Salem, 2017) come risultato dell'aumentata sintesi del collagene da parte dei fibroblasti all'esposizione allo stress da immobilizzazione.

Molte cellule nelle ghiandole surrenali di ratti esposti a CUMS hanno mostrato nuclei profondamente colorati, indicando che erano sottoposti a una poptosi confermata dalla colorazione immunoistochimica della caspasi-3. Un'osservazione simile è stata riportata da Altayeb e Salem, (2017), mentre stavano studiando l'effetto dello stress da immobilizzazione sulle ghiandole surrenali dei ratti. Liu Q. et al. (2015) hanno riportato che l'eccessivo stress ossidativo, evidente in seguito all'esposizione a CUMS in questo studio, modifica i livelli di espressione di "apoptosi-relatedgenes" e induce l'apoptosi cellulare e la degenerazione attraverso le vie di segnalazione di Bcl-2, Bax e caspase-3. Questo meccanismo è stato confermato in questo studio da RT-PCR che ha rivelato una significativa sovraregolazione del gene della caspasi-3 espressione. Sulla revisione della letteratura, non vi è stato alcun effetto diretto di Cucurbita pepo sull'apoptosi mediata dalla caspasi-3 in diversi tessuti. Sembra che la riduzione delle cellule apoptotiche positive alla caspasi-3 rilevata nelle ghiandole surrenali sia stata attribuita allaantiossidanteeffetto di Cucurbita pepo documentato in questo studio. Ciò è supportato da molti studi precedenti condotti su altre piante ed erbe con attività antiossidanti significative (Banagozar Mohammadi et al., 2019; Ghazizadeh et al., 2020).

Questo studio ha mostrato che l'esposizione a CUMS aumentava le cellule Ki67-positive nella corteccia surrenale, che era significativamente evidente nella ZF, indicando un aumento del numero di cellule proliferanti e, di conseguenza, lo spessore di questo strato era significativamente aumentato. d'altra parte, il numero di cellule proliferanti Ki67-positive è diminuito in modo non significativo nel midollo in risposta a CUMS. Queste osservazioni erano in linea con quelle di Ulrich-Lai et al.(2006) che hanno riportato un aumento di Ki{{ 4}}nuclei cellulari positivi solo nella ZF esterna dopo l'esposizione a stress cronico variabile, mentre il midollo mostrava ipertrofia cellulare e non iperplasia. Inoltre, Laborie et al., (2003) hanno riportato un aumento generalizzato della funzione midollare dopo l'esposizione a stress cronico, suggerendo che lo stress cronico può portare a ipertrofia midollare.In questo studio, la somministrazione dizuccaestrarre una proliferazione cellulare significativamente aumentata, evidente dalla sovraregolazione del gene Ki67 e dall'immunoespressione in quasi tutte le zone e il midollo della ghiandola surrenale rispetto al CUMS. Ciò ha spiegato l'aumento dello spessore delle zone ghiandolari registrate in questo studio. Può anche compensare l'effetto apoptotico indotto dall'esposizione a CUMS. Questa scoperta è supportata da Kim Hy et al. (2016) che hanno riportato una significativa sovraregolazione dell'espressione dell'mRNA di Ki67 e la proliferazione di splenociti isolati dalla milza di topi BALB/c trattati con SSP, streamed e Cucurbita moschataDuch e il suo componente principale, -carotene.

Nel presente studio, l'esposizione a CUMS ha aumentato significativamente l'espressione genica e l'immunoespressione di HSP70 in tutte le zone della ghiandola surrenale. In accordo con ciò, Zheng et al. (2008) hanno anche dimostrato che l'aumento dell'espressione di HSP70 dopo l'esposizione a condizioni stressanti modula le risposte infiammatorie inibendo l'attivazione del fattore di trascrizione infiammatoria, il fattore nucleare-kappa B(NF-kappaB). Inoltre, HSP70 può interferire direttamente con apoptosi e necrosi (Yenari et al., 2005). Più recentemente, Liet al. (2019) hanno riportato una sovraregolazione dell'espressione di HSP70 nel tessuto della ghiandola surrenale suina in seguito all'esposizione a stress da calore, che indica il ruolo di HSP70 nella lesione della ghiandola surrenale e ne sottolinea la rilevanza per le risposte infiammatorie. La rapida induzione di HSP70 in risposta allo stress è considerata essenziale per il processo di protezione cellulare.

Nel nostro studio, il trattamento di ratti esposti a CUMS conzuccheera associato a una riduzione insignificante dell'espressione di HSP70 che era associata a una ridotta apoptosi e risposte infiammatorie. Ciò potrebbe indicare l'effetto benefico di un livello relativamente alto di HSP70 indotto sia da FLU che da CP poiché ha portato alla riduzione della caspasi-3-mediataapoptosie rilascio di citochine infiammatorie. Sebbene l'effetto delle zucche sulla famiglia delle proteine ​​da shock termico non sia stato precedentemente descritto, l'acido oleico, che rappresenta i principali costituenti dizuccheutilizzato in questo studio, è stato descritto per sottoregolare l'espressione di HSP60 nella linea cellulare di linfociti T umani (Martins De Lima et al., 2004), che è di supporto al nostro studio. Il meccanismo d'azione proposto della Cucurbita pepo come sostanza simile a un antidepressivo è riassunto nella Figura 7. Tra i limiti di questo studio c'era l'incapacità di indagare ulteriormente sul meccanismo approfondito dell'effetto antidepressivo della CP, e pertanto, ulteriori studi sono incoraggiati a farlo .

In conclusione, questo studio fornisce prove scientifiche dell'efficacia dell'estratto di Cucurbita pepo L. per alleviare i cambiamenti comportamentali e biochimici indotti da CUMS, nonché l'impatto istopatologico sulle ghiandole surrenali. Questi effetti sono stati evidenti attraverso la downregulation diapoptosiandHSP70 e sembrava essere mediato attraverso ilantiossidanteed effetto antinfiammatorio della Cucurbita pepoL. estratto. Sebbene questo studio e alcuni altri studi recenti abbiano documentato l'effetto antidepressivo di Cucurbita pepo e ne abbiano esplorato il meccanismo, sono necessari ulteriori studi, inclusi studi clinici, per affermare questo effetto nell'uomo.

Granuli di Cistanche