Inibitori della melanogenesi dal rizoma di Ligusticum sinense in B16-Cellule di melanoma F10 in vitro e pesce zebra in vivo

Contatto: ali.ma@wecistanche.com

Min-Chi Cheng 1,†, Tzong-Huei Lee 2,†, Yi-Tzu Chu 3, Li-Ling Syu 3, Su-Jung Hsu 4,Chia-Hsiung Cheng 5, Jender Wu 1,* e Ching-Kuo Lee 1,3,6,*

Astratto:Il rizoma di Ligusticum sinense, pianta medicinale cinese, è stato a lungo utilizzato come cosmetico persbiancamentoe idratante della pelle nell'antica Cina. Al fine di indagare le componenti antimelanogeniche del rizoma di L. sinense, abbiamo eseguito anantimelanogenesipurificazione guidata dal test mediante HPLC semi-preparativo accompagnato da analisi spettroscopica per determinare i componenti attivi. Sulla base del metodo guidato dal saggio biologico, sono stati isolati e identificati 24 composti dallo strato di acetato di etile degli estratti metanolici di L. sinense e, tra questi,5-[3-(4-idrossi{{ 7}}acido metossifenil)allil]ferulico (1) e cis-4-pentilcicloes-3-ene-1,2-diolo (2) erano nuovi composti. Tutti gli isolati puri sono stati sottoposti a test di antimelanogenesi utilizzando cellule murinemelanoma B16-F10. Esposti il ​​composto 1 e (3S,3aR)-neocnidilide (8).antimelanogenesiattività con valori IC50 di 78,9 e 31,1 µM, rispettivamente, senza citotossicità evidente. Ulteriori indagini hanno mostrato che il composto 8 ha dimostrato una significativa attività anti-pigmentazione sugli embrioni di pesce zebra (10-20 µM) rispetto all'arbutina (20 µM) e senza alcuna citotossicità contro i normali cheratinociti epidermici umani. Questi risultati suggeriscono che (3S,3aR)-neocnidilide (8) è un potente composto naturale antimelanogenico e non citotossico e può essere sviluppato potenzialmente comesbiancamentoagente per usi cosmetici.

Parole chiave:Ligusticum sinense; rizoma;antimelanogenesi; B16-cellula di melanoma F10; pesce zebra;pigmentazione

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introduzione

La melanina è un pigmento marrone-nero che è principalmente responsabile del colore della pelle, dei capelli e degli occhi [1]. La melanina è un biopolimero e comprende due classi principali di pigmenti nella pelle umana, l'eumelanina nero-brunastra e la feomelanina giallo-rossastra [1]. La biosintesi della melanina è un processo complesso a più fasi chiamatomelanogenesi, che è una risposta fisiologica della pelle umana per prevenire gli effetti deleteri delle radiazioni ultraviolette (UV) e degli inquinanti ambientali. Tuttavia, l'eccessiva melanogenesi può portare all'oscuramento della pelle e l'iperpigmentazione anormale provoca vari problemi dermatologici, come lentiggini, melasma, lentiggini senili e persino cancro della pelle [2].

La melanina è prodotta in organelli legati alla membrana chiamati melanosomi, che sono presenti in cellule specializzate chiamate melanociti. La sintesi della melanina inizia dall'idrossilazione della L-tirosina a L-diidrossifenilalanina (DOPA) ed è seguita dall'ossidazione a dopachinone. Le due reazioni sono catalizzate dall'enzima tirosinasi che limita la velocità. In assenza di sostanze tioliche, il dopachinone ciclizza in leukodopacrome, seguito da una serie di reazioni di ossidoriduzione che coinvolgono la proteina correlata alla tirosinasi-2 (Tyrp-2) per produrre il dopacrome intermedio e 5,6-diidrossiindolo{ {9}}acido carbossilico (DHICA). DHICA subisce una successiva ossidazione catalizzata da Tyrp-1 e polimerizzazione per formare eumelanina. Il dopachinone si coniuga anche con cisteina e glutatione per produrre cisteinildopa e glutationildopa, che vengono progressivamente trasformate in feomelanina [1].

Le cellule che circondano i melanociti come cheratinociti e fibroblasti sono coinvolte nella regolazione dimelanogenesi[3]. L'esposizione continua all'irradiazione UV induce danni al DNA degli inkeratinociti e porta alla sovraregolazione p53-mediata della proopiomelanocortina (POMC). POMC subisce la scissione post-traduzionale per produrre l'ormone stimolante i melanociti (-MSH) e l'endorfina. A sua volta, -MSH si lega al recettore della melanocortina 1 (MC1R) sui melanociti adiacenti, determinando la sovraregolazione del cAMP. Elevato cAMP stimola l'espressione del fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF). MITF regola quindi la trascrizione degli enzimi di pigmentazione, tra cui tirosinasi, Tyrp-1 e Tyrp-2. Il percorso innescato dai raggi UV alla fine porta alla sintesi della melanina e al trasferimento dei melanosomi ai cheratinociti [4–6]. Oltre agli stimoli estrinseci, la produzione di melanina è influenzata anche da fattori intrinseci, come il cambiamento ormonale, i disturbi genetici, l'infiammazione e l'età [3].

Nell'Asia orientale, la maggior parte delle donne si aspetta di evitare la pigmentazione della pelle irregolare e di perseguire l'alleggerimento della pelle. Ad esempio, l'arbutina, l'acido cogico, l'acido azelaico, l'acido ascorbico e l'estratto di radice di gelso bianco e liquirizia sono stati usati comesbiancamentoingredienti nei preparati cosmetici [7]. Lo sfruttamento della pelle efficace e preventivasbiancamentoagenti di origine naturale è di grande interesse in campo cosmetico, principalmente a causa della relativa non tossicità e dei minori effetti collaterali [7,8]. Il rizoma di Ligusticum sinense Oliv. (Ombrellifere) sono da tempo utilizzate come medicina tradizionale cinese da 2000 anni e fino ad oggi le sue radici sono una tisana altamente raccomandata [9]. L. sinense, ovvero "Gaoben" in cinese, noto anche come levistico cinese, era usato per espellere il vento freddo, alleviare il dolore e la reumaticaartralgia e alleviare il mal di testa anemofrigido. Il principale uso esterno di L. sinense è per lo sbiancamento e l'idratazione della pelle [10]. Ad oggi, i costituenti chimici riportati presenti in L. sinense includono terpenoidi, analoghi ftalidici e glicosidi fenilpropanoidi [11-16]. È stato riportato che tali costituenti esercitano numerosi effetti farmacologici. Ad esempio, è stato riportato che gli oli essenziali delle radici e dei rizomi di L. sinense possiedono effetti analgesici, sedativi e antimicrobici [15,17]. Ligustilide, uno dei principali ftalidi ampiamente presente nella pianta delle Ombrellifere, ha dimostrato un effetto dilatatore sul miometrio e una ridotta infiammazione e dolore neurogeno [18]. Cnidilide, un altro phthalideabundant nella pianta delle Ombrellifere, ha dimostrato di possedere effetti antispasmodici e infiammatori [19,20]. Studi precedenti hanno indicato che l'estratto di L. sinense inibivamelanogenesisu cellule di melanoma murino B16-F10 [21]. Tuttavia, i componenti attivi per l'attività inibitoria della melanogenesi non erano ancora riportati.

ingredienti naturali

Nel nostro screening biologico preliminare, è stato riscontrato che gli estratti metanolici di L. sinense hanno mostratoantimelanogenesil'attività nelle cellule B16-F10 con un valore IC50 di 50 µg/mL [22] e i principi dell'antimealnogenesi non sono ancora stati divulgati finora. Abbiamo quindi deciso di studiare il principio attivo del rizoma di L. sinense con un metodo diretto al test biologico, e ciò ha portato all'isolamento e all'identificazione di due nuovi composti 1 e 2 insieme a 22 composti noti 3–24. Questo articolo mirava anche a studiare gli effetti dei composti 1 e 8 sulle cellule di melanoma B16-F10 in vitro e sul pesce zebra in vivo, valutare la sicurezza mediante il normale test MTT dei cheratinociti epidermici umani e quantificare 1 e 8 nel rizoma di L. sinense .

2. Risultati e discussioni

2.1. Isolamento e delucidazione strutturale

Nel tentativo di isolare e identificare ilmelanogenesiinibitori in modo efficiente dalle frazioni attive, abbiamo impiegato una strategia di frazionamento guidata dal saggio biologico. Un estratto metanolico del therizoma di L. sinense è stato partizionato per dare acetato di etile, n-butanolo e strati solubili in acqua. I tre strati ottenuti sono stati quindi testati per l'attività antimelanogenesi in cellule di melanoma B16- murino F10. La cellula di melanoma del topo B16 è una piattaforma sensibile, affidabile e fattibile per lo screening di un gran numero di piccole molecole molecolarimelanogenesiregolatori [23–25]. Alle concentrazioni di 25-100 µ g/mL, lo strato solubile in acetato di etile ha dimostrato l'attività inibitoria più potente, mentre è stata osservata una leggera inibizione per gli strati n-butanolo o solubili in acqua (Figura 1A) come evidenziato dal contenuto di melanina in lyzed B16-Cellule di melanoma F10 (Figura 1B). La separazione in colonna aperta dello strato di acetato di etile su gel di silice seguita da purificazione HPLC ha offerto due entità chimiche 1 e 2 precedentemente non riportate (Figura 2A) insieme a 22 composti noti. I composti noti sono stati caratterizzati per essere eugenolo (3) [26], {{17} }idrossi-4-metilacetofenone(4) [27], 3S*,3aR*,7aS*-3-butilesaidroftalide (5) [28], carvacrolo (6) [29], squalene (7) [30 ],(3S,3aR)-neocnidilide (8) [31], alcol coniferilico 9-estere metilico (9) [32], bergaptene (10) [33], metossisalene (11) [34], metil vanillina ( 12) [35], 2,5-diidrossi-4-metilacetofenone (13) [36],2-metossi{51}}nitrofenolo (14) [37], 2,{{ 55}}dimetossifenolo (15) [38], falcarindiolo (16) [39],(9Z)-eptadecene-4,6-diyne-1,8-diolo (17 ) [40], 3-Acido O-(p-cumaroil)ursolico (18) [41], pregnenolone(19) [42], (9Z,11E,13R)-13-idrossiottadeca{{79 }},11-acido dienoico (20) [43], acido ferulico (21) [44], coniferilferulato (22) [45], p-idrossifenetil ferulato (23) [46] e vanil acido lico (24) [47].

Il composto 1, ottenuto come olio incolore, aveva una formula di C20H20O6 come dedotto da 13C NMR e HRESI-MS di ioni positivi, che mostrava uno ione frammento a HRESI-MS positivo m/z 357.1331[M plus H] plus (calcd per C20H21O6, 357.1333). I suoi assorbimenti IR a 3444, 1633 e 1509 cm−1 indicavano la presenza rispettivamente di funzionalità idrossi, olefiniche e aromatiche. Nell'1H NMR di 1,a 1,3,4,5-frazione aromatica tetrasostituita [δH 7,07 (d, J=1.8 Hz, H{29}}) e 7,22 (d, J=1.8 Hz, H-2)], una funzionalità aromatica di tipo ABX [δH 6,69 (dd, J=7.9, 1,8 Hz, H-60) , 6.74 (d, J=7.9 Hz, H{47}}) e 6.87 (d, J=1.8 Hz, H-20)], due trans- protoni olefinici accoppiati [δH 6.33 (d, J {56}}.9 Hz, H-8) e7.56 (d, J=15.9 Hz, H-7) ], un gruppo allilico terminale [δH 4.99 (ddd, J=17.1, 1.8, 1.8 Hz, H-90a), 5.10, (br d,J=7.6 Hz , H-70), 5,15 (gg, J=10.1, 1,8, 1,8 Hz, H-90b) e 6,40 (gg, J=17.1, 10,1 , 7,6 Hz, H{95}})] e due risonanze metossiliche [δH 3,77 (s, 30-OCH3) e 3,92 (s, 3-OCH3)] sono state osservate. Venti risonanze di carbonio, attribuibili a sette atomi di carbonio aromatici non protonati [δC 126,7 (C-1), 131,2 (C-5), 135,3(C-10), 146,1 (C{{116} }), 148,6 (C-3), 147,2 (C-4) e 148,2 (C-30)], un carbonile acido (δC 168,4, C-9), onemetina (δC 48,2, C-70), otto metine olefiniche [δC 108,9 (C-2), 113,2 (C-20), 115,6 (C-50), 116,1 (C -8), 121,8 (C-60), 123,8 (C-6), 141,5 (C-80) e 146,2 (C-7)], un esometilene (δC 115,9, C-90) e due metossili [δC 56,4 (30-OCH3) e 56,6 (3-OCH3)], sono stati osservati nello spettro 13C NMR accoppiato con lo spettro DEPT di 1 ( Tabella 1). La connettività di 1 è stata ulteriormente dedotta dai picchi incrociati di δH5,10 (H-70)/δC 113,2 (H-20), 115,9 (H-90), 121,8 (H{{ 183}}), 123,8 (C-6), 131,2 (C-5), 135,3 (C-10), 141,5 (C-80) e 147,2 (C{{ 198}}), δH 7,56 (H-7)/δC 108,9 (C-2), 116,1 (C-8), 123,8 (C-6), 126,7 (C -1) e 168,4 (C-9), δH 3,77(30-OCH3)/δC 148,2 (C-30) e δH 3,92 ({226}}OCH3)/ δC 148,6 (C-3) nello spettro HMBC (Figura 2B), che sono stati ulteriormente corroborati dai segnali correlati tra loro di δH 3,77 (30-OCH3)/δH 6,87(H-20 ) e δH 3,92 (3-OCH3)/δH 7,22 (H-2) nello spettro NOESY (Figura 2B). Di conseguenza, 1 era caratterizzato come mostrato ed era denominato acido 5-[3-(4-idrossi-3-metossifenil)allil]ferulico. A nostra conoscenza, 1 con due serie di unità C6–C3 collegate in C-70 era un nuovo tipo scheletrico di lignan.

Il composto 2 è stato isolato come olio incolore con formula molecolare C11H2{{20}}O2 come dedotto da HR-ESIMS di ioni positivi, che mostra uno ione [M più H] più a m/z 185,1501 (calcd per C11H21O2, 185.1541). Assorbimenti cospicui a 3445 e 1660 cm−1 nello spettro IR di 2 indicavano la presenza di funzionalità idrossile e olefiniche, rispettivamente. L'1H NMR (Tabella 2) accoppiato con COSYspectrum di 2 ha mostrato due catene alifatiche a δH 0,85–1,97 (–H2-7–H3-11) e δH 1,66–5,44(–H{30}} –H-2–H-1–H2-6–H2-5–). Le assegnazioni di cui sopra si riflettono anche nell'NMR 13C di 2 spettri DEPT supportati, in cui un metile (δC 14,2, C-11), sei metilene [δC 22,7 (C-10), 26,3 (C{{ 45}}), 27,2 (C-5), 27,4 (C-8), 31,8 (C-9) e 37,4 (C-7)], tre metine [δC Sono stati osservati 67.1(C-2), 69.2 (C-1) e 121.0 (C-3)] e un carbonio quaternario (δC 144.1, C-4). Nello spettro HMBC di 2 (Figura 2C), picchi incrociati di δH 5,44 (H{75}})/δC 27,2 (C-5) e 37,4 (C-7), δH 1,92– 2,01 e 2,04–2,10 (H2-5)/δC144.1 (C-4) e δH 1,97 (H2-7)/δC 144,1 (C-4) indicavano C{ {100}}–C-6 era una parte cicloesenica con un doppio legame a ∆3 e C-7–C-11, una catena alifatica lineare satura, era attaccata a C{{105 }}. Le configurazioni relative di C{107}} e C{108}} chirali portatori di idrossi sono state avvicinate dai valori J dei carbinoilprotoni H-1 (9,1, 4,2 Hz) e H-2 (4,2 Hz ), che indicava che H-1 e H{118}} erano rispettivamente orientati pseudoassiali e pseudoequatoriali (Figura 2C). La configurazione relativa di 1,{125}}diidrossi in 2 è stata così dedotta in cis. In conclusione, la struttura di 2 è stata chiarita come mostrato ed è stata denominata cis-4-pentilcicloeso-3-ene-1,{131}}diolo.

2.2. Effetti dei composti 1 e 8 sul contenuto di melanina nelle cellule B16-F10 stimolate da MSH

Per accertare i costituenti della depigmentazione nel rizoma di L. sinense, tutti gli isolati puri sono stati sottoposti aantimelanogenesitest nelle cellule di melanoma B16-F10. Le cellule F10 del melanoma murino B16- sono un modello consolidato per la scoperta dei principi antimelanogenici e sono state ampiamente adottate in studi precedenti [48]. -L'ormone stimolante i melanociti (-MSH) è un ormone peptidico responsabile della produzione di melanina da parte dei melanociti attraverso l'attivazione del recettore della melanocortina 1 [49]. In questa ricerca, le cellule B16-F10 sono state stimolate con -MSH (100 nM) e simultaneamente trattate con ciascun composto a concentrazioni di 25, 50 o 100 µM. Il contenuto di melanina delle cellule di melanoma B16-F10 senza trattamento con composti è stato assegnato al 100 percento. Arbutina, una pelle comunesbiancamentoagente nei prodotti cosmetici, è stato utilizzato come controllo positivo. Di questi composti, 1 e 8 inibiscono la produzione di melanina indotta da MSH in modo dose-dipendente. I valori IC50 dei composti 1 e 8 erano rispettivamente 78,9 e 31,1 µM (Figura 3B). I composti 1 e 8 alle concentrazioni efficaci non hanno mostrato effetti evidenti sul test MTT (Figura 3A). I risultati dell'MTT possono derivare dagli effetti combinati della riduzione della proliferazione cellulare e dell'inibizione della vitalità cellulare secondo le condizioni sperimentali. Questi risultati hanno suggerito che gli effetti anti-melanogenici dei composti 1 e 8 non sono stati attribuiti alla morte cellulare o all'inibizione della crescita.

Utilizzando il metodo HPLC-DAD, i principali costituenti efficaci (1 e 8) sono stati caratterizzati dall'estratto grezzo (Figura 4) confrontandoli con il tempo di ritenzione di 1 puro (da sintesi di laboratorio, dati non ancora pubblicati) e 8 (da Sigma) come standard. Sono state utilizzate soluzioni madre di 1, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 µg/mL. Ciascuna concentrazione è stata iniettata in triplicato. I rapporti di contenuto di 1 e 8 nell'estratto di materiale essiccato sono stati quantificati in 0,009 percento e 0,15 percento (p/p) mediante regressione lineare delle rispettive aree di picco.

2.3. Saggio di pigmentazione del pesce zebra in vivo

Oltre a valutare l'effetto di 8 su in vitroantimelanogenesi, è stata ulteriormente studiata la sua anti-pigmentazione in vivo attraverso il saggio di pigmentazione del pesce zebra. Zebrafish è stato considerato un organismo modello vertebrato vantaggioso a causa delle sue piccole dimensioni, dell'elevata fecondità e di sequenze genetiche e sistemi di organi simili agli esseri umani. Inoltre, il processo di pigmentazione della melanina sulla sua superficie, consentendo una facile osservazione, rende il pesce zebra un modello particolarmente utile per studiare inibitori o stimolatori melanogeni in vivo [50]. In questo studio, l'arbutina a 20 mM è stata utilizzata come controllo positivo ed è stata inclusa l'arbutina di 20 µM per confrontare il composto 8 allo stesso livello di concentrazione. Dopo l'incubazione di embrioni di pesce zebra da 7 hpf a 72 hpf, il composto 8 ha mostrato una maggiore attività inibitoria della pigmentazione a concentrazioni di 10 e 20 µM rispetto all'arbutina (20 µM) (Figura 5). Dopo il trattamento del composto 8 da 20 µM, il livello di pigmentazione del pesce zebra diminuisce notevolmente di circa il 31%; mentre il composto 8 a 10 µM diminuisce del 26,2% il livello di pigmentazione.

2.4. Test di vitalità degli equivalenti della pelle epidermica umana

La sicurezza dei prodotti cosmetici è una seria preoccupazione. Ad esempio, l'idrochinone, un efficace agente schiarente per la pelle, è stato bandito dal mercato a causa di numerose reazioni avverse e controversie sul potenziale rischio cancerogeno [7]. L'acido kojico, un potente inibitore della tirosinasi, può indurre dermatite da contatto e potenziale genotossicità [51,52]. Al fine di valutare la sicurezza dei composti 1 e 8 sulla pelle umana, abbiamo eseguito un test di vitalità cellulare sul modello Human skin equivalents (HSEs). Gli HSE sono sistemi di coltura tridimensionali generati seminando umani cheratinociti su un appropriato substrato dermico pre-seminato con fibroblasti umani. Le HSE sono fisiologicamente paragonabili alla pelle naturale e forniscono alternative idonee per la sperimentazione animale. In condizioni di coltura controllata, le HSE dimostrano un'elevata somiglianza con il tessuto nativo da cui sono state derivate [53]. In questo studio, sono stati eseguiti saggi di vitalità sui normali cheratinociti epidermici umani (NHEK) nei modelli epidermici di Leiden (LEM). I composti 1 e 8 non hanno influenzato la vitalità cellulare a concentrazioni di 10–100 µM. Le vitalità cellulari del composto 1 sono del 98 percento e del 106 percento a concentrazioni rispettivamente di 10 e 100 µM. Le vitalità cellulari del composto 8 sono del 97% e del 92% a concentrazioni rispettivamente di 10 e 100 µM. Di conseguenza, i composti 1 e 8 non hanno esercitato citotossicità contro NHEK nei modelli epidermici di Leiden a concentrazioni inferiori a 100 µM (Figura 6). Poiché la concentrazione effettiva di 8 è inferiore a 100 µM, il che suggerisce che 8 potrebbe essere sicuro per la pellesbiancamentoal di sotto delle concentrazioni testate. Tuttavia, in pratica, i prodotti cosmetici possono essere applicati a lungo sulla pelle umana, quindi è necessario condurre ulteriormente un lungo periodo sperimentale di composti testati su HSE.

2.5. Studio di docking molecolare della B16-Mus Musculus tirosinasi

La catalisi della tirosinasi è la fase limitante della biosintesi della melanina. Pertanto, l'inibizione della tirosinasi è l'approccio più comune per ottenere il bianco della pelle [54,55]. Per determinare se la L. sinense soppressomelanogenesinelle cellule B16-F10 attraverso l'inibizione della tirosinasi, sono stati eseguiti modelli di stick 3D (Figura 7A) e un diagramma 2D (Figura 7B) di aggancio molecolare utilizzando il software DS, che ha rivelato il possibile meccanismo inibitorio del composto 8 sul topo (Mus musculus) tirosinasi. È stato dimostrato che il sito attivo della tirosinasi di topo si trovava in un dominio circondato da aminoacidi His377, Asn378, His381, Gly389, Thr391, Ser394 insieme a due ioni rame. L'energia di interazione CDOCKER tra l'enzima e l'inibitore era -46,0067 kcal/mol. I risultati della simulazione hanno mostrato che gli amminoacidi idrofobici tra cui Gly389, Asn 378, Thr391 Ser394, His 404 e His192 attorno al sito catalitico formavano forze di van der Waals con il composto 8. Inoltre, l'ossigenato di -lattone porzione di 8 forma legami idrogeno con His377 e His215 , mentre il suo gruppo carbonilico forma legami di coordinazione con due ioni rame. È stato anche osservato che l'anello cicloesenico e il butano esercitavano una debole interazione π-alchilica rispettivamente con His381 e His215. Studi precedenti hanno dimostrato che l'estratto di L. sinense mostrava l'inibizione della tirosinasi dei funghi e la down-regulation dell'espressione dell'mRNA della tirosinasi nelle cellule B16-F10 [21,56]. Poiché l'aggancio molecolare ha illustrato una forte interazione tra il dominio attivo della tirosinasi di topo e il composto 8, è stato quindi proposto che (3S,3aR)-neocnidilide (8) mostrasse attività antimelanogenesi a causa dell'attenuazione dell'attività della tirosinasi e dell'ulteriore diminuzione della produzione di melanina. Tuttavia, oltre all'inibizione della tirosinasi, gli altri meccanismi alla base dellaantimelanogenesil'attività della (3S,3aR)-neocnidilide (8) deve essere ulteriormente studiata.

3. Materiali e metodi

3.1. Generale

Solventi di grado HPLC, n-esano, acetato di etile, metanolo e acetonitrile, sono stati acquistati da JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). L'etanolo è stato acquistato da Merck (Darmstadt, Germania). -Ormone stimolante i melanociti (-MSH), dimetilsolfossido (DMSO), soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2 ,5-il bromuro di difenil tetrazolio (MTT) è stato acquistato da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). La cromatografia su colonna aperta è stata eseguita su gel di silice (70–230 mesh, Merck, Darmstadt, Germania). Le lastre di gel di silice prerivestite 60 F254 e Aluminium Sheets RP-18 F254S per TLC sono state acquistate da Merck (Darmstadt, Germania). Le rotazioni ottiche sono state misurate su un polarimetro JASCO P-1020 (Jasco, Tokyo, Giappone). 1H e 13C NMR sono stati acquisiti con uno spettrometro Bruker Avance DRX-500 (Bruker, Rheinstetten, Germania). Gli spettri di massa a bassa e alta risoluzione sono stati ottenuti utilizzando un ABI API 4000 Q-TRAP ESI-MS (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) e Q-Exactive Plus HR-ESI-MS (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) ), rispettivamente. Gli spettri IR sono stati registrati su uno spettrometro JASCO FT/IR 4100 (Jasco, Tokyo, Giappone).

3.2. Materiali vegetali

Rizoma secco di L. sinense Oliv. è stata acquistata da Sheng Chang Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Taiwan.

3.3. Isolamento e delucidazione strutturale

Il rizoma essiccato (9,9 kg) di L. sinense è stato frantumato ed estratto con metanolo (40 L × tre volte), che è stato filtrato ed evaporato per dare un residuo nero (1758 g). Questo residuo è stato quindi sospeso in H2O (3.{48}} L) e ripartito con uguale volume di acetato di etile e n-BuOH tre volte, successivamente. Ciascuno strato è stato concentrato a pressione ridotta per ottenere strati di EtOAc (415 g), n-BuOH (147 g) e H2O (896 g). Successivamente, lo strato di acetato di etile essiccato (25{{100}} g) è stato miscelato con 375 g di gel di silice ed è stato caricato su una colonna aperta condizionata impaccata con 3550 g di gel di silice ed eluito in un passaggio -metodo a gradiente saggio mediante miscele di n-esano, acetato di etile e metanolo. Ogni 500 ml sono stati raccolti per una frazione e analizzati mediante TLC. Quindi, tutte le frazioni sono state combinate in otto porzioni I-VIII secondo i risultati delle analisi TLC, che sono state ridisciolte in un volume minimo di miscele di n-esano-acetato di etile utilizzate nel successivo sistema HPLC. PorzioneII eluita da n-esano—acetato di etile (95:5) è stata purificata mediante HPLC semi-preparativo (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) utilizzando n-esano—acetato di etile (96:4) come eluente a una portata di 3 ml/min per ottenere 6(4,2 mg, tR=19,8 min), 3 (6,1 mg, tR=21,2 min), 5 (32 mg, tR=23 0,5 min) e 7 (79 mg, tR=28,0 min). La stessa porzione è stata purificata mediante HPLC semi-preparativo (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) utilizzando n-esano—acetato di etile (99 :1) come eluente a una portata di 3 mL/min per fornire 4 (36 mg, tR=32,5 min). La porzione III eluita da n-esano—acetato di etile (90:10) è stata purificata mediante un HPLC semi-preparativo (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) utilizzando n-esano-acetone (95:5) come eluente a una velocità di flusso di 3 mL/min per fornire 8 (1,7 g, tR=19. 3 minuti). La porzione IV eluita da n-esano—acetato di etile (80:20) è stata purificata mediante HPLC semi-preparativo (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) utilizzando n-esano—acetato di etile (85:15) come eluente a una portata di 3 ml/min per ottenere 15 (19 mg, tR=24,4 min), 12 (11 mg, tR=26,9 min),9 (25 mg, tR=33 0,8 min), 10 (31 mg, tR=37,0 min), 11 (24 mg, tR=42,5 min). La stessa porzione è stata purificata dalla stessa colonna usando n-esano—acetato di etile (78:22) come eluente a una velocità di flusso di 3 mL/min per ottenere 14 (10 mg, tR=20,1 min) e 13 ( 22 mg, tR=24.6 min). La stessa porzione è stata purificata dalla stessa colonna usando n-esano—acetato di etile—acetone (80:10:10) come eluente a una portata di 3 mL/min per ottenere 20 (25 mg, tR=13.2 min ), 17 (15 mg, tR=16,3 min), 18 (28 mg, tR=18,5 min), 16 (132 mg,tR=21,8 min) e 19 (39 mg, tR=25,6 min). La porzione V eluita da n-esano—acetato di etile (60:40) è stata purificata mediante HPLC semi-preparativo (Hibar® Fertigäute, 10 × 250 mm) utilizzando n-esano—acetato di etile—acetone (68:27:5) come eluente a una portata di 3 ml/min per ottenere 21 (5,3 g, tR=10,2 min),23 (63 mg, tR=20,0 min), 22 (84 mg, tR { {164}},0 min) e 24 (33 mg, tR=26,5 min). La stessa porzione è stata purificata mediante HPLC semi-preparativo (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) utilizzando n-esano—acetato di etile (72:28) come eluente a una portata di 3 mL/min per ottenere 2 (24 mg, tR=24.3 min). La porzione VIeluita con n-esano—acetato di etile (40:60) è stata purificata mediante HPLC semi-preparativo (Hibar®Fertigäute,10 × 250 mm) utilizzando n-esano—acetato di etile (53:47) come eluente a una portata di 3 ml/min per ottenere 1(47 mg, tR=13.2 min).

3.4. Dati spettroscopici

acido {{0}}[3-(4-idrossi{3}}metossifenil)allil]ferulico (1): olio incolore; [ ]25D più 5.6◦(c 0.12, CH3OH);IR (ordinato) νmax 3444, 2935, 1633, 1509, 1434, 1376, 1267, 1153; positivo ESI-MS m/z 357.2 [M più H] più ; positivo HRESI-MS m/z 357.1331 [M più H] più (calcd per C20H21O6, 357.1333); Dati NMR 1H e 13C vedi Tabella 1.Cis-4-pentilcicloeso-3-ene-1,{36}}diolo (2): olio incolore; [ ]22D-20.3◦(c 0,20, CH3OH); IR (ordinato) νmax 3445,2919, 1660, 1455, 1371, 1225, 1084; ESIMS m/z 185,2 [M più H] più ; HRESI-MS m/z 185.1501 [M più H] più (calcd per C11H21O2, 185.1541); Per i dati NMR 1H e 13C vedere la tabella 2.

3.5. Analisi HPLC-DAD

Le analisi cromatografiche sono state eseguite su un sistema HPLC Hitachi composto da pompa L{{0}}, campionatore automatico L-7200, rivelatore L-7455 e software di acquisizione dati D-7000 system manager ,su una colonna XBridgeTM C18 (lunghezza 250 mm, diametro interno 4,6 mm, granulometria 5 um; acque). La fase mobile era costituita da H2O (solvente A) e CH3CN (solvente B). La portata era 1,0 mL/min. Il programma di eluizione era il seguente: isocratico con 2% B (0–5 min), 2–20% B (5–25 min), 20–90% B (25–30 min ) e isocratico con il 90% di B (30–35 min). Il volume di iniezione era di 10 L. Lo spettro visibile ai raggi UV è stato registrato a 240 nm.

3.6. Coltura cellulare

Le cellule di melanoma murino B16-F10 (CRL6475) sono state acquistate dall'Istituto di ricerca e sviluppo dell'industria alimentare (FIRDI, Hsinchu, Taiwan). Le cellule sono state coltivate nel 90% di Dulbecco'sModified Eagle's Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS, Sigma, St. Louis, MO, USA) e l'1% flaconi di coltura in soluzione di penicillina-streptomicina in un incubatore a CO2 con atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 nell'aria a 37 ◦C. Il mezzo di coltura è stato cambiato ogni due giorni. Le cellule sono state raccolte mediante tripsinizzazione quando erano circa l'85% confluenti, contate con un emocitometro (Neubauer Improved., Marienfeld, Germania) e seminate al numero appropriato in pozzetti di piastre di coltura cellulare per ulteriori esperimenti.

3.7. Test di vitalità cellulare

Per determinare la sicurezza dei vari estratti, la vitalità delle cellule dopo il trattamento con estratti è stata determinata mediante il test MTT. Questo metodo si basa sulla riduzione del3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{5}}difenil tetrazolio bromuro (MTT) a formazano da parte dei mitocondrialienzimi nelle cellule vitali [57]. La quantità di formazano formata è proporzionale al numero di cellule vitali presenti e può essere misurata spettrofotometricamente. In breve, cellule pretrattate con ormone stimolante i melanociti da 100 nM (-MSH) seminate a una densità di 1 × 104 cellule/pozzetto in una piastra a pozzetti 12- sono state lasciate aderire durante la notte. Isolati puri o arbutina sono stati quindi aggiunti a ciascun pozzetto e incubati per altre 72 ore. Quindi, le cellule trattate sono state etichettate con reagente colorante MTT (Applichem, Danimarca) in PBS(2 mg/mL) per 3 h. I precipitati di formazan sono stati disciolti mediante DMSO e le concentrazioni sono state misurate a 570 nm in un lettore di micropiastre. La vitalità cellulare è stata calcolata utilizzando la seguente formula: vitalità cellulare ( percentuale )=(campione A/controllo A) × 100, dove un campione e un controllo A sono le assorbanze dalla miscela con o senza l'aggiunta del campione di prova, rispettivamente.

3.8. Test del contenuto di melanina

Il contenuto di melanina è stato misurato come descritto in precedenza con lievi modifiche [58]. Le cellule di melanoma B16-F10 sono state seminate con 1 × 104 cellule/pozzetto in 3 ml di terreno in 6-piastre di coltura di pozzetti e incubate per una notte per consentire alle cellule di aderire. Le cellule sono state esposte a varie concentrazioni (25, 50 e 100 µM) degli isolati puri o di arbutina per 72 ore in presenza di 100 nM -MSH. Alla fine del trattamento, le cellule sono state lavate con PBS e lisate con 150 µl di NaOH 1 N (Merck, Germania) contenente il 10% di DMSO per 1 ora a 80°C. L'assorbanza a 405 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre. Il contenuto di melanina delle cellule di melanoma B16-F10 senza trattamento con composto è stato assegnato al 100% e il contenuto di melanina delle cellule trattate con il composto è stato calcolato rispetto al gruppo di controllo.

3.9. Saggio di pigmentazione del pesce zebra in vivo

Il protocollo sull'uso degli animali è stato rivisto e approvato dall'Institutional Animal Careand Use Committee or Panel (IACUC/IACUP) della Taipei Medical University (n. LAC-2017-0311). I metodi sono stati eseguiti in conformità con le leggi e le linee guida approvate. Gli embrioni di zebrafish di tipo selvatico sono stati raccolti dalla Zebrafish Core Facility della Taipei Medical University. La valutazione basata sul fenotipo dell'embrione di zebrafish è stata eseguita secondo lo studio precedente con lievi modifiche [50]. Gli embrioni sono stati incubati a 28°C con etanolo all'1% come controllo e una diversa concentrazione di composti da 7 hpf (post-fecondazione) a 72 hpf. Per valutare ilanti-melanogenesieffetti dei modulatori melanogenici sul processo di sviluppo del pesce zebra, la pigmentazione del pesce zebra è stata analizzata a 72 hpf. Gli embrioni sono stati montati in agarose a basso punto di fusione all'1% (Bioshop Canada, Burlington, ON, Canada) e le immagini acquisite con uno stereomicroscopio ZEISS Stemi508 (ZEISS, Oberkochen, Germania). L'analisi della misurazione dei pixel delle immagini è stata eseguita dal pacchetto Fiji di ImageJ. La quantificazione dei dati sulla pigmentazione è stata analizzata (l'area sotto gli occhi del pesce zebra) e confrontata con il gruppo di controllo.

3.10. Test di vitalità su cheratinociti epidermici umani normali

Tutte le cellule cutanee umane primarie di donatori sani utilizzate dal Dipartimento di Dermatologia del Centro medico dell'Università di Leiden sono isolate dal tessuto in eccesso raccolto secondo l'articolo 467 della legge olandese sull'accordo sulle cure mediche e il codice per l'uso corretto dei tessuti umani della Federazione olandese di biomedicina Società Scientifiche. Ai sensi dell'articolo 467 i tessuti in eccedenza possono essere utilizzati senza obiezioni da parte del paziente. Ciò significa che il paziente che verrà sottoposto a chirurgia plastica è ben informato sulla ricerca. Nessuno degli autori è stato coinvolto nel campionamento dei tessuti. I principi della Dichiarazione di Helsinki sono stati seguiti quando si lavora con i tessuti umani.

La pelle in eccesso di riduzione della mamma fresca di un singolo individuo femminile è stata utilizzata per l'isolamento dei normali cheratinociti epidermici umani (NHEK) come descritto in precedenza [59]. I NHEK nei modelli Leidenepidermal (LEM) sono stati incubati durante la notte in condizioni sommerse in cheratinocitimedium. Entro quattro giorni, il siero bovino fetale è stato gradualmente omesso e gli NHEK nei LEM sono stati coltivati ​​senza siero all'interfaccia aria-liquido per sette giorni, mentre il mezzo di coltura è stato rinfrescato due volte a settimana. I saggi di vitalità sono stati eseguiti aggiungendo 0.5 mL di 1 mg/mL di MTT a ciascuno dei NHEK in LEM per 3 ore, dopo 24 ore di esposizione ai composti in esame 1, 8 e DMSO (controllo negativo). il prodotto di formazano blu precipitato è stato estratto dalle cellule entro 2 ore con 0,5 ml di pozzetto di isopropanolper. La concentrazione di formazan è stata misurata determinando la DO a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre aTecan Infinite F50.

3.11. Analisi statistica

Tutti i dati nel nostro studio sono stati ottenuti come medie di esperimenti eseguiti almeno in triplicato ed espressi come medie ± SD (deviazione standard). L'analisi statistica è stata eseguita mediante il test t di Student. La significatività statistica dei risultati è stata fissata a p < 0.05="" (*)="" e="" p="">< 0,01="">

3.12. Studio di docking molecolare della B16-Mus Musculus tirosinasi

3.12.1. Modellazione dell'omologia

Poiché al momento non sono disponibili strutture tridimensionali per Mus musculus tirosinasi, l'Homologymodelling è il metodo più sicuro per la previsione di strutture tridimensionali di proteine ​​sconosciute basato sul presupposto che la struttura della proteina sconosciuta sia simile alle strutture note di alcuni riferimenti omologhi proteine. Abbiamo acquisito la sequenza di amminoacidi della tirosinasi Mus musculus dal National Center for Biotechnology Information. database di sequenze proteiche. Un modello proteico omologo della proteina di query Mus musculustyrosinase è stato identificato da Phyre2 (Protein Homology/analog Y Recognition Engine V 2.0) [60]. I 446 residui (81% della sequenza Mus musculus ) sono stati modellati con una confidenza del 100,0% dal singolo modello di punteggio più alto come codice PDB: c5m8pA è stato scelto come recettore per gli studi di calcolo dell'aggancio.

3.12.2. Analisi dell'interazione ligando-proteina

Il sito di legame della tirosinasi Mus musculus è stato determinato sulla base dei sei residui di amminoacidi di riferimento dell'umanotirosinasi (PDB 5M8M) e la tasca di legame ha due rame. Pertanto, è stata definita la sfera del sito di legame. Successivamente, la struttura 3D del composto 8 è stata preparata e ottimizzata mediante la riduzione al minimo dell'energia ancorata nella tasca di legame della tirosinasi Mus musculus utilizzando il programma CDOCKER e il numero di esecuzioni di aggancio è stato impostato su 50 per l'inibitore. Tutti gli altri parametri sono stati impostati come predefiniti per l'analisi dell'interazione ligando-proteina tramite l'utilizzo di BioviaDiscovery Studio v.4.0 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA, USA). Infine, dalle 50 conformazioni di attracco, è stata scelta quella superiore con il punteggio energetico CDOCKER più alto per esplorare la modalità di legame del composto ancorato nel sito attivo della tirosinasi di Mus musculus.

4. Conclusioni

Nel presente studio, abbiamo adottato un metodo guidato dal saggio biologico utilizzando cellule B16-F10 per isolare i costituenti dell'antimelanogenesi dagli estratti di rizoma di L. sinense. I costituenti attivi sono stati determinati essere acido 5-[3-(4-idrossi{6}}metossifenil)allil]ferulico (1) e (3S,3aR)-neocnidilide (8). Secondo l'analisi HPLC, il contenuto del composto 8 rappresenta lo 0,15% dell'estratto grezzo. Ilantimelanogenesil'attività di 8 è stata verificata sia da cellule B16-F10 in vitro che da saggi in vivo di zebrafish. Tutti questi risultati hanno suggerito che 8 potrebbe, almeno, fornire una giustificazione per il potenziale di L. sinense per la sua elevata potenza e quantità . I dati sulla vitalità cellulare sulle cellule B16-F10 e NHEKsemplicemente che 8 potrebbe essere potenzialmente sviluppato come agente antimelanogenesi. La modalità d'azione di8 sull'antimelanogenesi è stata ipotizzata come l'inibizione dell'attività della tirosinasi basata sui risultati dell'aggancio molecolare; tuttavia, ciò resta da confermare ulteriormente. La nostra scoperta ha rivelato che il composto 8 ha mostratoanti-melanogenesieffetti e sicurezza attraverso studi in vitro, in vivo ed ex vivo, tuttavia, l'efficacia depigmentante e la biosicurezza sulla pelle umana devono essere valutate e convalidate da studi clinici in futuro.