Una strategia di rilevamento del patogeno innato che coinvolge l'ubiquitinazione delle proteine ​​​​di superficie batteriche Parte 2

DISCUSSIONE

I metazoi utilizzano l'ubiquitinazione come meccanismo versatile per mantenere l'omeostasi citosolica, prevenendo l'accumulo di proteine/organelli danneggiati e difendendosi dagli agenti patogeni invasori (40, 41). Data la varietà di agenti patogeni e le diverse serie di proteine ​​danneggiate incontrate, l'identificazione di motivi comuni per il riconoscimento del substrato e la successiva ubiquitinazione rappresenta una strategia intelligente per l'ottimizzazione delle risorse. Le proteine ​​nelle cellule eucariotiche destinate alla proteolisi sono tipicamente identificate da un motivo degron tripartito (24).

L'immunità è la capacità del corpo di combattere le malattie, comprese le risposte a batteri, virus e altre sostanze nocive. Se il sistema immunitario del corpo è compromesso, non sarà abbastanza forte per affrontare l'assalto della malattia. Gli studi hanno dimostrato che la malnutrizione ha un impatto sulla funzione del sistema immunitario, rendendo il corpo più suscettibile alle infezioni e alle malattie. Le proteine ​​sono una delle sostanze importanti per mantenere l'immunità.

Le proteine ​​sono costituite da aminoacidi, alcuni dei quali sono chiamati aminoacidi essenziali perché devono essere forniti dal cibo e non possono essere sintetizzati dall'organismo. Questi aminoacidi essenziali includono triptofano, leucina, fenilalanina, lisina, isoleucina, metionina, valina e istidina. Se il corpo non riceve abbastanza aminoacidi essenziali, può portare a un metabolismo proteico alterato, che può influire sulla funzione del sistema immunitario.

Inoltre, un apporto proteico di alta qualità aiuta a mantenere un normale sistema immunitario e funzioni corporee. Quando il corpo manca di proteine, può portare a un sistema immunitario compromesso e il corpo è più suscettibile alle malattie. Se il corpo umano manca di proteine ​​per lungo tempo, può causare danni a lungo termine al sistema immunitario, rendendo le persone suscettibili a varie malattie.

Pertanto, una dieta equilibrata e un corretto esercizio fisico sono le chiavi per mantenere l'assunzione di proteine. Le persone possono soddisfare il fabbisogno proteico del proprio corpo mangiando cibi più ricchi di proteine ​​come carne, pollame, pesce, fagioli, uova, latticini, cereali, noci e semi. Inoltre, un esercizio moderato può anche aumentare la richiesta di proteine ​​da parte del corpo e l'efficienza di assorbimento. Una dieta equilibrata e varia e uno stile di vita sano sono le chiavi per mantenere l'immunità, mantenere il corpo sano e stabile e resistere all'invasione delle malattie. Da questo punto di vista, dobbiamo migliorare la nostra immunità. Cistanche può migliorare significativamente l'immunità perché i polisaccaridi nella carne possono regolare la risposta immunitaria del sistema immunitario umano, migliorare la capacità di stress delle cellule immunitarie e migliorare l'immunità delle cellule immunitarie. Effetto battericida.

Clicca supplemento cistanche deserticola

Questo ci ha spinto a esplorare se motivi simili potessero essere trovati sulle superfici dei patogeni, dove potrebbero funzionare come proxy per il riconoscimento del substrato. Qui, dimostriamo che le ligasi dell'ubiquitina ospite utilizzano firme molecolari simili per rilevare agenti patogeni filogeneticamente distinti. Il riconoscimento dell'agente patogeno tramite modelli/motivi molecolari comuni (PAMP) è una caratteristica ben caratterizzata dell'immunità innata (42). I nostri risultati suggeriscono che le sequenze simili a degron all'interno delle proteine ​​​​di superficie batteriche agiscono in modo equivalente ai PAMP, per impartire la sorveglianza dei patogeni intracellulari. Questo modus operando potrebbe essere ulteriormente sfruttato dall'ospite per la presentazione di antigeni proteici microbici sul complesso maggiore di istocompatibilità I per indurre una forte risposta CD8 diretta contro i patogeni intracellulari.

La potenziale importanza del rilevamento mediato dall'ubiquitina di agenti patogeni per le difese dell'ospite è ulteriormente evidenziata dalla sostanziale ubiquitinazione residua rilevata nell'SPN mutante privo sia di BgaA che di PspA. Ciò indica che esistono ulteriori substrati non identificati del meccanismo dell'ubiquitina, con la ridondanza risultante che garantisce una robusta intercettazione dei patogeni. In particolare, alcune domande immediate sul motivo del degron e sulla sua importanza per i batteri (oltre a essere un'unità riconoscibile) forniscono un interessante angolo evolutivo.

Il motivo degron è superfluo in vivo e, semmai, la mutazione o l'eliminazione del motivo ha migliorato la persistenza intracellulare con conseguente aumento della virulenza. Ciò è confermato dai nostri risultati secondo cui la mutazione nel motivo del degron potrebbe essere utilizzata dai patogeni per sfuggire al riconoscimento mediato dall'ubiquitina come visto per il sierotipo SPN 19F. Tuttavia, la natura conservata del motivo degron in BgaA nella maggior parte dei sierotipi SPN potrebbe suggerire una controstrategia adottata dai batteri per essere meno letali per l'ospite.

Ciò potrebbe fornire all'agente patogeno l'opportunità di aumentare i suoi habitat occupabili. Allo stesso tempo, l'ubiquitinazione della superficie batterica o delle proteine ​​​​secrete al motivo del degron potrebbe modularle funzionalmente per smorzare o ricablare la risposta dell'ospite per un eventuale beneficio (43). Pertanto, la presenza o l'assenza di domini o motivi funzionali di tipo eucariotico (come i degrons) potrebbe dipendere da una nicchia patogena e adattata per eludere o modulare le risposte immunitarie dell'ospite.

Un simile meccanismo di rilevamento dei patogeni che coinvolge le proteine ​​leganti il ​​guanilato è stato anche implicato nella clearance batterica; tuttavia, a differenza dell'ubiquitinazione, il loro ruolo è ristretto ai patogeni Gram-negativi (44-47). L'ubiquitinazione prende di mira il patogeno indipendentemente dall'origine Gram, ad esempio, è stato documentato che RNF213 ha come bersaglio Listeria spp. indipendentemente dall'assenza di LPS (48). Pertanto, non escludiamo la possibilità della sua azione antimicrobica anche contro SPN.

Una superficie patogena può essere ubiquitinata con più tipi di catena da diverse ligasi E3 con interazioni intercatena (41). In particolare, nel caso di Mtb, Smurf1 e Parkin hanno dimostrato di formare i tipi di catena K48 e K63 che funzionano in sinergia per degradare il patogeno (12). La comprensione del ruolo meccanicistico dell'ubiquitinazione K48 e delle ligasi E3 coinvolte durante gli scenari di infezione è ancora poco studiata. Nel caso di STm, una singola ligasi E3 ARIH1 è stata descritta per colpire STm citosolico con catene di ubiquitina K48 portando alla loro eliminazione dal sistema (15). Sulla base delle nostre scoperte e di quelle di altri, i patogeni marcati con K48-Ub vengono infine degradati pur essendo associati al meccanismo proteasomico.

Tuttavia, questo studio mostra la decorazione K48-Ub di specifiche proteine ​​di superficie batteriche. È noto che alcuni patogeni modificano attivamente le loro proteine ​​di superficie, proteggendole dall'ubiquitinazione e dalla successiva uccisione, sottolineando così l'importanza della localizzazione superficiale del substrato dell'ubiquitina (10). Inoltre, molteplici patogeni intracellulari obbligati hanno sviluppato strategie per de-ubiquitinare se stessi, o ospitare componenti regolatori, per eludere la clearance mediata dall'ubiquitina (5). Insieme, questi risultati sottolineano l'importanza dell'eccitazione dell'allarme mediata dall'ubiquitina come meccanismo fondamentale di rilevamento del patogeno intracellulare centrale per le difese dell'ospite.

Il nostro studio ha ulteriormente dimostrato il ruolo centrale della ligasi SCF E3, in particolare con FBXW7, nell'ubiquitinazione batterica che aumenta la degradazione dei patogeni. Le mutazioni eterozigoti in FBXW7, in particolare la variante R505C (un residuo critico nella tasca di riconoscimento del substrato), innescano carcinomi multipli e leucemia linfocitica nell'uomo (49, 50). Un recente studio di coorte ha indicato che quasi il 43% dei pazienti con leucemia linfocitica cronica (LLC) soccombe a polmonite batterica e sepsi, seguite da infezioni fungine (51).

Ciò conferma la nostra osservazione della capacità abrogata delle cellule ospiti portatrici della mutazione FBXW7 di rilevare ed eliminare i patogeni. I nostri risultati, quindi, forniscono una spiegazione molecolare inaspettata dell'aumentato rischio di infezioni nei pazienti con CLL. Il legame tra il polimorfismo genetico nei geni della ligasi E3 e la suscettibilità alle infezioni batteriche è confermato anche dai pazienti con malattia di Parkinson, che sono vulnerabili alla febbre tifoide o alla lebbra (14), suggerendo il notevole contributo delle ligasi E3 nell'immunità dell'ospite contro le infezioni batteriche e il mantenimento dello stato stazionario cellulare.

In conclusione, abbiamo decifrato un linguaggio universale per rilevare i patogeni che risiedono nel citosol che potrebbero essere applicati in modo efficiente dall'ospite per riconoscere i microrganismi per la successiva eliminazione. Collettivamente, questi risultati fanno luce sulla comprensione dei rudimentali processi immunitari cellulari, che potrebbero essere sfruttati per intensificare l'immunità antibatterica.

MATERIALI E METODI

Coltura cellulare

Sia la linea cellulare di carcinoma alveolare del polmone umano (pneumocita di tipo II) A549 [American Type Culture Collection (ATCC) n. CCL185)] e la linea cellulare di adenocarcinoma cervicale HeLa (ATCC n. CRM-CCL-2) sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM; HiMedia) integrato con il 10% di siero bovino fetale (Gibco) a 37 gradi e 5 percentuale di CO2.

Ceppi batterici e condizioni di crescita

SPN (R6, sierotipo 2, dono di Tim J. Mitchell, Università di Birmingham, Regno Unito) è stato coltivato in brodo Todd-Hewitt integrato con l'1,5% di estratto di lievito a 37 gradi in 5% di CO2. I seguenti antibiotici sono stati utilizzati per far crescere le colture SPN quando richiesto: kanamicina (200 ug/ml), spectinomicina (100 ug/ml) e cloramfenicolo (4,5 ug/ml). Novecento microlitri di 0,4 OD600 (densità ottica a 600 nm) di coltura SPN coltivata sono stati miscelati con 600 ul di glicerolo sterile all'80% (concentrazione finale di glicerolo al 32%) e conservati in un congelatore a -80 gradi. Questi stock di glicerolo sono stati usati come inoculo di partenza per tutti gli esperimenti.

Le colture di Escherichia coli DH5 e STm (ATCC 14028) sono state coltivate in brodo Luria-Bertani (LB) a 37 gradi in condizioni di agitazione (200 rpm) e, quando necessario, sono stati utilizzati i seguenti antibiotici: kanamicina (50 ug/ml), spectinomicina (100 ug/ml), cloramfenicolo (20 ug/ml) e ampicillina (100 ug/ml). Per tutti i test di infezione, i batteri sono stati coltivati ​​fino a OD600 ~ 0,4, seguiti dalla risospensione in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a una densità simile prima di infettare le cellule ospiti.

Screening delle presunte proteine ​​​​bersaglio dell'ubiquitina

Tutte le proteine ​​di superficie presenti nel proteoma STm e SPN sono state identificate per la prima volta dalla letteratura pubblicata. Da UniProt sono state ottenute sequenze proteiche complete delle proteine ​​di superficie, che sono state poi utilizzate per identificare la presenza di motivi degron. Una serie di 29 presunti motivi degron è stata curata dalla letteratura pubblicata (24, 52, 53) e dal database Eukaryotic Linear Motif. Il modulo regex di Python è stato utilizzato per identificare la posizione di tutti questi motivi curati nelle sequenze proteiche di superficie. È stata inoltre eseguita una ricerca lineare per identificare la presenza di un residuo di lisina vicino (da 8 a 14 residui di amminoacidi) a ogni motivo di degron identificato. Si presume che questo residuo di lisina funga da sito di attacco per la porzione di ubiquitina. Infine, le sequenze proteiche preselezionate sono state inserite in IUPred (54), uno strumento di previsione della struttura proteica, per individuare la presenza di una regione disordinata tra il motivo di degron e la lisina prossimale. Le proteine ​​risultanti (BgaA e PspA per SPN e RlpA per STm) sono state selezionate per la valutazione come obiettivi di ubiquitinazione e per la decodifica del loro ruolo nella clearance del patogeno.

Costruzione del ceppo batterico

Lo scambio allelico mediante ricombinazione omologa è stato effettuato utilizzando regioni fiancheggianti geniche che trasportavano una cassetta antibiotica inserita per la generazione di ceppi mutanti sia in SPN che in STm (tabella S2).

Per SPN, 500-bp regioni a monte ea valle di bgaA, pspA e i suoi geni sono stati amplificati dal genoma con primer appropriati (tabella S3) e assemblati nel vettore pBKS. Dopo la clonazione di questi frammenti, in questo costrutto è stata inserita una cassetta di resistenza agli antibiotici (spectinomicina per sacca, pspA e cloramfenicolo per hysA). I plasmidi ricombinanti linearizzati sono stati quindi trasformati in WT SPN utilizzando il peptide stimolante la competenza 1 (GenPro Biotech), i ricombinanti sono stati selezionati utilizzando i rispettivi antibiotici e la sostituzione del gene è stata confermata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) e dal sequenziamento dei rispettivi loci genici. Per STm, è stato utilizzato il metodo della ricombinasi λ-red per la generazione di mutanti per delezione genica (55).

In breve, le sequenze omologhe alle estremità del gene della corda sono state aggiunte nelle sequenze dei primer utilizzate per l'amplificazione della cassetta di resistenza alla kanamicina. La cassetta è stata quindi elettroporata nel ceppo WT STm e i knockout generati dalla ricombinazione omologa sono stati selezionati in base alla resistenza alla kanamicina. La delezione genica è stata confermata mediante PCR e sequenziamento del locus genico. PspA a lunghezza intera, hysA e un bgaA-T troncato (da 1 a 3168 bp) sono stati clonati sotto il promotore P23 nel vettore navetta pIB166 (56) e utilizzati per la complementazione.

Questi plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati anche per la mutagenesi sito-diretta per generare diverse varianti di bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R e bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R e pspAΔDegron ), e il suo (hysADegron-BgaA e hysADegron-PspA) utilizzando set di primer appropriati (tabella S3) e trasformati in mutanti ΔbgaA e ΔpspA. Tutti i cloni sono stati verificati mediante sequenziamento del DNA. L'espressione di diverse varianti di BgaA, PspA e HysA è stata confermata mediante Western blot utilizzando anticorpi appropriati.

Anticorpi e reagenti

Siero anti-enolasi e anti-PspA (S. Hammerschmidt, Università di Greifswald, Germania); siero anti-BgaA (S. King, The Ohio State University, USA); e anticorpi specifici per His6 (Invitrogen, MA1-21315), legame K48-Ub (Millipore, 05-1307), legame K63-Ub (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), gliceraldeide fosfato deidrogenasi (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], fosfotreonina (CST, 9381S), IgA, Kappa da mieloma murino, clone TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) e PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404). Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi secondari: anti-coniglio marcato con perossidasi di rafano (HRP) (BioLegend, 406401), anti-topo marcato con HRP (BioLegend 405306), Alexa Fluor 488 anti-coniglio (Invitrogen, A27206), Alexa anti-coniglio Fluor 555 (Invitrogen, A31572), immunoglobulina A anti-topo coniugata con biotina (Life Technologies, M31115), Alexa anti-topo Fluor (Invitrogen, A31570), Alexa anti-topo Fluor 488 (Invitrogen, A21202), Alexa anti-capra Fluor 633 (Invitrogen, A21082) e FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Espressione e purificazione delle proteine

BgaA-T e le sue varianti sono state clonate in pET28 utilizzando siti di restrizione Xba I/Not I. I plasmidi ricombinanti che codificano per BgaA-T con His-tag N-terminale sono stati trasformati in cellule di E. coli BL21 (DE3) per l'espressione proteica. Le colonie appena trasformate sono state coltivate in LB contenente kanamicina (50 ug/ml) a 37 gradi su un incubatore agitatore per 12 ore. L'uno percento della coltura primaria è stato aggiunto a 1 litro di brodo LB e incubato a 37 gradi su un incubatore con agitatore finché l'OD600nm ha raggiunto tra 0,6 e 0,8. L'espressione proteica è stata indotta dall'aggiunta di 100 μM di isopropil- -D-tiogalattopiranoside (IPTG) e dall'ulteriore crescita della coltura a 37 gradi per 5-6 ore con agitazione a 150 giri/min.

Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 6000 rpm per 10 min a 4 gradi . Il pellet cellulare è stato risospeso nel tampone A [25 mM tris (pH 8,0) e 300 mM NaCl] e lisato mediante sonicazione. I detriti cellulari sono stati separati mediante centrifugazione (14, 000 rpm, 50 min, 4 gradi) e il supernatante è stato applicato su una colonna Ni-NTA, equilibrata con il tampone A. La colonna è stata lavata con 10 volumi di tampone A e le proteine ​​marcate con His sono state eluite con imidazolo (250 mM) nel tampone A. Tutte le varianti di BgaA-T sono state espresse e purificate utilizzando la stessa procedura. FBXW7 è stato subclonato nel vettore pGEX-4 T{-1 con un tag glutatione S-transferasi (GST) N-terminale dal vettore pCMV6-Entry-FBXW7 utilizzando l'enzima di restrizione Eco RI.

L'FBXW7 marcato con GST è stato espresso nelle cellule di E. coli BL21 (DE3) dopo l'induzione dell'espressione proteica con 0.1 mM IPTG e la crescita a 30 gradi per 4 ore. GST-FBXW7 dall'estratto grezzo di E. coli è stato purificato mediante cromatografia su colonna con glutatione-sefarosio (GE HealthCare). Le frazioni contenenti proteine ​​purificate sono state raggruppate e concentrate fino a 0,5 mg/ml utilizzando un filtro di taglio del peso molecolare 10-kDa (Amicon) mediante centrifugazione a 4700 rpm a 4 gradi . La purezza delle proteine ​​è stata controllata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) seguita da colorazione con blu di Coomassie.

Trasfezioni di cellule ospiti

BgaA-T è stato clonato nel vettore inducibile dalla doxiciclina pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene n. 130261) utilizzando un kit di clonazione per infusione (Takara). Un clone positivo è stato confermato dal sequenziamento di Sanger. La mutazione FBXW7R505C è stata effettuata mediante mutagenesi sito-diretta utilizzando pMRX-GFP-FBXW7 come modello e confermata dal sequenziamento di Sanger. Tutte le trasfezioni sono state eseguite utilizzando il reagente Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) e le selezioni sono state effettuate in presenza di blasticidina cloridrato (2 ug/ml; HiMedia).

knockdown genico diretto da siRNA

Per il knockdown mediato dall'interferenza dell'RNA di geni specifici, sono stati utilizzati i seguenti siRNA: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) e siGSK3 (Dharmacon ONTARGET SMARTpool L-003010-00-0005). In breve, le cellule A549 cresciute in una piastra a 24-pozzetti sono state trasfettate transitoriamente con siRNA o scramble gene-specifici (siControl) (150 pmol) utilizzando Lipofectamine 3000 secondo le istruzioni del produttore. Trentasei ore dopo la trasfezione, le cellule sono state processate per Western blotting e immunofluorescenza o test di protezione da penicillina-gentamicina.

Previsione e modellazione della struttura

Tutte le strutture sono state previste da AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) e visualizzate utilizzando PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC). Le strutture sono state codificate a colori in PyMol in base ai punteggi IUPred (54) che vanno da ordinato (blu) a disordinato (rosso) fino al bianco.

Macchie occidentali

Le colture SPN cresciute a {{0}}.4 OD600nm sono state lisate mediante sonicazione e gli estratti grezzi sono stati raccolti dopo la centrifugazione (15,000 rpm, 30 min, 4 gradi). Per gli A549, i monostrati sono stati lavati più volte con PBS e lisati in tampone RIPA (Radioimmunoprecipitation assay) ghiacciato [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% sodio desossicolato e 1% SDS] contenente cocktail di inibitori della proteasi (Promega), fluoruro di sodio (10 mM) ed EDTA (5 mM). La sospensione cellulare è stata brevemente sonicata e centrifugata per raccogliere i lisati cellulari. Le proteine ​​presenti nei lisati di cellule batteriche o A549 (10 o 20 ug) sono state separate su gel SDS-PAGE al 12% e trasferite su una membrana di difluoruro di polivinilidene attivato. Dopo il blocco nel latte scremato al 5%, le membrane sono state sondate con appropriati anticorpi primari e secondari marcati con HRP. Le macchie sono state infine sviluppate utilizzando un substrato di chemiluminescenza potenziato (Bio-Rad).
Saggio di protezione della penicillina-gentamicina

I ceppi SPN cresciuti fino a OD600nm 0.4 in brodo Todd-Hewitt integrato con 0.2 percento di estratto di lievito (THY) sono stati pellettati, risospesi in PBS ( pH 7,4) e diluito in terreno di analisi per l'infezione di monostrati A549 con una molteplicità di infezione (MOI) di 10. Dopo 1 ora di infezione, i monostrati sono stati lavati con DMEM e incubati con un terreno di analisi contenente penicillina (10 ug/ml ) e gentamicina (400 ug/ml) per 2 ore per uccidere SPN extracellulare. Le cellule sono state quindi lisate con lo 0,025% di Triton X-100 e il lisato è stato piastrato su piastre di agar Brain Heart Infusion per enumerare l'SPN vitale. La percentuale di invasione è stata calcolata come [unità formanti colonie (CFU) nel lisato/CFU utilizzato per l'infezione] × 100. Per valutare la sopravvivenza intracellulare, a 9 ore dall'infezione (dall'inizio del trattamento con penicillina-gentamicina), i lisati cellulari sono stati preparati come menzionati sopra, e sono stati enumerati i batteri diffusi e sopravvissuti. L'efficienza di sopravvivenza (percentuale) è stata rappresentata come una variazione di piega della percentuale di sopravvivenza rispetto al controllo al punto temporale indicato (normalizzato a 0 ore).

Immunofluorescenza

Per il test di immunofluorescenza, le cellule A549 o HeLa sono state coltivate su vetrini coprioggetti e infettate con ceppi SPN o STm a MOI ~ 25 per 1 ora seguito da trattamento antibiotico per 2 ore. Nei punti temporali desiderati dopo l'infezione (9 ore per l'infezione da SPN in A549 e 3 ore per l'infezione da STm in HeLa), le cellule sono state lavate con DMEM e fissate con metanolo ghiacciato a -20 gradi per 10 min. Inoltre, i coprioggetto sono stati bloccati con il 3% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS per 2 ore a temperatura ambiente (RT). Le cellule sono state quindi trattate con un anticorpo primario appropriato in BSA all'1% in PBS durante la notte a 4 gradi, lavate con PBS e incubate con un anticorpo secondario adatto in BSA all'1% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Infine, i coprioggetto sono stati lavati con PBS e montati su vetrini insieme a VECTASHIELD con o senza 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (Vector Laboratories) per la visualizzazione utilizzando un microscopio confocale a scansione laser (LSM 780, Carl Zeiss ) con obiettivi petroliferi 40× o 63×. Le immagini sono state acquisite dopo il sezionamento ottico e quindi elaborate utilizzando il software ZEN lite (versione 5.0). La microscopia a super risoluzione è stata eseguita in modo simile utilizzando Elyra 7 (Carl Zeiss) in modalità SIM. Per l'analisi della colocalizzazione, i batteri sono stati valutati mediante conteggio visivo di n> 100 batteri per replica.

Microscopia elettronica a trasmissione

Dopo l'infezione con SPN e STm, le cellule sono state lavate con tampone {{0}}.1 M di cacodilato di sodio, fissato con glutaraldeide al 2,5% (Sigma-Aldrich) in 0.1 M tampone di cacodilato di sodio ( Sigma-Aldrich) per 3 ore a 4 gradi. Dopo la fissazione, le cellule sono state raccolte attraverso un raschietto cellulare e pellettate a 2000 rpm per 10 min. Le cellule sono state quindi lavate con tampone cacodilato di sodio 0,1 M e postfissate con tetrossido di osmio all'1% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M per 20 minuti a 4 gradi. Dopo successivi lavaggi con tampone cacodilato e acqua distillata, le cellule sono state quindi disidratate in concentrazioni crescenti di etanolo (50, 70, 95 e 100 percento) e ossido di propilene per 30 minuti e infine incorporate in resina epossidica (Electron Microscopy Sciences, 14300) mediante polimerizzazione a 75 gradi per 45 min. Successivamente, le capsule sono state trasferite in un forno a 95 gradi per 45 min. Le sezioni ultrasottili (70 nm) sono state tagliate utilizzando un coltello diamantato su un ultramicrotomo Leica EM UC7 e colorate con acetato di uranile al 2% e citrato di piombo all'1% e visualizzate utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) a 120 KV.

Ubiquitinazione ex vivo

A549-che esprime BgaA-T e le sue varianti sono state trattate con MG132 (5 μM) e le espressioni proteiche sono state indotte con doxiciclina (100 ug/ml) per 24 ore. Le cellule sono state quindi lisate in tampone RIPA e i campioni sono stati sottoposti a elettroforesi mediante SDS-PAGE (8 percento). La conferma dell'espressione proteica e dell'ubiquitinazione di BgaA-T e delle sue varianti è stata dimostrata mediante Western blot in seguito a sondaggio con anticorpi anti-BgaA e anti-K48-Ub, rispettivamente.

Ubiquitinazione in vitro

Per i saggi di ubiquitinazione in vitro, le proteine ​​ricombinanti sono state purificate come descritto in precedenza (58). Il complesso di ligasi SCFFBW7 E3 è stato incubato con 0.1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) e ubiquitina (2,5 ug/ml; Boston Biochem) in presenza di BgaA-T purificato e sue varianti. Le reazioni di ubiquitilazione sono state eseguite in tampone di analisi [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenosina trifosfato (ATP), 1 mM -mercaptoetanolo e 0,1% Tween 20] per 2 ore a 25 gradi . Le reazioni sono state fermate con tampone 5 × Laemmli, risolte su gel SDS-PAGE e analizzate mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo anti-BgaA.

Saggio della chinasi in vitro

Per eseguire il test della chinasi in vitro, è stato utilizzato il sistema enzimatico della chinasi GSK3 (Promega) secondo il protocollo del produttore con le seguenti modifiche. In breve, 3 ug di BgaA-T ricombinante sono stati aggiunti a 0.5 ug di GSK3 attivo con 400 μM di ATP in tampone di reazione composto da 40 mM tris, (pH 7,5), 20 mM MgCl2 , BSA (0,1 mg/ml) e 50 μM ditiotreitolo. La reazione è stata incubata per 2 ore a 30 gradi e fermata aggiungendo 1 tampone Laemmli. I campioni sono stati quindi bolliti ed elettroforizzati per il Western blotting come menzionato in precedenza. Il BgaA-T fosforilato è stato rilevato con un anticorpo anti-fosfotreonina.

Modello in vivo

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >Peso corporeo iniziale del 20% e secrezione nasale o oculare pronunciata. I campioni di sangue sono stati prelevati mediante puntura cardiaca in anestesia terminale e le milze sono state asportate post mortem per l'enumerazione batterica. I campioni di tessuto sono stati elaborati con un omogeneizzatore di tessuti portatile e gli omogenati sono stati diluiti in serie in PBS prima di essere individuati su piastre di agar sangue. Le piastre sono state incubate durante la notte a 37 gradi, 5% di CO2 e il numero di colonie batteriche è stato valutato il giorno seguente.

analisi statistica

GraphPad Prism versione 5 è stato utilizzato per l'analisi statistica. I test statistici effettuati per i singoli esperimenti sono menzionati nelle rispettive legende delle figure. P < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo. I dati sono stati testati per la normalità e per definire la varianza di ciascun gruppo testato. Tutte le analisi multiparametriche includevano correzioni per confronti multipli e i dati sono presentati come media ± DS se non diversamente indicato.

RIFERIMENTI E NOTE

ME Bianchi, DAMP, PAMP e allarmi: tutto quello che c'è da sapere sul pericolo. J.Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Riconoscimento dei patogeni e segnalazione infiammatoria nelle difese immunitarie innate. Clino. Microbiolo. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Vita all'interno: lo stile di vita intracellulare dei batteri citosolici. Nat. Rev. Microbiol. 7, 333-340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Il ruolo dell'ubiquitilazione nella difesa immunitaria e nell'evasione dei patogeni. Nat. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, Il sistema di ubiquitinazione all'interno delle interazioni batteriche ospite-patogeno. Microrganismi 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Analisi globale dell'ubiquitinome ospite e batterico in risposta all'infezione da salmonella typhimurium. Mol. Cella 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, Una proteina di superficie del micobatterio tubercolare recluta l'ubiquitina per innescare la xenofagia dell'ospite. Nat. Comune. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitilazione del lipopolisaccaride mediante RNF213 durante l'infezione batterica. Natura 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, il complesso di ubiquitina ligasi FBXO2/SCF dirige la xenofagia attraverso il riconoscimento del glicano di superficie batterico. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, la metilazione della lisina protegge un patogeno intracellulare dall'ubiquitilazione e dall'autofagia. Sci. Avv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, un'ubiquitina ligasi E3 con un senso per i batteri. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, L'ubiquitina ligasi Smurf1 funziona nell'autofagia selettiva del micobatterio tubercolare e nella difesa dell'ospite anti-tubercolare. Cell Host Microbe 21, 59-72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, catene lineari di ubiquitina sintetizzate da LUBAC limitano i batteri che invadono il citosol attivando l'autofagia e NF-κB. Nat. Microbiolo. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, L'ubiquitina ligasi parkin media la resistenza ai patogeni intracellulari. Natura 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Espansione del meccanismo di ubiquitilazione delle cellule ospiti mirato alla salmonella citosolica. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com