Analisi dell'espressione dei microRNA dopo l'intervento con glutammina nella lesione acuta da ischemia-riperfusione renale

Sfondo.Ischemia-riperfusionedanno renale acuto(I/R AKI) è agrave malattia renalecon elevata mortalità e morbilità. Questo studio mirava ad esplorare ilmeccanismo protettivo della glutammina(GLN) contro I/R AKI.Metodi. GiÈ stato stabilito il modello di ratto I/R AKI e HEcolorazione del tessuto renale e della creatinina siericaSono stati eseguiti il ​​rilevamento dell'azoto ureico (SCr) e dell'azoto ureico nel sangue (BUN). I miRNA sono stati sequenziati mediante elevata produttivitàcampioni di tessuto renale di ratto. Sono stati esaminati i miRNA (DEmiR) espressi in modo differenziale tra il gruppo I/R e il gruppo I/R + GLN ed è stata eseguita l'analisi di arricchimento per i geni bersaglio dei DEmiR. Nel frattempo, sono state coltivate cellule umane HK-2 ed è stato creato un modello I/R per verificare l'espressione dei DEmiR.Risultati.Rispetto al gruppo I/R, i livelli di SCr e BUN in ciascun momento erano inferiori nel gruppo I/R + GLN. La degenerazione vacuolare dei tubuli renali nel gruppo I/R + GLN era significativamente ridotta. Nei 104 DEmiR, abbiamo selezionato miR-132-5p, miR- 205 e miR-615 come miRNA chiave. L'analisi KEGG ha mostrato che la via di segnalazione Notch, la via di segnalazione PI3K-Akt e la via di segnalazione cGMP erano principalmente correlate al GLN contro I/R. La qRT-PCR ha verificato la downregulation di miR-205 nel gruppo I/R, rispetto al gruppo sham e I/R del gruppo GLN. Il modello I/R è stato stabilito con cellule HK-2 e l'espressione di miR- 132-5p e miR-205 è stata ridotta.

Conclusione.Il GLN ha ridotto l’AKI indotto da I/R. Sono state riscontrate differenze significative tra l'espressione dei miRNA in I/R dopo il trattamento con GLN. Il processo di GLN contro l’AKI indotto da I/R può essere correlato alla via di segnalazione Notch e PI3K-Akt.

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1. Introduzione

Danno renale acuto(AKI) è caratterizzato dafunzionalità renale acutaperdita e colpisce 13,3 milioni di persone ogni anno [1]. Tra una varietà di fattori, renaledanno da ischemia-riperfusione(I/R) è una delle cause alla base dell’AKI e un problema inevitabiletrapianto di rene[2, 3]. L’AKI associato a I/R è associato ad elevata morbilità e mortalità e attualmente non esiste un trattamento efficace [4].

Nella pratica clinica, l’AKI si manifesta con l’accumulo dei prodotti finali del metabolismo dell’azoto (urea e creatinina) e con la diminuzione della produzione di urina [5]. Inoltre, si è verificato un danno concomitante alle cellule epiteliali tubulari renali e ai vasi sanguigni e una forte risposta infiammatoria [6, 7]. Studi recenti hanno scoperto che la glutammina, un farmaco utilizzato come terapia nutrizionale convenzionale per l’AKI, potrebbe proteggere il rene riducendo lo stress ossidativo [8, 9]. In determinate circostanze fisiologiche, la glutammina è ampiamente utilizzata come principale combustibile metabolico per i reni e il sistema immunitario [10, 11]. Tuttavia, il suo meccanismo protettivo specifico è ancora in fase di studio.

È stato riportato che i microRNA (miRNA), una piccola molecola altamente conservata di 21-25 nucleotidi, sono associati all’I/R renale e all’AKI [12, 13]. I miRNA possono svolgere un ruolo protettivo nell'I/R renale attenuando l'risposta infiammatoria[14]. Sebbene siano stati scoperti gli effetti protettivi di alcuni miRNA sull’IRI renale, il meccanismo protettivo rimane poco chiaro.

Finora, pochi studi sono stati condotti sul meccanismo diprotezione renale mediata dalla glutamminaa livello dei miRNA. In questo studio, abbiamo applicato la tecnica di sequenziamento ad alto rendimento per analizzare l'espressione differenziale dei miRNA nell'I/R renale dopo l'intervento con glutammina. Abbiamo esplorato ulteriormente il meccanismo protettivo della glutammina contro l’I/R renale a livello di miRNA.

2. Materiali e metodi

2.1. Animale sperimentale.

Un totale di 72 ratti maschi Sprague Dawley (SD) SPF, del peso di 180-260 ge di età compresa tra 90 e 120 giorni, sono stati forniti dal Centro sperimentale per animali del primo ospedale affiliato dell'Università medica dello Xinjiang. I ratti sono stati tenuti in un ambiente a temperatura costante con una razione giornaliera sperimentale standardizzata senza controllare l’assunzione di acqua. +ey sono stati equamente randomizzati in tre gruppi: il gruppo fittizio, il gruppo I/R e il gruppo I/R + GLN. +e Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali nel +e Primo ospedale affiliato dell'Università medica dello Xinjiang.

2.2. Istituzione del modello animale.

I ratti SD sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital al 2% (40 mg/kg). Gruppo I/R: è stata praticata un'incisione addominale sulla linea mediana ed entrambi i reni sono stati esposti, il rene destro è stato resecato e l'arteria renale sinistra è stata clampata. Dopo 45 minuti la clamp vascolare è stata rimossa. +e il colore dei reni è passato dal rosso scuro al rosso vivo, suggerendo che il kinder ha subito un processo fisiopatologico I/R, i ratti sono stati osservati per 2 ore dopo la chiusura della cavità addominale. NS e glutammina (0,75 g/kg) sono stati, rispettivamente, iniettati utilizzando una micropompa dalla vena caudale a una velocità di 0,5 ml/min dopo il completamento della modellazione. Gruppo simulato: il rene destro è stato asportato allo stesso modo e il peduncolo renale sinistro non è stato clampato. La soluzione salina normale (NS) è stata iniettata utilizzando una micropompa dalla vena caudale a una velocità di 0,5 ml/min dopo il completamento della modellazione.

2.3. Raccolta e analisi dei campioni.

Sei ratti di ciascun gruppo sono stati selezionati casualmente in ciascun momento (1 ora, 5 ore, 12 ore e 24 ore dopo la modellazione) e quindi i ratti sono stati uccisi in anestesia. È stata esposta l'aorta addominale e il sangue venoso è stato raccolto con una siringa. Il siero veniva regolarmente separato e conservato in frigorifero a -80 gradi. +i reni sono stati rapidamente resecati e quindi un pezzo di tessuto è stato prelevato dai reni bilaterali per essere posto in formaldeide neutra al 10% e fissato durante la notte a 4 gradi. La creatinina sierica (SCr) e l'azoto ureico nel sangue (BUN) sono stati analizzati con un analizzatore biochimico automatico Beckman. Il blocco di paraffina è stato preparato da tessuto renale fissato mediante un processo di disidratazione, trasparenza, impregnazione di cera e inclusione di disidratazione. I blocchi di paraffina sono stati quindi tagliati in sezioni ed è stata eseguita la colorazione.

2.4. Analisi di sequenziamento ad alto rendimento.

L'RNA totale dei campioni di tessuto renale di ratto del gruppo I/R e del gruppo I/R + GLN è stato estratto e valutato per la qualità. Secondo il processo di costruzione della libreria di sequenziamento di piccoli RNA, l'RNA del tessuto renale totale purificato è stato trascritto al contrario in cDNA. +it, sono stati eseguiti l'amplificazione PCR, la purificazione e il rilevamento della qualità della libreria di cDNA per completare la costruzione della libreria di campioni di sequenziamento. Quindi, abbiamo ottenuto i dati del file FASTQ originale.

2.5. Analisi bioinformatica.

Clean reads were classified and annotated from the FASTQ file. +e Rfam database, species reference transcripts, and repetitive sequence database were used to analyze the known miRNA annotations, miRNA prediction, and miRNA quantification. +e differentially expressed miRNAs (DEmiRs) were analyzed using the DESeq R package with |log2FoldChange|>2 e P < 0.05. +e la previsione del gene bersaglio è stata eseguita utilizzando rispettivamente i database RAID e miRanda. È stata inoltre eseguita l'analisi di arricchimento dei percorsi Gene Ontology (GO) e KEGG per i geni target utilizzando il pacchetto ClusterProfiler R. P <0,05 è stato considerato un arricchimento significativo.

2.6. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR).

I campioni sono stati raccolti datessuti renali di ratto24 ore dopo la modellazione. È stato estratto l'RNA totale e i prodotti cDNA di tutti i miRNA sono stati ottenuti utilizzando il kit di sintesi del cDNA del primo filamento di miRNA (Shenggong, Shanghai, Cina). Il rilevamento quantitativo della fluorescenza è stato eseguito utilizzando un kit PCR quantitativo a fluorescenza di miRNA (Shenggong, Shanghai, Cina) con 3 primer specifici per miRNA (Tabella 1). +e il metodo di analisi quantitativa relativa (2−ΔΔCt) è stato utilizzato per calcolare l'espressione relativa del miRNA target in ciascun gruppo di campioni. +e l'espressione relativa di miRNA in ciascun gruppo è stata calcolata utilizzando l'espressione di U6 in ciascun campione di ciascun gruppo come riferimento.

2.7. Analisi statistica.

I dati sono stati analizzati da SPSS19.0. Tutti i dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (media ± DS). +e t-test è stato utilizzato per il confronto a coppie tra i gruppi. P < 0.05 indicava che la differenza era statisticamente significativa.

3. Risultati

3.1. Effetto della glutammina sulla funzione renale dei ratti dopo ischemia-riperfusione.

I livelli di SCr e BUN sono stati esaminati per la prima volta nei tre gruppi di ratti (Figure 1 (a) e 1 (b)). +e SCr e BUN hanno continuato ad aumentare da 1 a 24 ore, raggiungendo un picco a 24 ore nel gruppo I/R, che era significativamente più alto rispetto a quelli del gruppo fittizio (P < 0.{{11} }5). Nel gruppo I/R + GLN, i livelli di SCr e BUN sono aumentati da 1 ora a 12 ore, ma la tendenza all’aumento è stata più lenta rispetto a quella del gruppo I/R. I livelli di SCr e BUN in ogni momento erano inferiori a quelli del gruppo I/R (P < 0,05).

3.2. Cambiamenti istologici nei reni dei ratti.

Nel gruppo simulato, dopo 24 ore dall'intervento, l'osservazione microscopica ha rivelato che alcuni tubuli renali nell'area della corteccia erano dilatati e alcuni epiteli dei tubuli renali mostravano edema e degenerazione vacuolare e non vi era alcuna anomalia evidente nei glomeruli (Figura 2 (a )). Nel gruppo I/R, gli orli a spazzola dei tubuli renali nell'area corticale e nell'area di transizione corteccia-midollare sono scomparsi, un gran numero di cellule epiteliali del tubulo renale hanno mostrato edema e degenerazione vacuolare, mentre alcune di esse hanno mostrato cariopicnosi, colorazione rossa del citoplasma, necrosi della coagulazione, abscissione e formazione di gesso

Figura 1: Cambiamenti nei livelli di Scr (a) e BUN (b) dei ratti in diversi momenti in ciascun gruppo. ∗P < 0.05 rispetto al gruppo fittizio; #P < 0,05 rispetto al gruppo I/R

Figura 2: Cambiamenti istopatologici del rene di ratto rilevati dalla colorazione HE. (a) gruppo Sham, (b) gruppo I/R e (c) gruppo I/R + GLN. Barra: 200×.

(Figura 2(b)). Non vi era alcun segno di infiammazione nell'interstizio e non si osservava alcuna anomalia evidente nei glomeruli. Nel gruppo I/R + GLN, la struttura del glomerulo era normale al microscopio, alcune cellule epiteliali tubulari erano rigonfie e mostravano una degenerazione a palloncino, alcune cellule epiteliali tubulari erano ascisse, alcuni tubuli erano dilatati ed è stata trovata una piccola quantità di cast proteico (Figura 2(c)).

3.3. Identificazione dei miRNA differenzialmente espressi.

L'analisi statistica è stata eseguita sui miRNA differenzialmente espressi selezionati dal gruppo I/R e dal gruppo I/R + GLN. Rispetto al gruppo I/R + GLN, nel gruppo I/R sono stati selezionati un totale di 104 miRNA espressi in modo significativo in modo differenziale (Figura 3 (a)). Tra questi, 76 esprimevano miRNA sovraregolato e 28 esprimevano miRNA sottoregolato (Figura 3 (b)). Inoltre, RAID e Miranda sono stati utilizzati per eseguire la previsione del gene bersaglio per i miRNA espressi in modo significativo in modo differenziale. Abbiamo trovato 436 geni bersaglio di intersezione (Figura 3 (c)). +it, abbiamo costruito la rete regolatoria dei geni bersaglio dei miRNA (Figura S1). È importante sottolineare che abbiamo selezionato miR-132-5p, miR-205 e miR-615 sottoregolati nel gruppo I/R come miRNA chiave per ulteriori studi. Inoltre, c'erano 65 geni bersaglio per questi tre miRNA (Figura 3 (d)). In base ai risultati del rilevamento qRT-PCR nel tessuto renale, i livelli di espressione di miR-132-5p, miR-205 e miR-615 erano diminuiti nel gruppo I/R (Figura 4 ).

3.4. Funzioni biologiche dei geni bersaglio.

Per identificare i meccanismi molecolari alla base degli effetti terapeutici del GLN, abbiamo eseguito un'analisi di arricchimento per i geni bersaglio. Nei risultati di GO (Figura 5(a)), la trasduzione del segnale intracellulare, la regolazione della proliferazione delle cellule staminali e la risposta cellulare all'ipossia dei processi biologici (BP) sono stati arricchiti da geni bersaglio. Inoltre, la via di segnalazione Notch, la via di segnalazione PI3K-Akt e la via di segnalazione cGMP PKG delle vie KEGG sono state significativamente arricchite (Figura 5 (b)). È interessante notare che rno-miR-132-5p partecipa al percorso cGMP-PKG prendendo di mira Mylk.

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