Effetti antietà degli antociani di Ribes Meyeri sulle cellule staminali neurali e sui topi che invecchiano Parte 1

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Astratto:L'invecchiamento è associato a deterioramento neurologico e declino cognitivo. I flavonoidi sono molto promettenti nella ricerca anti-invecchiamento nei modelli murini. Gli antociani di Ribes Meyer sono ricchi di flavonoidi abbondanti, ma le loro attività biologiche anti-invecchiamento rimangono sconosciute. In questo studio, abbiamo preparato un estratto di antocianine di R. Meyer e ne abbiamo analizzato gli effetti sulla senescenza delle cellule staminali neurali (NSC) in vivo e in vitro. Abbiamo isolato le NSC di topo e utilizzato il kit di conteggio cellulare-8(CCK-8), il ciclo cellulare, le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e i metodi di immunofluorescenza per analizzare anche gli effetti anti-invecchiamento degli antociani di R. Meyer come naringenina (Nar), che l'analisi metabolica ha rivelato come un importante flavonoide negli antociani di R. Meyer. Sono stati utilizzati anche metodi di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) e test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per studiare i meccanismi specifici di Nar dell'anti-invecchiamento. Dopo il trattamento con antociani con R. Meyer, la proliferazione delle NSC è accelerata e le NSC avevano una diminuzione dei marcatori di senescenza e una ridotta espressione di P16ink4. Il trattamento con antociani di R. Meyer ha anche invertito la perdita neuronale dipendente dall'età in vivo e in vitro. Nar ha bloccato l'invecchiamento dell'mNSC in vitro e ha migliorato la memoria spaziale e le capacità cognitive nei topi che invecchiano attraverso la downregulation della proteina TNF plasmatica.bioflavonoidi degli agrumiQuesti risultati suggeriscono che gli antociani di R. Meyer aumentano la proliferazione del NSC e migliorano la neurogenesi con l'invecchiamento attraverso riduzioni indotte da Nar dei livelli di proteina TNF in vivo.

INTRODUZIONE

Ribes Meyer (noto anche come R. Meyer Maxim) appartiene alla famiglia delle Saxifragaceae [1, 2]. Le radici e le foglie di R. Meyer sono ricche di una classe di flavonoidi metaboliti secondari vegetali [1-6] con molteplici funzioni, inclusi effetti antinfiammatori e antitumorali [7-9]. Zhou et al. prima naringenina (Nar) isolata dagli antociani di R. Meyer [1]. Nar è il componente principale di R. sativum; tuttavia, l'attività biologica antietà degli antociani di Nar e R. Meyer rimane sconosciuta. L'esaurimento delle cellule staminali è un importante segno distintivo dell'invecchiamento [10]. Una perdita di cellule staminali neurali (NSC) dipendente dall'età è associata al declino cognitivo e le NSC sono coinvolte in malattie associate alla perdita di memoria [11, 12]. C'è un marcato calo del NSC e dei numeri neuronali nel cervello murino che invecchia [13].benefici del cynomoriumLe cause dell'invecchiamento nelle cellule staminali includono telomeri accorciati, aumento dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS), attivazione del marcatore di senescenza P16ink4a e arresto del ciclo cellulare [14-16]. Questi fattori alla fine portano a danni al sistema nervoso, disturbi metabolici e disfunzioni cognitive [17].

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Considerando che questi cambiamenti sono legati all'invecchiamento, le funzioni degli antociani di R. Meyer non sono state ben studiate. Di conseguenza, abbiamo studiato gli effetti degli antociani di R. Meyer sulle NSC nei topi anziani. I nostri risultati mostrano che gli antociani di R. Meyer migliorano il fenotipo invecchiato invertendo la senescenza degli NPC in vitro, nonché migliorando i livelli cognitivi e potenziando la proliferazione delle NSC e il numero neuronale nei topi che invecchiano. Abbiamo anche rivelato che il flavonoide Nar, che è arricchito tra gli antociani di R. Meyer, inverte l'invecchiamento nelle NSC e migliora i livelli cognitivi nei topi anziani inibendo la via di segnalazione del fattore di necrosi tumorale (TNF).

RISULTATI

Effetti degli antociani di R. Meyer sui cambiamenti legati all'età nelle multinazionali

Per determinare gli effetti degli antociani di R.Meyer sulla senescenza cellulare, abbiamo utilizzato NSC di 23- topi di un mese (23M-mNSC). Considerando che gli antociani di R. Meyer possono esercitare effetti citotossici o protettivi sulle cellule a seconda della loro concentrazione, abbiamo prima dovuto accertare una concentrazione sicura di antociani di R. Meyer per trattare i 23M-mNSC. La vitalità delle cellule trattate con gli antociani di R. Meyer è stata rilevata utilizzando un test del kit per il conteggio delle cellule-8 (CCK-8). A concentrazioni fino a 100 pg/mL,R. Il trattamento con antociani Meyer per 48 o 72 ore ha aumentato la vitalità delle cellule 23M-NSC (Figura 1A supplementare). L'accumulo di ROS durante l'invecchiamento gioca un ruolo importante nel danno mitocondriale [16,18]. Per determinare se gli antociani di R. Meyer possono sopprimere il danno ossidativo, abbiamo eseguito saggi ROS. Gli antociani di R. Meyer hanno inibito il danno ossidativo a una concentrazione di 100 pg/mL (Figura 1B supplementare). Rispetto ai controlli, abbiamo osservato cambiamenti marcati nella proliferazione e nei livelli di ROS nelle cellule trattate con antociani di R. Meyer, dimostrando che 100 pg/mL di antociani di R. Meyer stimolano la proliferazione di 23M-NSC e inibiscono il danno ossidativo. Per determinare gli effetti degli antociani di R. Meyer sulla formazione della neurosfera, abbiamo isolato le NSC dal cervello di topi di 3-settimana (3W-mNSCs) e 23-mesi (23M-mNSCs). Le NSC sono state sottocoltivate e trattate con 100 pg/mL di antociani di R. Meyer (Figura 1A). Rispetto alle 23M-mNSC, il numero di neurosfere nel gruppo 3W-NYC è stato aumentato e le forme delle neurosfere erano più uniformi e arrotondate, con un diametro aumentato di 20-50 μm (Figura 1B{{38} }D). Inoltre, le neurosfere derivate da 23M-mNSC dopo 5 giorni erano di dimensioni inferiori (20 um), e questo risultato era coerente con i risultati di studi precedenti [19,20]. Quando trattata con antociani di R. Meyer, la formazione della neurosfera è stata significativamente aumentata sia nei 3W-mNSCs che nei 23M-mNSCs (Figura 1E). La senescenza è strettamente correlata all'arresto del ciclo cellulare, all'accorciamento dei telomeri e all'aumentata espressione del gene della senescenza pl6mk4a. Le 23M-NSC trattate con antocianina R. Meyer avevano significativamente ridotta l'espressione del gene p16mk4a, un numero maggiore di cellule nella fase S e allungato i telomeri rispetto alle cellule non trattate (Figura 1F-1H). Inoltre, sappiamo che l'invecchiamento riduce la proliferazione delle NSC e riduce le loro capacità di differenziazione per la produzione neuronale [13,21]. Dopo la differenziazione dei 23M-mNSC, si è verificato un aumento significativo del numero di neuroni TuJ1-positivi dopo il trattamento con antociani di R. Meyer (Figura lI-1J), indicando che il trattamento con antociani di R. Meyer promuove il differenziazione delle NSC in neuroni. Questi risultati dimostrano che gli antociani di R. Meyer hanno un impatto positivo sulle NSC invecchiate in vitro.

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Il trattamento con antociani R. Meyer migliora l'apprendimento e le capacità di memoria dei topi che invecchiano

L'invecchiamento è associato al declino cognitivo [22,23]. Abbiamo quindi valutato gli effetti degli antociani di R. Meyer sulle capacità di apprendimento e memoria dei topi. Il test Morris Water Maze (MWM) ha rivelato che, quando i topi adulti C57BL/6 (12 mesi) sono stati somministrati 100 mg/kg di antocianine R. Meyer per 2 mesi, il tempo medio per raggiungere la piattaforma è stato ridotto rispetto ai controlli (Figura 2A). Abbiamo anche esaminato il tempo impiegato per raggiungere la piattaforma (Figura 2B). Il gruppo trattato con antociani R. Meyer ha impiegato molto meno tempo rispetto al gruppo di controllo, sebbene la velocità media non fosse significativamente diversa tra i due gruppi (Figura 2C), suggerendo che gli antociani R. Meyer hanno scarso effetto sulla capacità motoria dei topi. Inoltre, nel gruppo trattato, i topi hanno nuotato per una distanza significativamente più breve prima di raggiungere l'area della piattaforma rispetto al gruppo non trattato (Figura 2D). Questi risultati dimostrano che gli antociani di R. Meyer possono migliorare le capacità di memoria cognitiva e spaziale dei topi che invecchiano.giacinto del desertoIl declino cognitivo associato all'invecchiamento è stato collegato a un numero ridotto di NSC [11, 24]. Di conseguenza, abbiamo isolato e coltivato NSC dal cervello del topo e (SVZ) dopo la somministrazione intragastrica subventricolare z ZONE di 100 mg/kg di antocianine R. Meyer (Figura 2E). Il numero risultante di neurosfere è stato misurato e c'erano significativamente più neurosfere nel gruppo trattato con antocianina R. Meyer rispetto al gruppo di controllo (Figura 2F). Successivamente, abbiamo analizzato la distribuzione delle dimensioni della neurosfera. R. Le neurosfere di topo trattate con antociani Meyer erano principalmente nella gamma di dimensioni superiori (50-100 um diametro),

Figura 1. Gli antociani di Ribes Meyer salvano il fenotipo della senescenza delle cellule staminali neurali del topo (MNC). (A) Neurosfere derivate clonalmente da cervelli di topo di 23-mesi (23M-NSC) e 3-di una settimana (3W-NSC) e trattate con 100 pg/mL R, ogni antocianina. (B) Differenze nei numeri delle neurosfere tra 23M-NSC e 3W-NSC. (C) La forma delle neurosfere 3W-NSC era più uniforme, con un numero e una dimensione maggiori (20-50 um) rispetto alle neurosfere 23M-NSC . (DE) Il trattamento con R. ogni antocianina ha aumentato il numero di neurosfere derivate da 3W-NSC e 23M-NSC rispetto ai controlli. (FH) In 23M-NSC trattati con 100 pg/mL di antociani di R. Meyer per 48 ore, sono state misurate l'espressione dell'mRNA di p16ink4a, il ciclo cellulare e le lunghezze relative dei telomeri. (F) Espressione di mRNA del marcatore di senescenza cellulare p16ink4a rilevata da qRT-PCR. (G) I cicli cellulari sono stati determinati mediante citometria a flusso. (H) rilevamento qRT-PCR della lunghezza relativa dei telomeri. (I) Colorazione immunofluorescenza di TuJ1 e GFAP in 23M-NSC trattati con R.metodo di estrazione dei flavonoidi pdfAntociani Meyer e controllo. (J) Quantificazione di (I). I dati sono presentati come media ± DS di tre esperimenti indipendenti. *P<0.05,><0.01, and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="" cells.="" whereas="" control="" neurospheres="" were="" more="" common="" in="" the="" lower="" range="" （20-50="" μm="" diameter）（figure="">

Per verificare ulteriormente l'influenza del trattamento con antocianine di R. Meyer su NSC e neuroni in vivo, è stata eseguita la colorazione con immunofluorescenza dell'ippocampo e sono state analizzate le percentuali di cellule immunopositive. Utilizzando i noti marcatori NSC nestin e Ki67 [25, 26], abbiamo rivelato un aumento delle cellule positive alla nestina e al Ki67- nella regione dell'ippocampo (Figura supplementare 2A, 2B) di R. Meyer trattate con antociani topi. Inoltre, in questi topi è stato aumentato anche il numero di cellule TuJ1- positive (un marker di neuroni maturi) (Figura 2C, 2D supplementare).flavonoidiInsieme, questi risultati indicano che 100 mg/kg di antociani di R. Meyer possono migliorare la memoria spaziale e le capacità cognitive nei topi che invecchiano promuovendo la proliferazione delle NSC e aumentando il numero di neuroni.

Questo articolo è tratto da www.aging-us.com AGING 2020, vol. 12, n. 17

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