L'impalcatura anti-invecchiamento attivata dal gene Klotho promuove la risposta rigenerativa alla guarigione delle ferite nelle cellule staminali derivate dall'adipe umano

Parole chiave:anti età; -Cloto; impalcatura attivata dal gene; cellule staminali di derivazione adiposa; angiogenesi;deposizione di matrici;guarigione ringiovanente

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1. Introduzione

La guarigione delle ferite è un processo biologico complesso che richiede una stretta orchestrazione di molteplici eventi cellulari.1]. Tuttavia, nella popolazione che invecchia, gli eventi cellulari vengono interrotti, portando a una guarigione ritardata.2]. L'interruzione dei meccanismi di guarigione deriva in parte dal ridotto homing delle cellule progenitrici dal midollo osseo e da altre malattie metaboliche prevalenti come il diabete.3,4]. Nella gestione delle ferite, l'applicazione di scaffold biomateriali sta diventando sempre più comune come trattamento. Scaffold biomaterialiproteggere la ferita dall'infezione, assorbire gli essudati della ferita e mantenere la ferita umida per prevenire la necrosi dei tessuti [5]. Le terapie possono anche essere caricate su scaffold di biomateriali e promuovere una guarigione più rapida nelle ferite difficili da guarire.1]. Tuttavia, gli scaffold biomateriali da soli potrebbero non orchestrare efficacemente le molteplici cascate di segnalazione che si verificano all'interno della ferita. La somministrazione di cellule staminali è talvolta proposta come soluzione per moderare i complessi eventi di segnalazione nella ferita [6]. 

Le cellule staminali secernono fattori paracrini e possono differenziarsi in cellule di più lignaggi tissutali.7]. Le cellule staminali sono tipicamente consegnate nella ferita attraverso iniezioni intradermiche.6], irrorazione topica [8], o come innesti di ingegneria tessutale [9]. Negli ultimi anni, l'applicazione di innesti di ingegneria tissutale per la guarigione delle ferite croniche ha gradualmente ottenuto un'accettazione più ampia grazie alla loro capacità di guarire rapidamente le ferite.9–11]. Apligraf® e Dermagraft® sono due dei costrutti di bioingegneria approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) ampiamente utilizzati per il trattamento delle ferite croniche [12,13]. Tuttavia, la generazione di questi innesti richiede una coltura cellulare prolungata per produrre un numero elevato di cellule.14]. Quando si utilizzano cellule staminali, la coltura prolungata può aumentare la senescenza cellulare e diminuire la staminalità delle cellule staminali [15,16]. Pertanto, il mantenimento della staminalità delle cellule staminali è fondamentale per ottenere la risposta terapeutica ottimale. La consegna di geni terapeutici alle cellule staminali utilizzando vettori non virali è una potenziale strategia per migliorare la funzionalità delle cellule staminali.17]. Tradizionalmente, le cellule vengono trasfettate in colture 2D e successivamente trapiantate in vivo.18]. Tuttavia, piattaforme come gli scaffold attivati ​​dai geni, costituiti da scaffold di biomateriali funzionalizzati con nanoparticelle che trasportano il transgene terapeutico [19], che il nostro gruppo è stato pioniere, offre una soluzione alternativa per trasfettare le cellule all'interno di un ambiente 3-D. Questo studio si è concentrato sullo sviluppo di una versione attivata dal gene dell'impalcatura 3D di collagene-condroitin solfato (coll-CS) che ha un enorme potenziale di traduzione clinica, poiché la sua composizione è simile a quella del Dermal Regeneration Template (DRT) di Integra, un modello clinicamente approvato impalcatura per la guarigione delle ferite croniche [20]. Utilizziamo principalmente un polimero cationico chiamato polietileneimmina (PEI) per condensare i plasmidi di DNA che codificano per i geni del fattore di crescita come il fattore di derivazione stromale-1 alfa e il fattore di crescita nervoso e li assembliamo in nanoparticelle cariche [21–23]. Queste nanoparticelle cariche vengono quindi caricate a bagno nella nostra impalcatura coll-CS per generare le impalcature attivate dal gene. I nostri studi precedenti hanno anche dimostrato che l'impalcatura attivata dal gene basata su PEI può causare una sovraespressione transitoria del transgene terapeutico in una gamma di cellule di guarigione delle ferite e promuovere le loro capacità rigenerative.21,24,25]. Tradizionalmente, lo scaffold attivato dal gene è stato sviluppato per colpire le cellule ospiti e promuovere la riparazione locale.26]. Tuttavia, prove emergenti indicano che gli scaffold attivati ​​da geni carichi di cellule hanno una potenza superiore nel rigenerare strutture tissutali complesse rispetto agli scaffold attivati ​​da geni da soli.27]. 

L'abbondanza cellulare è uno dei requisiti cruciali per la generazione di innesti di ingegneria tessutale.28]. Il tessuto adiposo è una ricca fonte che può fornire un gran numero di cellule staminali. Il tessuto adiposo contiene fino a 500 volte le cellule staminali per la stessa massa di midollo osseo, una fonte di tessuto tradizionale per l'estrazione di cellule staminali.29]. Inoltre, le cellule staminali possono essere estratte dal tessuto adiposo mediante un processo di liposuzione minimamente invasivo.29]. Il nostro recente studio ha scoperto che le cellule staminali derivate da tessuto adiposo umano (ADSC) dimostrano un'eccellente biocompatibilità con l'impalcatura coll-CS. L'uso di un'impalcatura attivata da gene pro-angiogenico ha ulteriormente migliorato le risposte rigenerative delle ADSC [30]. Tuttavia, le ADSC tendono a perdere la loro radice quando si espandono [31]. In precedenza, abbiamo scoperto che una proteina anti-invecchiamento -Klotho potrebbe migliorare significativamente la proliferazione di ADSC umane sane e diabetiche [32]. La maggior parte degli studi generalmente utilizza la variante primaria -Cloto [33–35] e hanno dimostrato che la proteina può aumentare la durata della vita delle ADSC attivando l'attività trascrizionale della telomerasi [33]. È stato anche scoperto che le MSC con sovraespressione di Klotho esercitano forti effetti antifibrotici nel danno renale attraverso l'inibizione di Wnt/ -catenina segnalazione [36]. Tuttavia, il ruolo di -Klotho nelle cellule staminali rimane relativamente inesplorato.

Oltre alla differenza nel focus della ricerca tra il - E -Klotho, l'antietàLe proteine ​​Klotho non sono state ancora completamente incorporate nelle strategie di ingegneria tissutaleper la guarigione delle ferite. Pertanto, in questo studio, abbiamo cercato di studiare l'impatto funzionale di a - Impalcatura attivata dal gene Klotho su ADSC umane per applicazioni di guarigione delle ferite. Noiha studiato per la prima volta le attività trascrizionali dei classici fattori di pluripotenza (ottobre-4,Nanog e Sox-2), marker di proliferazione (Ki-67) e regolatori della guarigione delle ferite (TGF- 3 e TGF- 1) negli ADSC. Abbiamo quindi valutato la bioattività dei mezzi condizionatigenerato dall'impalcatura attivata dal gene carico di ADSC per valutarne il potenziale paracrino.Infine, abbiamo esaminato la rigenerazione della membrana basale (fibronectina, laminina,e collagene IV) e proteine ​​associate alla cicatrice ( -SMA ed elastina) nelle ADSC carichescaffold attivato dal gene per valutare la maturazione controllata dei tessuti.

2. Risultati

2.1. -L'impalcatura attivata dal gene Klotho migliora transitoriamente lo stelo e i geni pro-riparativi delle ADSC umane

L'analisi dell'espressione genica ha mostrato per la prima volta che gli ADSC sullo scaffold attivato dal gene sovraesprimevano il -Gene Klotho su 172-fold (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1UN). Questa scoperta ha confermato l'interazione efficiente delle ADSC con lo scaffold attivato dal gene. L'analisi del marcatore di proliferazione Ki-67 ha ulteriormente confermato che anche le ADSC sullo scaffold attivato dal gene hanno mantenuto una robusta capacità proliferativa per 14 giorni (Figura1UN). Avendo confermato la sovraespressione dell'anti-invecchiamento -Klotho, abbiamo poi valutato il ringiovanimento delle cellule staminali attraverso l'attivazione di fattori di "pluripotenza" nelle ADSC. Nel complesso, abbiamo notato una regolazione transitoria di tutti e tre i fattori di trascrizione nei 14 giorni (Figura1B). Tuttavia, le ADSC hanno mostrato solo un aumento significativo nell'espressione del gene Oct-4 che è stato mantenuto fino al giorno 14. Nello specifico, le ADSC hanno mostrato una 2.5-volte (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). I livelli del TGF profibrotico 1 gene nel -Gli ADSC con sovraespressione di Klotho sono risultati pari a quelli del gruppo scaffold privo di geni nei 14 giorni. Tuttavia, i livelli di antifibrotico TGF- 3 erano significativamente (3.6-volte,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. - Impalcatura attivata dal gene Klotho

Migliora la potenza paracrina delle ADSC umane2.2.1. Bioattività pro-angiogenica Il test di bioattività del CM generato dall'impalcatura attivata dal gene carico di ADSC ha dimostrato innanzitutto che potrebbe controllare temporaneamente l'attività metabolica negli HUVEC. Il giorno 3 CM ha migliorato significativamente l'attività metabolica negli HUVEC, mentre l'uso di CM invecchiato dal giorno 14 ha ridotto significativamente l'attività metabolica dell'HUVEC (Figura2UN). Dopo aver osservato ciò, abbiamo quindi testato l'impatto pro-angiogenico del CM dal giorno 3 e 14 sugli HUVEC seminati su Matrigel. Come anticipato, il giorno 3 CM dal gruppo dell'impalcatura attivato dal gene significativamente (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Tuttavia, non si è verificato alcun ulteriore aumento dell'attività angiogenica con il giorno 14 CM rispetto a quello del giorno 3 CM. Inoltre, il giorno 14 CM di entrambi i gruppi ha mostrato un'efficienza pro-angiogenica simile (Figura2C). Collettivamente, la nostra scoperta indica che l'impalcatura attivata dal gene accelera transitoriamente la risposta pro-angiogenica delle ADSC.

pro-fibrotico TGF- 1. ** e * indicap < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± deviazione standard (n = 3).

Figura 2. Bioattività paracrina pro-angiogenica dell'impalcatura CM attivata dal gene carico di ADSC. (A) Il CM prodotto dall'impalcatura attivata dal gene carico di ADSC nei 14 giorni ha dimostrato la capacità di controllare temporaneamente l'attività metabolica degli HUVEC. (B) Day 3 CM dal gruppo scaffold attivato dal gene ha migliorato significativamente la formazione del tubulo endoteliale e la sua ramificazione rispetto a quella del gruppo scaffold senza gene. (C) Formazione del tubulo e ramificazione delle cellule endoteliali 6hpost-esposizione a CM dagli ADSC impalcatura geneticamente attivata e priva di geni, * indica p < 0.05. I dati rappresentano la media! deviazione standard (n=3)

2.2.2. Guarigione e maturazione dei fibroblasti dermici

Uno dei risultati dello studio sull'angiogenesi è che quando l'impalcatura attivata dal gene carico di ADSC matura, non promuove più l'angiogenesi. Inoltre, il giorno 14 la loro potenza angiogenica era simile a quella del gruppo scaffold privo di geni (Figura 2B, C). Pertanto, abbiamo studiato l'influenza del giorno 14 invecchiato CM sulla chiusura della ferita del fibroblasto dermico. Analogamente al risultato dello studio sull'angiogenesi, entrambi i gruppi hanno dimostrato livelli simili di chiusura della ferita dei fibroblasti con il giorno 14 CM. Nello specifico, entrambi i gruppi hanno guarito la ferita di circa il 40% in 12 ore (Figura 3A). Questa scoperta ha rivelato che durante la maturazione, il gruppo dell'impalcatura attivato dal gene supporta ma non promuove la chiusura della ferita del fibroblasto dermico.

Tuttavia, poiché i fibroblasti sono stati stimolati con CM invecchiato, abbiamo studiato se le influenze dell'espressione delle proteine ​​della matrice coinvolte nella maturazione della ferita. Come anticipato, i fibroblasti dermici stimolati con CM dal gruppo scaffold privo di geni esprimevano abbondantemente la proteina collagene I pro-fibrotica (Figura 3B). Al contrario, i fibroblasti stimolati con CM dal gruppo scaffold attivato dal gene hanno dimostrato un'espressione inferiore del 50 percento (p <0,05) della proteina collagene I. Nel frattempo, entrambi i gruppi mancavano dell'espressione del collagene antifibrotico e non sono state osservate differenze tra i due gruppi. Presi insieme, implica che l'impalcatura attivata dal gene migliora la risposta modulatoria della ferita ADSC durante la maturazione.

Figura 3. Influenza paracrina sulla guarigione e maturazione del derma. (A) CM di età pari a 14 giorni di entrambi i gruppi ha esercitato livelli simili di attività di chiusura della ferita nei fibroblasti dermici adulti umani di circa il 4 0 percento in 12 ore. (B) CM dall'impalcatura attivata dal gene ha ridotto significativamente l'espressione di collagene profibrotico nei fibroblasti. " indica p < 0,05 I dati rappresentano la media=deviazione standard (n=3). Nella Figura 3B, GAS e GFS rappresentano rispettivamente l'impalcatura attivata dal gene e l'impalcatura senza gene

2.3. L'impalcatura attivata dal gene B-Klotho migliora la rigenerazione della membrana basale con una migliore risposta anti-fibrotica nelle ADSC umane

Dopo aver osservato la stimolazione controllata dell'impalcatura attivata dal gene della funzionalità delle ADSC, abbiamo infine studiato la risposta delle ADSC verso la rigenerazione delle matrici e delle proteine ​​dermiche. L'impalcatura attivata dal gene ha notevolmente potenziato la rigenerazione della membrana basale delle ADSC. In particolare, l'impalcatura attivata dal gene ha promosso in modo significativo la deposizione dei componenti della membrana basale laminina e collagene IVFigura 4A). Dopo l'analisi semi-quantitativa, abbiamo anche notato che la deposizione della matrice ha seguito una tendenza relativa al gruppo scaffold privo di geni. La tendenza osservata era fibronectina (1.0- volte) < laminina (2.1- volte, p < {{10}}.05) < collagene IV (8.8- volte, p < 0,01). Una volta determinata la capacità di rigenerare la membrana basale, abbiamo quindi valutato l'espressione di proteine ​​cruciali per una guarigione qualitativa superiore, come la riduzione delle cicatrici. Gli ADSC sullo scaffold attivato dal gene hanno dimostrato un'espressione significativamente ridotta (p <0,05) della proteina contrattile associata alla cicatrice a-SMA. L'espressione a-SMA negli ADSC era inferiore del 50 percento rispetto al gruppo scaffold privo di geni (Figura 4B). Infine, dopo aver osservato la ridotta espressione di a-SMA, abbiamo valutato l'espressione della proteina della matrice elastica elastina. Gli ADSC sullo scaffold attivato dal gene hanno dimostrato un'espressione di elastina qualitativa relativamente superiore attraverso la deposizione di una rete fibrosa matura di elastina rispetto agli ADSC sullo scaffold privo di geni (Figura 4B).

Figura 4. Deposizione di proteine ​​della matrice pro-guarigione da parte delle ADSC nell'impalcatura attivata dal gene il giorno 14. (A) Le ADSC nell'impalcatura attivata dal gene hanno dimostrato una rigenerazione significativa. funzionamento della membrana basale rispetto alle ADSC nello scaffold privo di geni. Le ADSC depositavano prevalentemente una rete relativamente matura di proteine ​​del collagene IV, seguite da laminina e fibronectina.(B) Le ADSC nello scaffold attivato dal gene esprimevano anche 2- volte meno della proteina SMA rispetto alle ADSC nel gene -impalcatura gratuita. In abbinamento al seminterrato mem. rigenerazione della brana, le ADSC nell'impalcatura attivata dal gene hanno depositato una matrice elastica qualitativamente migliore. Tutte le immagini sono state catturate attraverso un obiettivo 20x utilizzando un microscopio Olympus IX73* e * indica rispettivamente p < 0.01 e p < 0.05. Barra della scala 50um. I dati rappresentano la deviazione standard media (n=3).-SMA e fibronectina erano doppiamente immunocolorate.

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