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Attività antinocicettiva di Cistanche salsa stolons, in crescita nella Repubblica del Kazakistan

Elmira B. Kartbaevaa, et al

ASTRATTO

ErbaCistanche(specie Cistanche) nella Medicina Tradizionale Cinese è usato per il trattamento di diverse malattie e sintomi, compreso il dolore. L'obiettivo di questo studio era di valutare l'effetto antinocicettivo dell'idroetanolicoestratto diCistanchesalsa(CAMey.) Beck, Orobanchaceae, stoloni in modelli animali del dolore. La composizione chimica diErbaCistancheè stato analizzato mediante HPLC-UV. I topi Swiss Webster (25–30 g, n=6) sono stati pretrattati per via oraleErbaCistanche(10, 30 o 100 mg/kg) e valutati nel test della formalina e nella risposta alla leccatura indotta da capsaicina o glutammato. kazakoErba Cistancheè composto principalmente da glicosidi fenilpropanoidi, da cuiechinacoside, acteoside, etubulosideB sono i costituenti principali. quandoErbaCistancheè stato somministrato ai topi ha avuto un effetto in entrambe le fasi del test della formalina (77% di attività a 30 mg/kg per la fase 1 e 62% di attività a 100 mg/kg per la fase2) suggerendo proprietà analgesiche e antinfiammatorie. kazakoErbaCistancheè stato in grado di ridurre il tempo di leccamento degli animali dopo l'iniezione di glutammato (riduzione dell'81% a 30 mg/kg) e capsaicina (riduzione dell'81% a 100 mg/kg). Concludiamo che i fenolici presenti nell'estratto idroetanolico di C. salsa potrebbero essere responsabili del suo profilo farmacologico. Al fine di reperire una materia prima di buona qualità per la medicina tradizionale cinese, abbiamo raccomandato di standardizzare l'utilizzo di questa specie kazakaechinacoside e acteosidecome marcatori.

Parole chiave:Herba Cistanche,HPLC-UV,Echinacoside, Acteoside, Tubuloside, Standardizzazione

introduzione

Cistanchesalsa(CA Mey) Beck, Orobanchaceae, è una pianta parassita della Repubblica del Kazakistan dove viene utilizzata come materia prima industriale (Sarsenbayev et al., 2011; Grudzinskaya e Gemedzhieva, 2012). Il valore scientifico di questa erba nella medicina tradizionale cinese riguarda il trattamento di problemi renali (che variano dal dolore all'insufficienza), impotenza, infertilità femminile, leucorrea morbosa, metrorragia abbondante e costipazione senile (Jiangsu New Medical College Dictionary of Traditional ChineseDrugs, 1977; erbe medicinali cinesi, 1988). La composizione chimica degli stoloni di altre specie diCistancheè già stato studiato in dettaglio da scienziati cinesi. Sono stati identificati i seguenti composti fenolici:echinacoside, tubuloside, acteoside, oltre a lignani, iridoidi e un polisaccaride complesso (Yong andTu, 2009; Zhang et al., 2003; Xie et al., 2005; Jiang et al., 2009; Suiet al., 2011; Liu et al., 2013; Zhou et al., 2014).

Shimoda et al. (2009) hanno mostrato che questa erba possiede un effetto ipocolesterolemico mentre Yang et al. (2013) ne hanno determinato l'attività epatoprotettiva. Nan et al. (2013) hanno riportato l'attività antinfiammatoria dei suoi estratti. Un polisaccaride complesso precedentemente isolato da questa pianta ha mostrato effetti immunomodulatori (Wang et al., 2009).

Anche se c'è una quantità considerevole diCistanchestoloni nella Repubblica del Kazakistan, non c'è un uso popolare per questa pianta da parte della popolazione kazaka sebbene i vicini in Cina la utilizzino ampiamente. A causa del fatto che oggi esiste un notevole problema in relazione alla sostituzione/adulterazione di piante medicinali e alla crescente necessità di standardizzare i medicinali per l'uso nella Medicina Tradizionale Cinese, questo studio è stato progettato per accertare la composizione chimica fenolica di questa materia prima vegetale che cresce nel vicino Kazakistan oltre a valutarne l'uso come antinocicettivo per alleviare potenzialmente il dolore, che caratterizza uno dei suoi principali utilizzi nella Medicina Tradizionale Cinese.

Materiali e metodi

Materiale vegetale

Cistanchesalsa (CAMey.) Beck, Orobanchaceae, stoloni sono stati raccolti nel deserto di Moinkum, villaggio di Bakanas, nel luglio 2014 ad Almaty. Il materiale vegetale è stato identificato dal Dr. G. Sitpayeva dall'Istituto di botanica e fitointroduzione, Ministero dell'Istruzione e delle Scienze della Repubblica del Kazakistan, dove è stato depositato con il numero 01-04/306.

Analisi chimica

Stoloni di C. salsa (2 g) sono stati sottoposti ad estrazione a microonde. Inizialmente, il materiale è stato macinato a 0.001–2.000 mm e quindi collocato in un recipiente ermetico per essere estratto per 10 min at100–1100 ◦C con etanolo all'80 percento (rapporto 1:10). L'estratto idroetanolico (CSHE) è stato analizzato mediante HPLC-MS. L'estratto grezzo è stato sciolto in metanolo (9,6 mg/ml) e filtrato attraverso una membrana di teflon da 0,45 mm prima dell'analisi. Un cromatografo liquido modello HP 1100 Series (società Agilent Technologies, Inc., CA, USA), dotato di un degasatore sottovuoto fluido, una pompa a gradiente a bassa pressione a quattro canali e un iniettore automatico. I composti fenolici sono stati separati cromatograficamente mediante una colonna Zorbax Eclipse XDB-C18, 2,1 × 50 mm, riempita con polimero di gel di silice di ottadecilsilil (1,8). L'analisi cromatografica è stata eseguita con un flusso di fase mobile di 0,2 ml/min, pressione di esercizio dell'eluente di 175–200 kPa, temperatura del forno della colonna di 30 ◦C, volume del campione di 2 ml, modalità di alimentazione dell'eluente a gradiente: 0–36 min 10 percento A – 90 percento B;36 min – 100 percento di B (eluente A: metanolo, eluente B: soluzione di acido formico allo 0,2 percento). Il rilevamento è stato eseguito mediante UV alle lunghezze d'onda di 254, 334, 350, 410, 450 e 550 nm. Il confronto dei tempi di ritenzione, degli spettri UV e di massa ottenuti con quelli dei composti di riferimento è stato utilizzato per l'identificazione dei composti chimici nell'estratto. L'analisi quantitativa è stata eseguita mediante l'uso di standardverbascosideeechinacosideanalizzato nelle stesse condizioni cromatografiche. Le loro curve di calibrazione hanno consentito il calcolo della quantità di ogni altro glicoside fenilpropanoide nell'estratto di etanolo di questa pianta. Il metodo non è stato convalidato.

Animali

In questo studio sono stati utilizzati topi Swiss Webster (20–25 g, due mesi) (donati da Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ, Brazil). Gli animali sono stati tenuti in condizioni standard (ciclo luce-buio di 12 ore, 22 ± 2 gradi e 70-80 percento di umidità. Cibo e acqua ad libitum). Gli animali hanno ricevuto solo acqua per evitare l'interferenza del cibo con l'assorbimento della sostanza 12 h prima dell'inizio degli esperimenti. L'acclimatazione alle condizioni di laboratorio è avvenuta per almeno 1 ora prima di ogni test. Tutti i protocolli sono stati condotti in conformità con le Linee guida sugli standard etici per l'indagine sul dolore sperimentale negli animali e hanno seguito i principi e le linee guida adottati dal Consiglio nazionale per il controllo della sperimentazione animale (CONCEA), approvati dall'Istituto di scienze biomediche/UFRJ, Ethical Committee for Animal Research e ha ricevuto il numero DFBCICB015-04/16. Tutti i protocolli sperimentali sono stati eseguiti durante la fase leggera. Il numero di animali per gruppo è stato mantenuto al minimo e secondo le regole di CONCEA. Alla fine di ogni esperimento, i topi sono stati uccisi da un sovradosaggio di ketamina/xilazina.

Trattamenti

In questo studio, CSHE è stato valutato a 10, 30 e 100 mg/kg. L'estratto è stato sciolto in dimetilsolfossido (DMSO, FisherBiotech) per preparare una soluzione madre a 100 mg/ml. PBS è stato utilizzato come diluente per la preparazione delle diverse dosi. Soluzioni contenenti 10, 30 e 100 mg/kg dell'estratto di idroetanoloCistanchesalsaErano preparati. I farmaci standard utilizzati erano morfina 2,5 mg/kg (Merck, diluita in tampone fosfato salino (PBS)), acido acetilsalicilico 200 mg/kg (Sigma Aldrich, sciolto con 5 M di idrossido di sodio (NaOH) in 0,9 percentuale salina) e capsazepina 10 nMolper zampa. Al gruppo di controllo negativo è stata somministrata soluzione salina più DMSO (alla stessa concentrazione del trattamento più elevato con estratto). Tutti i trattamenti (estratto testato e standard) sono stati somministrati per via orale. L'unica eccezione era la capsazepina che veniva somministrata per iniezione intraplantare.

Dolore acuto indotto da formalina

Una soluzione al 2,5% di formalina (37% di formaldeide) è stata iniettata (20 ul) nella regione plantare della zampa posteriore destra dei topi 60 minuti dopo il trattamento (estratto di idroetanolo diCistanchesalsao acido acetilsalicilico 200 mg/kg o morfina 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Gli animali sono stati collocati individualmente in una camera di vetro trasparente e la durata del tempo in secondi che hanno trascorso a leccarsi la zampa dopo l'iniezione di formalina è stata registrata e analizzata in due periodi separati, dolore neurogeno in fase iniziale (0-5 minuti dopo l'iniezione) e fase tardiva- dolore infiammatorio (15-30 minuti dopo l'iniezione).

Nocicezione indotta dalla capsaicina

Questo test si basava sul metodo descritto da Sakurada et al. con alcune modifiche (Sakurada et al., 1992). La capsaicina (20 ul)C18H27NO3 (Galena, Campinas, SP) è stata iniettata nella regione plantare della zampa posteriore destra dei topi (1,6 ug/zampa) un'ora dopo il trattamento (estratto di idroetanolo diCistanchesalsa o capsazepina10 nMol/zampa). Gli animali sono stati posti individualmente in una camera di vetro e la durata (s) di leccarsi le zampe è stata registrata tra 0 e 5 minuti dopo l'iniezione di capsaicina e quindi analizzata.

Nocicezione indotta dal glutammato

Nel metodo descritto da Beirith et al. (2002), soluzione di glutammato in PBS (20 ul)(acido l-glutammico, Sigma–Aldrich, 3,7 ng/zampa) è stata iniettata nella regione plantare della zampa posteriore destra dei topi un'ora dopo il trattamento (estratto di idroetanolo diCistanchesalsa o morfina 2,5 mg/kg). Gli animali sono stati posti individualmente in una camera di vetro e la durata del leccamento delle zampe (secondi) è stata registrata tra 0 e 15 minuti dopo l'iniezione di glutammato e quindi analizzata.

analisi statistica

I dati chimici sono presentati come media ± DS di cinque esperimenti. Tutti i gruppi sperimentali farmacologici erano costituiti da un minimo di sei topi. L'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dal test di Dunnett ha consentito la visualizzazione della significatività statistica tra i gruppi utilizzando il software GraphPad Prism 5.0. i valori p sono stati considerati significativi quando erano inferiori a 0.05(p <>

Risultati

CistancheIl cromatogramma dell'estratto di salsa idroetanolo (due diverse diluizioni) è mostrato in Fig. 1. La tabella 1 mostra la determinazione dei composti fenolici insieme ai rispettivi tempi di ritenzione nel cromatogramma.

Effetto di CSHE sul dolore acuto indotto da formalina

Nel test del dolore acuto indotto da formalina, il CSHE a 10, 30 e 100 mg/kg è stato in grado di ridurre il leccarsi le zampe nella prima fase del test nota come fase del dolore neurogeno, queste riduzioni sono state rispettivamente del 60, 77 e 58 percento. . Inoltre, sono risultati efficaci anche nel ridurre il dolore infiammatorio indotto durante la seconda fase del test, la percentuale di inibizione del dolore infiammatorio è stata rispettivamente del 42, 46 e 62 per cento (Fig. 2). La morfina (2,5 mg/kg) e l'acido acetilsalicilico (200 mg/kg) hanno presentato i seguenti risultati: 55%/33% e 31%/54% rispettivamente per la prima e la seconda fase.

Effetto di CSHE sulla nocicezione indotta dal glutammato

Il CSHE ha ridotto il leccamento indotto dal glutammato alle tre dosi testate, 10, 30 e 100 mg/kg rispettivamente del 76, 81 e 53 percento (Fig. 3). La morfina al 2,5% ha comportato una riduzione del 76%.

Effetto di CSHE sulla nocicezione indotta da capsaicina

Per verificare se il CSHE potesse influenzare la nocicezione attraverso i recettori TRPV1, è stato testato in un modello di dolore indotto dalla capsaicina. L'effetto antinocicettivo attraverso questo modello è stato osservato per il CSHE nelle tre dosi testate, rispettivamente del 76, 79 e 81 percento (Fig. 4). La capsazepina 10 nMol/zampa ha comportato una riduzione del 60%.

Discussione

Un totale di dieci glucosidi fenilpropanoidi sono stati identificati nell'estratto di idroetanolo di C. salsa (che cresce in Kazakistan).Echinacoside(10,98 mg/g),acteoside(9,44 mg/g) e tubuloside B (7,94 mg/g) sono stati i principali composti identificati. I dati ottenuti sono stati correlati con la letteratura disponibile per specie diCistanchecresce in diverse regioni dell'Asia (Zhou et al., 2014; Xieet al., 2005; Jiang et al., 2009).Echinacosideeacteosidesono i componenti principali, che costituiscono la base per la standardizzazione delle specie officinaliCistanchedeserticola eCistanchetubulosa, elencata nella Farmacopea cinese nel 2005. Proponiamo che questi composti possano essere utilizzati anche per la standardizzazione diCistanchestoloni di salsa dal Kazakistan, in quanto sono i principali nell'estratto di idroetanolo studiato.

Secondo i risultati farmacologici di questo studio, è possibile suggerire che il CSHE sia un agente efficace contro il dolore neurogenico e l'infiammazione come osservato nel test della formalina. Al meglio delle nostre conoscenze,Cistanchela salsa non è mai stata testata in relazione alle sue azioni antinocicettive. Uno studio del 2002 conCistanchedeserticola (Lin et al., 2002) ha dimostrato che questa pianta presentava attività antinocicettive e antinfiammatorie quando saggiata in modelli come contorsioni totali, formalina ed edema della zampa. Sebbene non vi fosse alcun tentativo di indagare sui costituenti principali degli estratti che erano attivi, consideravano l'estratto di butanolo e lo strato d'acqua come attivi. Non sorprende che questi solventi siano alla scala di polarità che corrisponde ai glicosidi fenilpropanoidi che si trovano inCistanchesalsa. Inoltre, Lin e collaboratori hanno stabilito che l'azione antinocicettiva diCistancheestratti di deserticola non era dovuto all'azione del composto nel recettore degli oppiacei o correlato al sistema immunitario. Nel nostro studio, l'estratto ricco di fenilpropanoidi ha mostrato attività in entrambe le fasi del test della formalina. L'attività osservata era dovuta infatti al target farmacologico indagato e non ad alcuna possibile alterazione motoria come evidenziato dal therotarod test. I risultati del test della formalina indicano il potenziale dolore neurogenico e dolore indotto dai mediatori dell'infiammazione. Inizialmente, abbiamo deciso di studiare la via del dolore neurogeno. Poiché composti simili di altre specie precedentemente studiate non hanno mostrato alcuna attività del recettore degli oppiacei, abbiamo deciso di testare altri modelli, come i modelli di glutammato e capsaicina.

Il glutammato è un neurotrasmettitore eccitatorio che ha un ruolo importante nella modulazione del dolore in tutto il sistema nervoso centrale e periferico. Questa azione è mediata dai recettori ionotropici del glutammato ligando-dipendenti (iGluRs) e dai recettori metabotropici del glutammato. Gli iGluR possono essere suddivisi in N-metil-d-aspartato (NMDA) e -amino{5}}idrossi{6}}metilisoxazolo{7}} acido propionico (AMPA) (Kolber, 2015). La ricerca ha dimostrato che quando si antagonizzano i recettori NMDA e AMPA con ketamina e kainato, rispettivamente, si osservano effetti antinocicettivi. Tuttavia, gli antagonisti che prendono di mira questi recettori hanno finora indotto un sostanziale effetto negativo e per questo motivo, una nuova ricerca si concentra sull'mGluRshoping che la medicina mediata attraverso questo recettore causerebbe meno effetti collaterali (Palazzo et al., 2014). I risultati del test del CSHE hanno mostrato che questo trattamento era efficace nel ridurre il dolore indotto dal glutammato. Tuttavia, non è ancora noto se questo effetto sia mediato da recettori ionotropici e/o metabotropici. La morfina è uno dei farmaci disponibili che hanno un effetto sulla trasmissione glutamatergica (Deyama et al., 2007). È riportato in letteratura che l'attivazione del recettore del glutammato aumenta le risposte del TRPV1 (Szteyn et al., 2015). Per tale motivo, è possibile che l'effetto osservato per CSHE possa essere dovuto all'attività sul TRPV1 e non necessariamente a una risposta diretta sui recettori del glutammato.

Il passo successivo di questa ricerca è stato quello di eseguire un test del leccarsi le zampe utilizzando la capsaicina come agente algesico, che è un agonista del recettore TRPV1. I risultati hanno mostrato che effettivamente CSHE ha ridotto il dolore attraverso il recettore TRPV1.

Nel caso del CSHE, in quasi tutte le metodologie testate, si è potuto osservare che la dose di 30 mg/kg ha ottenuto risultati migliori rispetto a 100 mg/kg. Ciò può essere dovuto alla saturazione della soluzione che porta a composti precipitati ea una minore quantità di farmaci biodisponibili.

Confermare la composizione chimica stabilita per l'estratto kazako CSHE è stato un passo importante perché i principali costituenti in esso presenti hanno già avuto in qualche modo conferma le loro azioni antinocicettive/antinfiammatorie. Ad esempio,echinacosidesi è affermato come uno dei principi attivi responsabili dell'azione antinocicettiva dell'Echinacea (Hostettmann, 2003). Inoltre, un precedente studio di Schapoval e collaboratori (Schapoval et al., 1998) ha evidenziatoacteosidecome uno dei principali principi attivi in ​​un estratto etanolico preparato con Stachytarpheta cayennensis come valutato mediante edema della zampa e modelli a piastra calda. Ritenuti anche Backhouse e collaboratori (Backhouse et al., 2008).acteosideessere il principio attivo di Buddleja globosa utilizzando diversi modelli di valutazione del dolore, tra cui il test della formalina. Nuove formulazioni sono ora in fase di sviluppo utilizzando lo stato dell'arte delle conoscenze per aumentare la stabilità e prolungare l'azione antinocicettiva diacteoside(Isacchi et al., 2016).

Conclusione

Dieci sostanze di natura fenolica sono state identificate negli stoloni del kazakoCistanchesalsa mediante analisi HPLC/MS. Questi composti potrebbero essere responsabili dell'attività antinocicettiva osservata nei modelli sperimentali qui eseguiti. Tenendo in considerazioneche sul territorio del Kazakistan il genereCistancheè rappresentato principalmente da specieCistanchesalsa, possiamo consigliarne la raccolta e la standardizzazioneechinacosideeacteosidecome composti standard, per procurarsi una materia prima di buona qualità per la medicina tradizionale cinese.

Dichiarazioni etiche

Tutela dei soggetti umani e animali. Gli autori dichiarano che le procedure seguite erano conformi alle normative del comitato etico della ricerca clinica competente e con quelle del Codice Etico della World Medical Association (Dichiarazione di Helsinki).

Riservatezza dei dati.

Gli autori dichiarano che nessun dato paziente appare in questo articolo.

Diritto alla privacy e consenso informato. Gli autori dichiarano che in questo articolo non compaiono dati sui pazienti.

Contributi degli autori

EBK ha eseguito il ritiro dell'impianto, la preparazione dell'estratto e l'analisi dei risultati chimici nonché la stesura della carta; GRD, eseguito tutti i test farmacologici; ZBS, ha progettato lo studio in collaborazione con FB; LNI ed ENB, hanno partecipato al disegno di farmacopea dello studio per l'inclusione dei risultati ottenuti nella farmacopea kazaka; IIT, ha eseguito le analisi HPLC; PDF, ha progettato lo studio farmacologico e FB, ha organizzato insieme il team per scrivere questo articolo.

Conflitto di interessi

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori brasiliani ringraziano Alan Minho per l'assistenza tecnica e l'Instituto Vital Brazil per le donazioni di animali utilizzati. Vogliono anche riconoscere le sovvenzioni di CNPq e Fundac¸ ão Carlos Chagas Filho de Apoio à Pesquisa do Estadodo Rio de Janeiro. Gli autori irlandesi desiderano riconoscere il sostegno finanziario del Programma per la ricerca negli istituti di terzo livello del ciclo 5 dell'Autorità per l'istruzione superiore per TBSI e rafforzare l'importanza del programma SFI ISCA-Brasile (grantno. SFI/13/ISCA/2843) che ha contribuito al collaborazione tra Brasile e Irlanda. Gli autori del Kazakistan vogliono ringraziare KazNMU per il sostegno finanziario concesso per l'esecuzione di questo lavoro.

Da: 'Attività antinocicettiva di Cistanche salsa stolons, in crescita nella Repubblica del Kazakistan' di Elmira B. Kartbaevaa, et al

---EB Kartbaeva et al. / Revista Brasileira de Farmacognosia 27 (2017) 587–591

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