Clonazione molecolare e caratterizzazione biochimica di una nuova cumarina glicosiltransferasi CtUGT1 da Cistanche Tubulosa

per ulteriori informazioni:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

ASTRATTO

Le UDP-glicosiltransferasi (UGT) sono una famiglia importante e funzionalmente diversificata di enzimi coinvolti nella biosintesi dei metaboliti secondari. La cumarina è uno degli scheletri più comuni di prodotti naturali con attività farmacologiche candidate. Tuttavia, fino ad oggi, molti hanno riportato GT da piante che hanno riconosciuto principalmente i flavonoidi come accettori di zucchero. Solo GT limitati potrebbero catalizzare la glicosilazione delle cumarine. In questo studio è stato clonato un nuovo UGTCistanche tubulose, una preziosa erba tonica tradizionale cinese, che è ricca di diversi glicosidi come glicosidi feniletanoidi, glicosidi lignani e glicosidi iridoidi. L'allineamento della sequenza e l'analisi filogenetica lo hanno dimostratoCtUGT1è filogeneticamente distante dalla maggior parte degli UGT flavonoidi riportati e adiacente agli UGT fenilpropanoidi. Ampi test enzimatici in vitro hanno scoperto che sebbeneCtUGT1non sono stati coinvolti nella biosintesi dei glicosidi bioattivi inCistanche tubulose, potrebbe catalizzare la glucosilazione delle cumarine umbelliferone 1, esculetina 2 e imecromone 3 con una resa considerevole. I prodotti glicosilati sono stati identificati mediante confronto con gli standard di riferimento o con la spettroscopia NMR ei risultati lo hanno indicatoCtUGT1può catalizzare regiospecificamente la glucosilazione delle cumarine idrossiliche nella posizione C7- OH. I residui chiave che hanno determinatoCtUGT1l'attività è stata ulteriormente discussa sulla base di modelli di omologia e analisi di docking molecolare. In combinazione con i risultati della mutagenesi sito-diretta, è stato scoperto che l'H19 ha svolto un ruolo insostituibile come base cruciale della catalisi.CtUGT1potrebbe essere utilizzato nella preparazione enzimatica di glicosidi cumarinici bioattivi.

Parole chiave:Glicosiltransferasi vegetali, glicosidi cumarinici,Cistanche tubulose, Modellazione dell'omologia, Mutagenesi sito-diretta

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introduzione

La glicosilazione è uno dei tipi più comuni di modificazione della struttura dei prodotti naturali secondari. La glicosilazione potrebbe modificare la stabilità e/o la solubilità dell'aglicone e contribuire notevolmente alla diversità dei prodotti naturali/innaturali a causa dei molteplici tipi di coniugazione. Nelle piante, queste reazioni sono state generalmente condotte dalle glicosiltransferasi (UGT) dipendenti dall'uridina difosfato (UDP), un tipo di enzimi che catalizzano il trasferimento di porzioni di monosaccaridi dallo zucchero nucleotidico attivato a una molecola accettore di glicosile che può essere un carboidrato, un glicoside, un oligosaccaride , o un polisaccaride [1,2]

Ad oggi, molti geni che codificano per UGT sono stati isolati da diverse piante [3]. La glicosilazione avveniva principalmente a livello di gruppi idrossilici o carbossilici di un'ampia gamma di prodotti secondari, come flavonoidi [4], fenilpropanoidi [5], terpenoidi [6], steroidi [7], alcaloidi [8] e così via. Le cumarine sono metaboliti fenilpropanoidi ampiamente distribuiti in molte specie vegetali. Le cumarine presenti in natura sono spesso esistite come glicoconiugati e questi derivati ​​hanno mostrato un ampio spettro di attività farmacologiche, tra cui antiossidante [9], antivirale [10,11], epatoprotettivo [12], antinfiammatorio [13], antitumorale [14] ], attività inibitorie antimutagene [15], colinesterasiche (ChE) e monoamino ossidasi (MAO) [14,15], ecc. Tuttavia, fino ad oggi, rispetto alle UGT flavonoidi più frequentemente riportate e ampiamente studiate, sono state osservate solo UGT limitate riportato in grado di trasferire la parte zuccherina alle cumarine [16-18].

Piante ricche di diversi glicosidi potrebbero fungere da pool genico ideale di UGT con nuove attività di catalisi. Inoltre, è stato riportato che numerose UGT possiedono una notevole promiscuità di accettori per catalizzare la glicosilazione di più substrati, alcuni dei quali non erano nemmeno separati nelle piante [19]. In questo articolo, una nuova glicosiltransferasiCtUGT1è stato identificato daCistanche tubulose, un'erba medicinale tradizionale ricca di glicosidi diversi come glicosidi feniletanoidi (PhGs), glicosidi lignani e glicosidi iridoidi. L'espressione eterologa e la caratterizzazione della funzione hanno dimostrato che sebbene ricombinanteCtUGT1non è stato coinvolto nella biosintesi di questi glicosidi inCistanche tubulose, può catalizzare la glucosilazione delle cumarine idrossiliche e la reazione è avvenuta in modo regiospecifico sulla posizione OH 7- delle cumarine umbelliferone 1, escalation 2 e imecromone 3 per produrre tre composti farmacologicamente attivi skimming (1a), cichoriin (2a) , e 4-metilumbelliferil glucoside (3a) con resa considerevole, rispettivamente. Inoltre, il substrato del benzofenone 4,4′-diidrossibenzofenone (4), il substrato isoflavonico genisteina (5) e il substrato antrachinonico aloe-emodina (6) potrebbero essere accettati anche daCtUGT1. Le proprietà catalitiche e i residui chiave che sottolineano la capacità di catalisi diCtUGT1sono stati anche valutati sulla base di modelli di omologia, analisi AutoDock e mutagenesi sito-diretta.

2. Sperimentale

2.1. Materiale vegetale e prodotti chimici

Cistanche tubuloseutilizzato in questo studio è stato raccolto da aree desertiche nelle regioni autonome di Hetian, nello Xinjiang. La loro identità botanica è stata confermata dal professor Pengfei Tu dell'Università di Pechino. Le cumarine testate e altri substrati in questo studio sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Cina) e Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, Cina ) se non diversamente indicato. Gli standard di riferimento di scrematura (1a) e cichoriin (2a) sono stati acquistati da Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, Cina).

2.2. Clonazione molecolare di CtUGT1 da Cistanche tubulosa

L'RNA totale diCistanche tubuloseè stato estratto dallo stelo carnoso utilizzando un kit OMEGA Plant RNA (GA, USA) e trascritto inversamente in cDNA con il kit di reagenti PrimeScript™ RT (TaKaRa, Giappone) seguendo le istruzioni del produttore. È stato progettato un primer degenerato per 3′RACE basato sulle sequenze di amminoacidi nella scatola conservata PSPG (Plant Secondary Product Glycosyltransferases) di glicosiltransferasi vegetali. Le amplificazioni di estremità 3′ e 5′ diCtUGT1sono stati effettuati utilizzando Smart RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA) secondo il protocollo del produttore utilizzando primer (Tabella S1). Il cDNA a lunghezza intera delCtUGT1è stato amplificato mediante PCR utilizzando KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Giappone) con coppie di primer gene-specifici (Tabella S1) nelle seguenti condizioni: una fase di denaturazione iniziale a 94 ◦C per 2 min, seguita da 35 cicli di denaturazione a 98 ◦C per 15 s, ricottura a 55 ◦C per 30 s ed estensione a 68 ◦C per 55 s, con una fase di estensione finale a 68 ◦C per 7 min. Tutti i frammenti di DNA ottenuti sono stati clonati in un vettore pEASY-Blunt (TransGen Biotech, Cina) e sequenziati.

2.3. Allineamento di sequenze e analisi filogenetica

Allineamento di sequenza diCtUGT1con le glicosiltransferasi riportate (Tabella S2) è stato eseguito utilizzando il pacchetto software DNAMAN 4.0 (Lynnon Biosoft, Canada). I motivi e i domini sono stati analizzati utilizzando uno strumento di dominio conservato (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi). L'albero filogenetico è stato costruito eseguendo il bootstrap del software MEGA 7.0.14 utilizzando il metodo neighbor-joining con 1000 repliche di bootstrap [20]. La sequenza proteica tradotta diCtUGT1è stato allineato con le glicosiltransferasi vegetali note depositate nel database NCBI GenBank (Tabella S3) con ClustalW.

2.4. Espressione eterologa e purificazione proteica di CtUGT1 in Escherichia coli

La regione di codifica diCtUGT1è stato amplificato con BamH I e Not I come siti di restrizione utilizzando i primer mostrati nella Tabella S1. Le reazioni PCR sono state condotte utilizzando KOD-Plus-Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Osaka, Giappone). Le sequenze ottenute sono state verificate mediante clonazione nel vettore pEASY-Blunt (TransGen Biotech, Cina). Il prodotto di amplificazione confermato diCtUGT1è stato successivamente digerito e subclonato nel vettore di espressione pET-28a( plus ) (Novagen, USA). Il costrutto verificato è stato quindi trasformato in E. coli Transetta (DE3) per ottenere il ceppo ricombinante. La coltura notturna del ceppo ricombinante è stata inoculata in terreno Luria-Bertani (LB) contenente 50 ug⋅mL− 1 kanamicina e 40 ug⋅mL− 1 cloromicetina in un rapporto di 1:1{{ 19}}0. Le colture sono state coltivate a 37 ◦C, 200 rpm fino a quando il valore OD600 ha raggiunto 0,4–0,6. L'isopropil- -D-tiogalattopiranoside (IPTG) è stato successivamente aggiunto a una concentrazione finale di 0,5 mM e le cellule sono state coltivate per 16 ore a 18°C, 180 giri/min. Quindi i pellet cellulari sono stati raccolti mediante centrifugazione (7600 × g, 10 min, 4 ◦C) e risospesi in 3 mL/g di tampone di lisi refrigerato (dati supplementari Nota 1) e interrotti mediante sonicazione su ghiaccio. I detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione a 7600 × g, 4 ◦C per circa 30 min. Una colonna Histrap pre-equilibrata (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) è stata utilizzata per la cromatografia di affinità secondo le istruzioni del produttore. La proteina ricombinante è stata eluita da 10 volumi di colonna di tampone di eluizione (dati supplementari Nota 1) contenente 250 mM di imidazolo. La purezza delle proteine ​​è stata analizzata dal 10 percento di SDS-PAGE. La proteina purificata è stata concentrata da un tubo di ultrafiltrazione da 30 kDa (Sigma-Aldrich, USA) e dissalata utilizzando una colonna PD-10 (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) con tampone di dissalazione (dati supplementari Nota 1). La concentrazione proteica è stata determinata con il metodo Bradford utilizzando BSA come standard.

2.5. Saggi di attività enzimatica e specificità del substrato di CtUGT1

Per studiare l'attività di glicosilazione diCtUGT1, i saggi enzimatici sono stati eseguiti in una miscela di reazione (150 μL) composta da 0.4 mM di glicone, 0,8 mM di UDP-glucosio (UDPG) e 50 ug di purificatoCtUGT1proteine ​​nel tampone di dissalazione. Tutte le reazioni sono state incubate a 30 ◦C per 12 ore e terminate aggiungendo 300 μL di metanolo freddo. Le miscele sono state centrifugate a 15,000 × g per 30 minuti per raccogliere il supernatante per le analisi HPLC-UV/ESI-MS. Per ciascuna reazione sono stati eseguiti di routine tre saggi paralleli. HPLC (Agilent 1260, USA) era dotato di un rivelatore a matrice di diodi e di una colonna CAPCELL PAK C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm; Shiseido, Giappone) con una portata di 1 ml⋅min− 1 e la temperatura della colonna è stato mantenuto a 30 ◦C. La fase mobile era costituita da A (cioè, soluzione acquosa di acido formico allo 0,1 percento) e B (cioè, acetonitrile). I programmi gradiente sono stati elencati nella tabella S4. I dati HRESI-MS sono stati registrati su un sistema LCMS-IT-TOF, dotato di un'interfaccia ESI (Shimadzu, Kyoto, Giappone) con He ad altissima purezza come gas di collisione e N2 come gas di nebulizzazione. I parametri della sorgente ESI ottimizzati erano i seguenti: portata del gas della guaina, 1,5 mL⋅min− 1; portata del gas ausiliario, 1,5 ml⋅min− 1; tensione di spruzzatura, 4,5 kV; temperatura capillare, 200 ◦C. Gli spettri sono stati registrati nell'intervallo 100–1500 m/z per un'analisi MS a scansione completa.

2.6. Effetti del tempo di reazione, valore del pH e temperatura sull'attività enzimatica e studi cinetici di CtUGT1

Effetti del tempo di reazione, del valore del pH e della temperatura sull'attività enzimatica diCtUGT1sono stati testati utilizzando UDPG come donatore di zucchero e 3 come accettore di zucchero nelle condizioni di reazione descritte sopra. Per la determinazione del pH ottimale, l'attività enzimatica è stata confrontata in tampone 100 mM (acido citrico-citrato di sodio) con valori di pH compresi tra 3.{12}} e 6.{{ 14}}, 10{{20}} tampone mM (KH2PO4-K2HPO4) con valori di pH compresi tra 6.{28}} e 8.{{29} }, 10tampone 0 mM (Tris-HCl) con valori di pH compresi tra 7,0 e 9,0, tampone 100 mM (Na2CO3-NaHCO3) con valori di pH compresi tra 9,0 e 11,0. Per valutare la temperatura di reazione ottimale, le reazioni sono state incubate a varie temperature comprese tra 0 e 65 ◦C. L'andamento temporale della reazione è stato valutato in 12 diversi punti temporali tra 0 e 24 h. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. Le miscele di reazione sono state analizzate mediante HPLC-MS come descritto sopra. Per studi cinetici diCtUGT1, i saggi enzimatici sono stati eseguiti in un volume finale di 100 μL contenente 100 mM di tampone KH2PO4-K2HPO4 (pH 8,0), 25 ug di tampone purificatoCtUGT1, 3 mM di UDPG e concentrazioni variabili (50–3000 μM) di 3. Le reazioni sono state condotte a 37 ◦C per 30 minuti e quindi terminate con 100 μL di metanolo ghiacciato. Tutte queste reazioni sono state eseguite in triplicato e l'attività enzimatica è stata valutata tramite la quantificazione dei corrispondenti derivati ​​glucosilati. I parametri cinetici, tra cui la costante di Michaelis-Menten (Km) e Vmax, sono stati calcolati mediante analisi di regressione non lineare utilizzando il software GraphPad Prism 5.

2.7. Selettività del substrato e del donatore di zucchero di CtUGT1

Per esplorare le preferenze del substrato diCtUGT1, un totale di 27 substrati appartenenti a diversi tipi strutturali sono stati testati utilizzando UDPG come donatore. Le loro informazioni chimiche sono state elencate nella Tabella S5 e le loro strutture sono state mostrate nelle Figg. S1 e S2. Per studiare la selettività dei donatori di zucchero diCtUGT1, i saggi sono stati condotti utilizzando umbelliferone (1), esculetina (2), imecromone (3), 4,4′-diidrossibenzofenone (4), genisteina (5) e aloe-emodina (6) come substrati con UDPG, UDP- N acetil galattosamina, UDP-galattosio, GDP-mannosio, GDP-fucosio, UDP acido galatturonico, UDP-ramnosio come donatori di zucchero, rispettivamente. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. Le miscele di reazione sono state analizzate mediante HPLC-MS come descritto sopra.

2.8. Preparazione del 4-metilumbelliferil glucoside (composto 3a) mediante CtUGT1

La miscela di reazione preparativa consisteva in {{0}}, 0,034 mmoli di composto 3, 0,04 mmoli di UDPG, 5 mg purificatiCtUGT1in 50 ml di tampone di reazione. Le reazioni sono state agitate delicatamente alle condizioni ottimali (100 mM KH2PO4-K2HPO4 con pH 8,0; 37 ◦C). Dopo incubazione a 37 ◦C per 24 h, il supernatante di reazione è stato separato mediante cromatografia su colonna con resina macroporosa (MCI GEL CHP) dopo centrifugazione a 12,{12}} × g per 30 min. La fase mobile era un'eluizione in gradiente del 100% di acqua al 100% di metanolo. Ciascuna frazione è stata analizzata mediante HPLC-UV. Le frazioni contenenti solo prodotti mirati sono state evaporate a secchezza a pressione ridotta e caratterizzate dalla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) 1H e dalla spettroscopia NMR 13C.

2.9. Docking molecolare e mutagenesi sito-diretta di CtUGT1

Il modello proteico diCtUGT1è stato stabilito utilizzando SWISS-MODEL [21–25]. La struttura cristallina di Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) è stata scelta come struttura del modello [26]. Il modello stabilito è stato valutato da VERIFY-3D [27,28]. Auto-Dock Vina è stato utilizzato per studi di docking molecolare [29]. La struttura cristallina di UGT74F2 [30], una glicosiltransferasi di Arabidopsis thaliana, in complesso con ligando UDP e acido salicilico (PDB ID 5U6M) è stata utilizzata come struttura di controllo per l'analisi della tasca del donatore di zucchero e della tasca dell'accettore di zucchero, rispettivamente . Gli Auto-Dock-Tools 1.5.6 di MGLTools (Molecular Graphics Laboratory tools) sono stati utilizzati per preparare il donatore di zucchero UDPG e il substrato 1, 2 per l'aggancio molecolare. Le catene laterali dei residui attorno alla cavità del sito attivo sono state impostate flessibili e i legami girevoli dei ligandi sono stati lasciati liberi di ruotare. La posa in cima alla classifica, come giudicata dal modello di aggancio Vina con l'affinità più alta (kcat/mol), è stata sottoposta ad analisi visiva utilizzando il software PyMOL 2.0.

Per le indagini sulla mutagenesi, il gene ottimizzato per la sequenza diCtUGT1(Dati supplementari Nota 2) è stato sintetizzato e testato come wild type. Mutagenesi sito-diretta delCtUGT1è stato condotto utilizzando il Fast Mutagenesis System (TransGen Biotech). I mutanti sono stati amplificati dal modello del gene ottimizzato che è stato costruito nel pET-28un vettore utilizzando i primer specifici mostrati nella Tabella S1. I mutanti costruiti sono stati verificati mediante PCR e sequenziamento prima di essere trasformati in E. coli (DE3) per l'espressione eterologa. La purificazione delle proteine ​​e le reazioni enzimatiche sono state eseguite e analizzate come descritto sopra.

3. Risultati e discussioni

3.1. Clonazione completa del cDNA del gene CtUGT1 daCistanche tubulose

Cistanche tubulose(L.) (RouCongRong) è un'erba medicinale tradizionale cinese che produce un'ampia varietà di glicosidi naturali bioattivi. Ci dovrebbe essere un numero considerevole di nuovi geni della glicosiltransferasi che esistevano nel suo genoma. Per cercare nuove glicosiltransferasi con interessanti attività di catalisi, è stato progettato un primer degenerato per 3′-RACE basato sul motivo PSPG conservato per clonare UGT permissivi daCistanche tubulose. La sequenza finale 3′ ottenuta è stata ulteriormente analizzata mediante blast NCBI ed è stato progettato il primer specifico per 5′-RACE in base alla sequenza ottenuta. Le estremità del cDNA 5′ amplificate e le estremità del cDNA 3′ sono state giuntate e l'intera lunghezza delCtUGT1sequenza, inclusi 1739 nucleotidi, è stata ottenuta (Fig. S3) ed elencata in Dati supplementari Nota 3. Successivamente, un frame di lettura aperto (ORF) diCtUGT1è stato trovato dagli strumenti NCBI ORF Finder e la sequenza di codifica di 1482 bp è stata clonata con successo mediante amplificazione RT-PCR utilizzando primer specifici nella Tabella S1. La sequenza cDNA di CtUGT1 è stata presentata all'NCBI (numero di accesso MW629113).

3.2. Analisi di sequenza ed espressione eterologa di CtUGT1

IlCtUGT1ci si aspettava che il gene codifichi una proteina di 493 residui di amminoacidi con una massa molecolare stimata di 55,78 kDa. L'esplosione dell'NCBI ha rivelato che la sequenza proteica dedotta diCtUGT1condivide l'identità più alta (76,39%) con gli enzimi UGT86A{3}}like. Le funzioni biochimiche di questo tipo di enzima non sono state completamente caratterizzate. Si prevede che possano essere coinvolti nell'adattamento della pianta a stress abiotici. L'allineamento delle sequenze di amminoacidi di CtUGT1 e di altre glicosiltransferasi vegetali è mostrato in Fig. S4.

I 44 residui altamente conservati del motivo PSPG sono stati trovati al C-terminale diCtUGT1. All'interno del PSPG-box, una sequenza peptidica di HCGWNS è stata localizzata al 373° amminoacido, che è stato rilevato nel 95% di tutte le glicosiltransferasi [31]. Il residuo finale del motivo PSPG era la glutammina, che indicava che questo enzima tende a utilizzare l'UDPG come donatore di zucchero [32] (Fig. S4). L'albero filogenetico è stato costruito sulla base delle sequenze polipeptidiche previste diCtUGT1e diversi tipi di glicosiltransferasi di origine vegetale che erano coinvolti nella biosintesi di vari metaboliti secondari. Finora, la maggior parte delle glicosiltransferasi segnalate dalle piante ha riconosciuto i flavonoidi come loro substrati, come il flavone 7-O-glicosiltransferasi, il flavonoide 3-O-glucosiltransferasi, l'isoflavone 7-O-glicosiltransferasi e calcone glicosiltransferasi. I risultati dell'analisi filogenetica lo hanno mostratoCtUGT1non si è raggruppato nel clade dei flavonoidi GT. Invece, si trova adiacente a UGT74T1 e UGT74S1 (glicosiltransferasi lignani da Linum usitatissimum) e NtGT2 (una glicosiltransferasi cumarinica da Nicotiana tabacum), che indicavano cheCtUGT1potrebbe avere alcune nuove attività di catalisi nei confronti dei substrati fenilpropanoidi (Fig. 1), soprattutto considerato che sono stati identificati funzionalmente solo membri limitati appartenenti a questi cladi.

Per rivelare ulteriormente la sua attività di catalisi, ilCtUGT1la sequenza è stata espressa sotto il controllo del promotore lac T7 nelle cellule di E. coli Transetta (DE3) come proteina di fusione con tag His6-. Il ricombinante con etichetta HisCtUGT1è stato efficacemente purificato fino all'omogeneità mediante cromatografia di affinità Ni-NTA. Il peso molecolare del CtUGT1 ricombinante purificato era di circa 55 kDa (Fig. S5), che è coerente con la massa molecolare prevista.

3.3. Specificità del substrato accettore in vitro di CtUGT1

Per testare l'attività di glicosilazione diCtUGT1, sono stati eseguiti saggi enzimatici in vitro. UDPG è stato utilizzato come donatore di zucchero. Gli accettori di zucchero sono stati selezionati in base a diverse preoccupazioni. In primo luogo, ilCtUGT1gene è stato clonato daCistanche tubulosei cui principali componenti chimici sono PhGs. Per verificare seCtUGT1è coinvolto nella biosintesi dei PhG, gli agliconi comuni dei PhG inCistanche tubulosecome il tirosolo (NP1, Fig. S2) e il salidroside (NP2, Fig. S2) sono stati inizialmente selezionati come substrati. Sfortunatamente, le analisi HPLC e HRESI-MS non hanno trovato alcun prodotto glicosilato, il che lo indicavaCtUGT1potrebbero non essere coinvolti nella biosintesi dei PhG.

In secondo luogo, sulla base dell'allineamento della sequenza e dei risultati dell'analisi filogenetica (Fig. 1),CtUGT1era filogeneticamente correlato alle lignanoid e alle glicosiltransferasi cumariniche, il che lo suggerivaCtUGT1è probabilmente una glicosiltransferasi fenilpropanoide. Per verificare questa previsione, tre substrati cumarinici 1, 2 e 3 insieme a un substrato lignanoide magnololo NP17 sono stati testati rispettivamente come accettori di zucchero. Come controllo negativo sono stati usati enzimi inattivati ​​dal calore (100 ◦C, 10 min). L'analisi HPLC-HRESI-MS delle reazioni utilizzando NP17 come substrato non ha trovato alcun prodotto. Al contrario,CtUGT1ha mostrato evidenti capacità di glucosilazione contro i substrati cumarinici testati (1,2,3). Utilizzando il substrato 1 come esempio, come mostrato in Fig. 2A, un nuovo picco (1a) con un tempo di ritenzione ridotto (11,46 min) rispetto a quello del substrato 1 (19,75 min) è stato prodotto daCtUGT1con un rendimento del 37,78 per cento. Il suo spettro di assorbimento UV corrisponde a 1. Lo spettro HRESI-MS ha mostrato che il picco 1a mostrava un [M più H] più a m/z 325,1029 e un [M più Na] più a m/z 347,0710 (calcd. 347,0737 per C15H16O8Na ) con la formula prevista di C15H16O8, che era 162 amu maggiore di quella di 1 e coerente con la formula teorica di un prodotto glucosilato (Fig. 2A). Allo stesso modo, il prodotto glucosilato del substrato 2 (14,21 min, Fig. 2B) e 3 (21,92 min, Fig. 2C) è stato trovato anche al tempo di ritenzione di 10,85 min e 13,80 min, con il tasso di conversione del 22,03 percento e del 68,67 percento , rispettivamente. La massa molecolare dei prodotti corrispondeva esattamente alla massa calcolata dei prodotti glucosilati, il che lo confermavaCtUGT1potrebbe catalizzare la glucosilazione dei composti cumarinici 1–3 (Tabella 1).

Successivamente, considerando che la maggior parte degli enzimi recentemente riportati ha mostrato promiscuità di catalisi in vitro, per esplorare ulteriormente lo spettro del substrato diCtUGT1, sono stati condotti saggi enzimatici espansivi verso diversi composti appartenenti a diversi tipi di prodotti naturali, inclusi flavonoidi, composti fenolici, cumarine, stilbene, antrachinoni, benzofenone, naftalene e iridoide (Figg. S1-S2), utilizzando UDPG come il donatore di zucchero È stato riscontrato che il substrato del benzofenone 4,4′-diidrossibenzofenone (4), il substrato dell'isoflavone genisteina (5) e il substrato dell'antrachinone aloe-emodina (6) potrebbero anche essere catalizzati daCtUGT1per formare il corrispondente prodotto glucosilato 4a, 5a, 6a con polarità maggiore (Fig. 3). L'analisi HRESI-MS ha mostrato che i picchi ionici dei prodotti erano tutti 162 amu maggiori di quelli dei substrati, suggerendo cheCtUGT1potrebbe catalizzare la glucosilazione di questi composti per formare il loro corrispondente prodotto monoglucoside. I tassi di conversione di 4, 5 e 6 erano rispettivamente del 4,12%, 14,14% e 23,33% (Tabella 1).

La selettività del donatore di zucchero diCtUGT1è stato anche esplorato. Oltre all'UDPG, altri sei donatori, tra cui UDP-N-acetil galattosamina, UDP galattosio, GDP-mannosio, GDP-fucosio, UDP-acido galatturonico e UDP ramnosio, sono stati testati utilizzando i substrati 1–6 come accettori. I risultati lo hanno mostratoCtUGT1selezionato esclusivamente UDPG come donatore di zucchero. Nessun prodotto è stato osservato quando sono stati testati altri zuccheri attivati ​​(dati non mostrati).

3.4. Proprietà biochimiche e parametri cinetici di CtUGT1

Proprietà biochimiche diCtUGT1sono stati studiati utilizzando 3 come accettore di zucchero e UDPG come donatore di zucchero come indicato in Fig. 4. Attività di catalisiCtUGT1è stato testato in un intervallo di temperatura di 4–60 ◦C, l'attività ottimale è stata rilevata a 37 ◦C (Fig. 4A). L'analisi dell'attività enzimatica tra pH 3.{7}} e 9.0 ha mostrato che il valore di pH ottimale è stato osservato a pH 8,0 (tampone 100 mM KH2PO4-K2HPO4, Fig. 4C). La resa del prodotto di glucosilazione 3a è aumentata linearmente entro 1 ora e il tasso di crescita si è stabilizzato dopo 5 ore (Fig. 4B). Il valore apparente Km diCtUGT1per 3 era 218,7 ± 7,176 μM e Vmax era 0.02255 ± 0,0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. Preparazione enzimatica e identificazione strutturale di prodotti glucosilati

Sulla base dei risultati dei test enzimatici,CtUGT1tende ad essere una glucosiltransferasi specifica che potrebbe catalizzare la glucosilazione di diversi tipi di prodotti naturali. Le informazioni HPLC-HR-MS dei prodotti sono state riassunte nella Tabella 1. Tra questi, i substrati cumarinici hanno mostrato un tasso di conversione considerevole. L'attività enzimatica contro le cumarine è stata ulteriormente analizzata. Va notato che tutti e tre i substrati cumarinici testati sono stati accettati daCtUGT1hanno un gruppo ossidrile in posizione C-7, mentre l'esculetina (2) ha un gruppo ossidrile in più in posizione C-6. Il profilo HPLC del prodotto glucosilato di esculetina è mostrato in Fig. 2. È stato osservato un solo prodotto, suggerendo che la reazione di glucosilazione si è verificata regiospecificamente nella posizione C-6 o C{5}}. Per confermare il sito di glicosilazione, il prodotto 2a è stato identificato per confronto con i glucosidi autentici mediante analisi HPLC-UV/HRESI-MS. Quando si aggiungeva l'autentica glucoside cichoriin (glucosilata nella posizione 7-OH di 2) nel sistema di reazione, il picco si sovrapponeva a 2a, il profilo co-HPLC confermava ulteriormente che il prodotto glicosilato di 2 catalizzato daCtUGT1è la cicoriina [33], che ha dimostrato che la frazione glucosile è stata specificamente trasferita sulla posizione C7-OH. Il prodotto 1a è stato identificato anche per confronto con lo standard di riferimento. Gli spettri UV-HPLC insieme all'analisi co-HPLC (Fig. 2) hanno rivelato che la struttura chimica di 1a è stata attribuita come scrematura [34], che è il prodotto glucosilato di 1 sulla posizione C7-OH.

Il prodotto 3a è stato preparato da una reazione su larga scala e strutturalmente caratterizzato dalla spettroscopia HRESI-MS, 1H NMR e 13C NMR (Figg. S13, S14 e Nota 4). Nel segnale 1H NMR, rispetto al substrato 3, un segnale di idrossile fenolico nella posizione C{{10}} è scomparso e il segnale di carbonio di C-7 si è spostato di δ 1.{{25} } ppm nel campo alto, mentre i segnali C-6 e C-8 sono passati al campo basso in 13C NMR. Questi risultati hanno confermato che il residuo di glucopiranosile era attaccato al gruppo idrossile fenolico nella posizione C-7 di 3 [35]. Inoltre, lo spettro 1H NMR ha mostrato segnali protonici anomerici a δH 5.00 (1H, d, J=7.0 Hz); la componente zuccherina è stata indicata come -D-glucopiranosio. Questo risultato ha dimostratoCtUGT1è una cumarina O-glucosiltransferasi che catalizza la glucosilazione dell'idrossile cumarina nella posizione 7-OH.

3.6. Modellazione dell'omologia, docking molecolare e mutagenesi sito-diretta della proteina CtUGT1

Lo hanno rivelato ampie reazioni enzimaticheCtUGT1potrebbe catalizzare la glucosilazione di tre cumarine nel loro corrispondente prodotto glucosilato e la posizione glucosilata si è verificata specificamente nella posizione 7- OH. Per identificare i residui chiave che hanno determinato le attività di catalisi diCtUGT1, sono state eseguite indagini sulla modellazione dell'omologia, sull'aggancio molecolare e sulla mutagenesi sito-diretta di CtUGT1. La modellazione molecolare omologa per CtUGT1 è stata stabilita utilizzando SWISS-MODEL [21–25]. La struttura cristallina di Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), determinata con una risoluzione di 2,1 Å, ha mostrato il punteggio totale più alto con la massima omologia di sequenza e un basso valore E, è stata scelta come struttura del modello [26]. La valutazione della razionalità del modello stabilito è stata mostrata nel grafico Ramachandran (Fig. S6), l'88,5 percento dei residui nel modello stabilito si trova nella regione più favorita. Il modello di omologia di CtUGT1 è costituito da due simili motivi di pieghe di tipo Rossmann rispettivamente al terminale N e C (Fig. 5A). Il dominio N-terminale ha fogli paralleli a sette filamenti attorno a dieci eliche. Il dominio C-terminale contiene fogli a sei filamenti fiancheggiati da nove eliche (Fig. 5A, S7).

Per chiarire ulteriormente la tasca attiva diCtUGT1, è stato eseguito il docking molecolare. Poiché UGT85H2 ha solo la struttura della forma apo, come stampo di controllo è stato selezionato un altro omologo UGT74F2 con UDP e acido salicilico come due ligandi. L'UDPG è stato preparato come donatore di zucchero. Due substrati cumarinici 1 e 2 sono stati preparati rispettivamente come accettori di zucchero. I siti di legame del donatore e dell'accettore di glicosile sono stati calcolati e agganciati separatamente come mostrato in Fig. 5. I risultati hanno indicato che entrambe le due tasche di legame si trovano all'interno della fessura profonda nell'area di interazione del dominio N-terminale strettamente imballato e C -dominio terminale diCtUGT1e spazialmente vicini l'uno all'altro (Fig. 5A). Il C-terminale diCtUGT1è principalmente coinvolto nel contatto con il donatore di glicosile come descritto negli UGT di altre piante e la maggior parte dei residui circostanti sono idrofili e altamente conservati. Come la tipica scatola PSPG, il residuo W377 in questo motivo potrebbe formare legami idrogeno con il gruppo glucosio di UDPG (Fig. 5B); N378 e S379 in questo motivo potrebbero formare legami idrogeno con il gruppo difosfato di UDPG (Fig. 5B). Inoltre, secondo i risultati dell'aggancio, i residui di W356 e Q359 possono interagire con il gruppo uridina attraverso l'interazione del legame idrogeno per stabilizzare il donatore nella tasca attiva. Per verificare la funzione di questi residui chiave previsti, sono stati selezionati un totale di 16 siti e sottoposti a mutagenesi con scansione dell'alanina. Le attività di catalisi di questi mutanti sono state testate utilizzando tutti e sei i substrati positivi sopra menzionati. Le analisi HPLC hanno mostrato che, quando i residui di G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 e D398 sono stati mutati in alanina, l'attività di glicosilazione della proteina è stata totalmente perso verso tutti i substrati testati. Questi risultati hanno suggerito che i 16 residui di cui sopra sono i residui chiave che hanno determinato il legame del donatore UDPG e l'attività di glicosilazione diCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 percento) come V14, V132, E153, T212 e I209 (Fig. S8). Si prevede che questi residui idrofobici che circondano l'anello aromatico potrebbero formare interazioni di van der Waals con il substrato nella tasca di legame.

4. Discussione

La glicosilazione è una delle fasi di modificazione più importanti nelle vie di biosintesi di molti metaboliti secondari. La glicosilazione potrebbe aumentare la biodisponibilità dei prodotti naturali migliorando la loro solubilità in acqua e riducendone la tossicità. La cumarina è considerata la forma più semplice all'interno di un'ampia classe di sostanze fenoliche presenti in natura costruite da un anello di pirone fuso con un anello benzenico. Sia i composti naturali che quelli sintetici a base di cumarina hanno attirato molta attenzione da parte dei chimici medicinali e degli scienziati della progettazione di farmaci come conseguenza delle loro diverse proprietà farmacologiche e biologiche [36]. Un'ulteriore modifica glicosilata delle cumarine potrebbe aiutare ad arricchire la diversità strutturale di questi composti e anche a migliorarne la solubilità e la biodisponibilità. Nelle piante, un tale processo di glicosilazione è catalizzato dalla UDP-glicosiltransferasi. Sebbene siano stati identificati più UGT da piante diverse, ad oggi, la maggior parte degli UGT segnalati erano coinvolti nella modificazione glicosilata dei flavonoidi. È stato segnalato che solo UGT limitati sono in grado di accettare cumarine come substrati. In questo studio, un nuovo gene della glicosiltransferasiCtUGT1è stato clonato dall'erba tradizionale cineseCistanche tubulose. L'allineamento della sequenza e i risultati dell'analisi filogenetica lo hanno mostratoCtUGT1è filogeneticamente distante dalla maggior parte degli UGT flavonoidi riportati e molto vicino agli UGT fenilpropanoidi. Ampi saggi enzimatici hanno rivelato che CtUGT1 non poteva catalizzare la glicosilazione dei composti del feniletanolo per formare PhG, che è il principale componente chimico diCistanche tubulose. Invece, potrebbe riconoscere le cumarine come suoi substrati e condurre la reazione di glicosilazione. Il chiarimento della struttura dei prodotti ha mostrato che il sito di glicosilazione è catalizzato daCtUGT1si è verificato regiospecificamente nella posizione C7-OH delle cumarine. Utilizzando CtUGT1, tre glicosidi cumarinici tra cui skimming (1a), cichoriin (2a) e 4- metilumbelliferil glucoside (3a) sono stati sintetizzati con successo e identificati strutturalmente. Tutti questi tre composti sono stati segnalati come molecole farmaceuticamente attive. Ad esempio, 1a è stato considerato possedere varie attività farmacologiche, tra cui attività renoprotettiva, proprietà antinfiammatorie, anticancro e antiamebiche [37]. 2a ha mostrato un'elevata attività antibatterica contro alcuni batteri Gram-positivi come Bacillus cereus e Staphylococcus aureus [38]. 3a può aiutare le piante a migliorare le loro capacità di risposta alle sostanze chimiche e alle tossine [39].

Oltre alle cumarine, l'hanno trovato estesi saggi enzimaticiCtUGT1ha anche mostrato un'attività di glucosilazione osservabile verso il substrato 4 del benzofenone, il substrato 5 dell'isoflavone e il substrato 6 dell'antrachinone, il che indicava che CtUGT1 ha una certa tolleranza al substrato. Tuttavia,CtUGT1non poteva catalizzare la biosintesi dei componenti dei glicosidi inCistanche tubulosecome glicosidi feniletanoidi (PhGs), glicosidi lignanoid e glicosidi iridoidi. Inoltre, secondo le precedenti indagini, non sono stati isolati glicosidi cumarinici daCistanche tubulose. Quindi, la funzione in vivo diCtUGT1ha ancora bisogno di essere ulteriormente esplorato. L'attività di glucosilazione di CtUGT1 nei confronti dei substrati cumarinici rende questo enzima uno strumento utile per la modifica della glicosilazione enzimatica delle cumarine e ha anche indicato che gli enzimi metabolici secondari vegetali potrebbero svolgere attività di catalisi inestimabili che sono ben oltre le loro funzioni native.

Dichiarazione di interesse concorrente

Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.

Riconoscimento

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Beijing Natural Science Foundation (Grant No. 7192112); Programma di sponsorizzazione di Young Elite Scientists del CAST (Grant No. CACM− 2018− QNRC1− 02); Fondazione nazionale cinese per le scienze naturali (concessione n. 81402809); China Scholarship Council State Scholarship Fund (Grant No. 201906555010) e Science Foundation for Elite Young Scholars of Beijing University of Chinese Medicine (Grant No. 2018-JYB-XJQ006).

Appendice A. Dati supplementari

I dati supplementari a questo articolo possono essere trovati online su https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

Da: ' Clonazione molecolare e caratterizzazione biochimica di una nuova glicosiltransferasi cumarinicaCtUGT1daCistanche tubulose' diXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

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