Effetti antitumorali e antinfiammatori degli oligosaccaridi dell'estratto di Cistanche Deserticola sulla lesione del midollo spinale

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hong Zhang, et al

Astratto

Nel presente studio, gli effetti farmacologici degli oligosaccaridi daCistanchedeserticoestrattoSuinfiammazione, sono stati studiati lo stress ossidativo e l'apoptosi nei ratti albini maschi con lesione del midollo spinale. La perossidazione lipidica, GSH, catalasi, superossido dismutasi, acetilcolina esterasi, GPx, ROS e acido nitrico erano significativamente alterati nei ratti con lesione del midollo spinale. I livelli di espressione dell'mRNA di IL-6, TNF-, cicloossigenasi-2, iNOS,p53, caspasi-3, Bax e pro-NGF sono stati ridotti di N20 percento dopo l'integrazione dell'estratto. Anche i livelli di espressione proteica della caspasi-3 e del pro-NGF sono stati ridotti di N20 percento. Il numero di cellule p53 positive era 1, 79, 54, 33 e 19 nei gruppi GI-GV, rispettivamente, e il numero corrispondente di cellule caspasi-3 positive era 2, 87, 51,23 e 14. Sulla base dei risultati attuali, l'uso di oligosaccaridi daCistanchedeserticoestratto era efficace controinfiammazione, stress ossidativo e apoptosi nei ratti albini maschi con lesioni del midollo spinale.

Parole chiave:Cistanche deserticola, Infiammazione da stress ossidativo, ApoptosiRatti

1. Introduzione

La lesione del midollo spinale comporta un danno al midollo spinale che porta ad un'alterazione funzionale con perdita di sensibilità, muscoli e funzione autonomica [1]. Inoltre, l'apoptosi può essere indotta negli oligodendrociti e nei neuroni, portando a disfunzioni del midollo spinale dovute alla demielinizzazione e alla degenerazione assonale [2,3]. La lesione del midollo spinale induce un notevole stress ossidativo einfiammazionedopo l'inizio dell'apoptosi negli oligodendrociti e nei neuroni [2,4]. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e le citochine proinfiammatorie vengono rilasciate durante la neurodegenerazione e la microglia sono vitali durante i processi neurodegenerativi e infiammatori [5-7]. Le interleuchine (IL) sono importanti citochine coinvolte in vari processi immunologici [8]. Yune et al., [9] hanno riportato che il fattore di crescita del nervo pro (pro-NGF) rilasciato dalla microglia porta alla morte cellulare apoptotica. Pertanto, nuovi e potenti agenti terapeutici contro lo stress ossidativo einfiammazionesono necessari.

La piantaCistanchedeserticoè comunemente noto come succiamele del deserto ed è un membro oloparassitario della famiglia delle Orobanchaceae [10].Cistanche deserticomanca di clorofilla e ottiene acqua e sostanze nutritive in modo parassitario dal saxaul bianco (Haloxylon persicum) e dal saxaul nero (Haloxylon ammodendron). IlCistanchedeserticopianta perenne, conosciuta come Rou Cong Rong, può raggiungere una dimensione di 160 cm e ha fiori gialli. È ampiamente abbondante in Cina e Mongolia [11] e, tradizionale medicina cinese, è un'ottima risorsa per il trattamento di diverse malattie. Serve anche come trattamento erboristico primario per rinvigorire lo Yang e tonificare i reni [11]. Koo et al. [12] hanno riportato che i glicosidi diCistanchedeserticoagiscono come sostanze efficaci nel sistema nervoso centrale (SNC). Diversi ricercatori hanno riportato le proprietà anti-apoptotiche, antinfiammatorie e antiossidanti diCistanchedesertico[13,14]. Gli antiossidanti di origine alimentare e le molecole antinfiammatorie possono fungere da sostanze chemiopreventive contro le malattie croniche [15]. Dati i suddetti benefici terapeutici, l'efficacia terapeutica degli oligosaccaridi daCistanchedeserticoestrarre controinfiammazione, stress ossidativo e apoptosi sono stati studiati nel presente studio utilizzando un modello di ratto albino maschio con lesione del midollo spinale.

2. Materiali e metodi

2.1. Materiali

Primer di fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF- ), IL-6, ciclossigenasi, ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS), p53, Bax, caspasi-3, BCL-2,pro-NGF , e la gliceraldeide {7}}fosfato deidrogenasi (GAPDH) sono state acquistate da Thermo Fisher Scientific (Pechino, Cina). Anticorpi primari per caspasi-3 (AV00021), p53 (P5813-100UL), anti-perossidasi IgG monoclonale di capra/pecora (A9452) e isotiocianato di fluoresceina IgG anti-topo (FITC; F{{15} }ML) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich China, Inc. (Shanghai, PR China).

2.2. Ratti

Ratti maschi di ceppo albino Wistar (180–220 g) sono stati acquistati dalla casa degli animali del West China Hospital, Università di Sichuan, Cina. Ai topi veniva fornito cibo e acqua ad libitum. A 12-h light: 12-h darkcycle è stato mantenuto in gabbie per ratti in polipropilene in condizioni di umidità relativa. Tutti gli esperimenti sui ratti sono stati approvati dal comitato etico del WestChina Hospital, Sichuan University, Cina. Sono state seguite tutte le linee guida internazionali, nazionali e istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali.

2.3. Induzione di lesione del midollo spinale

La lesione del midollo spinale è stata indotta da un'incisione chirurgica longitudinale dopo l'esposizione all'alotano (1,5 percento). L'intera procedura chirurgica è stata condotta a temperatura ambiente. L'incisione è stata eseguita dalle vertebre inferiori a quelle medio-toraciche sul retro dell'animale. Un peso A20–25 g è stato posizionato sulla superficie Th12 esposta per 30 minuti per indurre lesioni. Pelle e muscoli sono stati suturati dopo la rimozione del peso dalla superficie Th12 ed è stata indotta una paralisi temporanea riproducibile negli arti inferiori [16,17]. I ratti sono stati mantenuti per 24 ore in condizioni appropriate e sotto controllo veterinario.

2.4. Preparazione dell'estratto di Cistanche deserticola e analisi quantitativa

La piantaCistanchedesertico(1 kg) è stato raccolto dalla provincia di Gansu, in Cina, essiccato all'aria e polverizzato utilizzando un tritacarne elettrico. La polvere è stata estratta in etanolo (70 percento) per 60 minuti, filtrata e concentrata a pressione ridotta. Il concentrato è stato essiccato sottovuoto in polvere [18]. Analisi quantitativa diCistanchedeserticol'estratto è stato eseguito utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), come precedentemente descritto [11].

2.5. Trattamento

I gruppi sperimentali erano i seguenti: gruppo I (GI), ratti di controllo normali; gruppo II (GII), ratti con lesioni del midollo spinale (controlli fittizi); egruppi III–V (GIII–V), ratti con lesioni del midollo spinale che ricevono 100, 200 o 400 mg/kg di oligosaccaridi daCistanchedeserticoestrarre, rispettivamente. Ogni gruppo conteneva sei ratti eCistanchedeserticol'estratto è stato somministrato per via orale ai ratti per 6 settimane consecutive.

2.6. Raccolta del sangue

Alla fine del trattamento, il sangue (5-6 ml) è stato raccolto mediante una siringa da 5 ml con un ago 23G1 attraverso la puntura cardiaca e i ratti sono stati anestetizzati con ketamina cloridrato (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo). peso) e sacrificato per decapitazione.

2.7. Preparazione dell'omogeneizzato tissutale

Alla fine del trattamento, i ratti sono stati anestetizzati con ketamina cloridrato (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e sacrificati per decapitazione. Campioni di midollo spinale (12 mm) sono stati raccolti dall'area operata. I tessuti del midollo spinale sono stati tagliati in piccoli pezzi e omogeneizzati in tampone Tris-HCl (pH 7,4, 50 mM) a 6000 rpm per 5 minuti. L'omogeneizzato è stato centrifugato e il surnatante è stato raccolto per ulteriori esperimenti. Tutte le preparazioni omogeneizzate e surnatanti sono state eseguite a 4 gradi.

2.8. Biomarcatori dello stress ossidativo

La perossidazione lipidica è stata determinata in base al contenuto di malondialdeide (MDA) misurando le specie reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS). Il prodotto finale è stato misurato a 534 nm [19]. I ROS sono stati determinati utilizzando il test della diclorofluoresceina [20]. Il contenuto ridotto di glutatione (GSH) è stato determinato misurando il prodotto finale a 405 nm [21]. Le attività degli enzimi della superossido dismutasi (SOD), della glutatione perossidasi (Gpx), della catalasi e dell'acetilcolinesterasi (AChE) sono state misurate mediante spettrofotometria [19].

2.9. Marcatori infiammatori

I livelli sierici di TNF e IL-6 sono stati determinati per tutti i gruppi [22]. Il contenuto di nitrito è stato misurato come indice del livello di ossido nitrico (NO) ed è stato espresso in mM [23,24]. I livelli di espressione dell'mRNA di TNF-, IL-6, iNOS, cicloossigenasi{7}} e GAPDH sono stati determinati secondo Moon et al. [25]. I primer utilizzati in questo studio sono mostrati nella Tabella 1.

2.10. Biomarcatori dell'apoptosi

I livelli di espressione dell'mRNA di caspasi-3, p53, bcl-2, bax, pro-NGF e GAPDH sono stati determinati secondo Moon et al. [25]. I livelli di espressione proteica di caspase-3, p53, bcl-2, bax, pro-NGF e GAPDH sono stati determinati secondo Lobos et al. [26]. La colorazione TUNEL di caspasi-3 e p53 è stata eseguita in sezioni neuronali [25]. I primer utilizzati per RT-PCR sono riportati nella Tabella 1.

2.11. analisi statistiche

I valori sono presentati come medie con un errore standard della media (SEM). Il controllo eCistanchedeserticoi gruppi trattati con l'estratto sono stati confrontati utilizzando il test t di Student non accoppiato. Per i confronti multipli è stata utilizzata l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). I valori P ˂0.05 sono stati considerati indicativi della significatività statistica.

3. Risultati

Nel presente studio, l'efficacia terapeutica degli oligosaccaridiCistanche deserticoestrarre controinfiammazione, ossidativofatica, e l'apoptosi nei ratti albini maschi con lesioni del midollo spinale. È stata osservata la presenza di oligosaccaridi (78,68 percento), acteoside (9,29 percento), echinacoside (6,34 percento) e 8- acido epiloganico (5,75 percento)Cistanche deserticoestrarre (Fig. 1). Il contenuto di MDA, misurato come prodotto finale della perossidazione lipidica, era di 22,58 nmol/g nei ratti di controllo normali (GI) ed era drasticamente aumentato del 179,5% nei ratti di controllo fittizi (GII). Trattamento di ratti con oligosaccaridi daCistanchedeserticoestratto ha ridotto significativamente il contenuto MDA del 50,1 percento nel gruppo GV (Tabella 2, P b 0,05). Il contenuto di GSH era 85,31 mg/g nel gruppo GI ed è stato drasticamente ridotto del 61,1 per cento nel gruppo GII. Trattamento conCistanchedeserticoestratto nei ratti con lesioni del midollo spinale ha aumentato significativamente il contenuto di GSH del 121,6 percento nel gruppo GV (Tabella 2, P b0.05).

L'attività della SOD era di 6,2 U/mg nel gruppo GI ed era sostanzialmente ridotta del 51,1% nel gruppo GII. Ratti con lesioni del midollo spinale integrati con oligosaccaridi daCistanchedeserticol'estratto ha mostrato un aumento significativo dell'attività SOD, del 91,4 percento nel gruppo GV (Tabella 2, P b0.05). L'attività della catalasi era di 12,8 U/g nel gruppo GI ed era sostanzialmente ridotta del 59,3% nel gruppo GII. Ratti con lesioni del midollo spinale integrati con oligosaccaridi daCistanche deserticoestratto ha mostrato un aumento significativo dell'attività della catalasi, dell'106,1 percento nel gruppo GV (Tabella 2, P b 0.05). L'attività GPx era 0,87 (mg/proteina) nel gruppo GI ed era ridotta del 55,2% nel gruppo GII. L'attività GPx è stata aumentata del 100 percento nel gruppo GV (Tabella 2, P b 0,05). L'attività AChE era 9,3 (μmol/min/mg di proteine) nel gruppo GI ed era ridotta del 54,8% nel gruppo GII. Ratti con lesioni del midollo spinale integrati con oligosaccaridi daCistanchedeserticoestratto ha mostrato un aumento significativo dell'attività AChE, rispettivamente del 26,2, 57,1 e 107,1% nei gruppi GIII, GIV e GV (Tabella 2, P b 0,05).

I ROS sono stati misurati ed espressi in unità di fluorescenza relativa (RFU): i ROS intracellulari erano 44,23 nel gruppo GI, che è stato aumentato del 349 percento nel gruppo GII. Integrazione con oligosaccaridi daCistanchedeserticogli estratti hanno ridotto significativamente i livelli di ROS intracellulari del 61,9 percento nel gruppo GV (Fig. 2A, P b 0.05). Il contenuto di nitrito è stato misurato come indice del livello di NO ed espresso inmM. Il livello di NO era 3,7 (mM) nel gruppo GI, che è stato aumentato del 349 percento nel gruppo GII. Integrazione con oligosaccaridi daCistanchedeserticoestratto ha ridotto significativamente i livelli di NO del 63,6% nel gruppo GV (Fig. 2B, P b 0.05).

I livelli di IL{0}} e TNF- sono stati misurati ed espressi come pg/mg di proteine. I livelli di IL-6 e TNF- sono stati sostanzialmente aumentati, rispettivamente del 912,7 e del 695,4 percento nel gruppo GII. Tuttavia, l'integrazione con oligosaccaridi daCistanchedeserticoestratto ha ridotto significativamente il livello di IL{{0}} e il livello di TNF di N60 percento nel gruppo GI rispetto al gruppo GII (Fig. 3, P b 0.{{16 }}5). L'espressione dell'mRNA di marcatori infiammatori, come IL-6, TNF-, cicloossigenasi-2 e iNOS, è stata quantificata ed espressa come cambiamenti di piega. I livelli di espressione dell'mRNA di IL 6, TNF-, ciclossigenasi-2 e iNOS sono stati aumentati di 0.72-, 0.81-,0.54- , e 0.{19}}fold nel gruppo GII, rispettivamente. Integrazione conCistanchedeserticoestratto ha ridotto i livelli di espressione dell'mRNA di IL{0}}, TNF-, ciclossigenasi{2}} e iNOS di N20 percento nel gruppo GV rispetto al gruppo GII (Fig. 4, P b 0,05).

È stata anche determinata l'espressione dell'mRNA dei marcatori apoptotici caspasi{{0}}, p53,bcl-2, bax e pro-NGF. I livelli di espressione dell'mRNA di p53, caspase-3, bax e pro-NGF sono stati aumentati di 0.97-,1.{{10}}, 1.{ {12}} e 0.76-fold nel gruppo GII, rispettivamente, e il livello di espressione dell'mRNA bcl-2 è stato ridotto di 0.67-fold . Il trattamento dell'estratto ha ridotto significativamente i livelli di espressione di mRNA di p53, caspase-3, bax e pro-NGF di N30 percento, mentre il livello di espressione di mRNA di bcl-2 è aumentato del 178 percento (Fig. 5, Pb 0,05). Sulla base della western blotanalysis, i livelli di caspasi-3 e pro-NGF sono aumentati significativamente, rispettivamente di 0.{30}}volte e 0.{32}}volte, nel gruppo GII. Integrazione con oligosaccaridi daCistanchedeserticoestrarre la caspasi {{0}} significativamente ridotta e i livelli di espressione della proteina pro-NGF di N20 percento nel gruppo GI rispetto al gruppo GII (Fig. 6, P b 0,05). Il test di colorazione TUNEL è stato utilizzato per rilevare il numero di cellule p53- e caspasi-3-positive. Il numero di p53-cellule positive era rispettivamente di 1, 79, 54, 33 e 19 nei gruppi GI-GV. Il numero di cellule positive alla caspasi-3- era rispettivamente di 2, 87, 51, 23 e 14 nei gruppi GI–GV (Figg. 7–8, P b 0,05).

4. Discussione

Nel presente studio, l'efficacia terapeutica degli oligosaccaridiCistanchedeserticoestrarre controinfiammazione, lo stress ossidativo e l'apoptosi nei ratti albini maschi con lesioni del midollo spinale sono stati studiati. Liuet al. [27] hanno riferito che l'integrazione con un antiossidante potrebbe essere efficace contro diverse malattie neurodegenerative. La presenza di echinacoside (glucoside feniletanoide) è stata segnalata nelCistanchedeserticoestratto [10], e diversi ricercatori hanno dimostrato le proprietà antinfiammatorie e antinocicettive diCistanche desertico[28,29]. Nel presente studio, oligosaccaridi, acteoside, echinacoside e 8- acido epiloganico sono stati osservati come costituenti principali dell'estratto di Cistanche deserticola.

Difetti comportamentali migliorati del TNF e apoptosi sono stati osservati nelle cellule neuronali SH-SY5Y dopo il trattamento con echinacoside [30,31]. Nan et al. [32] hanno riportato una riduzione dei livelli di TNF-, T-tau e IL-1 nei pazienti con malattia di Alzheimer e un migliore recupero dell'atrofia dell'ippocampo e delle capacità cognitive dopo l'integrazione con Cistanche herba. Gli effetti terapeutici diCistanchedeserticoestraiinfiammazione, stress ossidativo e apoptosi non sono stati segnalati in precedenza. Questo è il primo rapporto sugli effetti farmacologici diCistanchedeserticoestratto in un modello di lesione del midollo spinale.

Diversi ricercatori hanno riferito che il trattamento con acteoside riduce significativamente lo stress ossidativo e intestinaleinfiammazionetopi indotti da malattie infiammatorie intestinali [33]. Nome et al. [34] hanno riportato che l'attività antinfiammatoria dell'isoacteoside dell'Abeliophyllum distichum nei mastociti umani. Nel modello murino sono stati riportati glicosidi antinfiammatori fenilpropanoidi da foglie di Clerodendron trichotomum [35]. Zhou et al. [36] hanno riportato che l'attività antinfiammatoria degli oligosaccaridi nelle cellule macrofagiche RAW 264.7. Sono stati riportati monomeri oligosaccaridi per l'inibizione diinfiammazionenei macrofagi stimolati da LPS attraverso la soppressione delle vie MAPK e NF-κB [37].

Fahnestock et al. [38] hanno riferito che il pro-NGF è la forma predominante nel cervello ed è aumentato nei pazienti con malattia di Alzheimer. Diverse proteine ​​scisse, oltre a pro-NGF, attivano risposte anti-apoptotiche [39]. Il rapporto tra NGF maturo e pro-NGF gioca un ruolo critico nel bilanciamento della sopravvivenza cellulare e del tasso di morte [40]. Ke Zhang et al. [18] hanno riportato una ridotta formazione di tumori e topi con una maggiore durata della vita integrati conCistanchedeserticoestratto. Effetti neuroprotettivi diCistanchedeserticoestratto sul danno indotto da neurotossina è stato precedentemente riportato [41]. Xuan e Liu et al. [42] hanno riportato miglioramenti nella funzione immunitaria, nella memoria, nell'apprendimento e nell'antiossidazione nei topi integrati conCistanchedeserticoestratto. L'integrazione con l'estratto di Cistanche deserticola ha ridotto i livelli di MDA e di GPx e SOD elevati in un modello di ratto con ischemia-riperfusione. Inoltre, è stata osservata una downregulation della caspasi-3, con un concomitante aumento del rapporto bax/BCL-2 [43], che è coerente con i nostri risultati che mostrano livelli ridotti di marcatori ossidativi, infiammatori e apoptotici nella colonna vertebrale ratti con lesioni del cavo integrato conCistanchedeserticoestratto.

5. conclusione

In sintesi, l'analisi quantitativa ha rivelato la presenza di oligosaccaridi, acteoside, echinacoside e 8-acido epiloganico inCistanchedeserticoestratto.Infiammazione, stress ossidativo e marcatori di apoptosi sono stati sostanzialmente ridotti nei ratti con lesioni del midollo spinale integrati con oligosaccaridi dall'estratto di Cistanche deserticola.

Limiti dello studio

Questo studio, sebbene riveli gli effetti antitumorali e antinfiammatori,Cistanchedeserticoestratto ha alcune limitazioni. Abbiamo notato l'effetto acuto diCistanchedeserticoestratto sul tumore einfiammazionenella lesione del midollo spinale.

Finanziamento

Questo studio è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31370984, 81501879, 31870961, GZ1219), Department of Science & Technology of Sichuan Province (No. 2015HH004) Scientific Research Project by Health and Family Planning Commissionof Sichuan Province (No. 100097).

Interessi conflittuali

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Contributi degli autori

Hong Zhang, Zhou Xiang, Xin Duan e Juan li Jiang sono stati condotti esperimenti e hanno redatto il manoscritto. Yi Ming Xing, Cheng Zhu e Qiang Song hanno raccolto revisioni della letteratura, condotto analisi di dati grezzi e interpretazioni di dati. Qin Rong Yu ha rivisto il contenuto intellettuale del manoscritto.

Da: 'Antitumorale eanti-infiammatorioeffetti degli oligosaccaridi daCistanchedeserticoestratto sulla lesione del midollo spinale' diHong Zhang, et al

---H.Zhang et al. / Giornale internazionale di macromolecole biologiche 124 (2019) 360–367

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