Nanoparticelle di ossido di zinco antivirali mediate da esperidina e studio di confronto in silico tra fenolici antivirali come anti-SARS-CoV-2

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ASTRATTOLa sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), che ha causato il coronavirus (COVID-19), è il virus responsabile di oltre 69.613.607 milioni di infezioni e di oltre 1.582.966 decessi in tutto il mondo. Tutte le misure e i protocolli di trattamento sono stati considerati solo di supporto e non curativi. Durante questa attuale pandemia di coronavirus, la ricerca di farmaci complementari e integrativi farmaceutici o tradizionali per aiutare con la prevenzione, il trattamento e il recupero è stata vantaggiosa. Questi fitofarmaci e nutraceutici possono essere più economici, disponibili, sicuri e avere effetti collaterali inferiori. Questo è uno studio di confronto in silico di dieci fenoliciantiviraleagenti contro SARS-CoV-2, nonché l'isolamento del metabolita più attivo da fonti naturali. Sono state quindi preparate anche nanoparticelle di ossido di zinco (ZnO NP) utilizzando questi metaboliti come agente riducente. Tutti i composti testati hanno mostrato un'attività anti-SARS-CoV-2 prevista.Esperidinaha mostrato il punteggio di docking più alto, questo ci porta ad isolarlo dalle bucce d'arancia e ne abbiamo confermato la struttura mediante analisi spettroscopiche convenzionali. Inoltre, la sintesi di nanoparticelle di ossido di zinco esperidina è stata caratterizzata da UV, IR, XRD e TEM. L'attività antivirale in vitro dell'esperidina e delle NP ZnO è stata valutata contro il virus dell'epatite A come esempio di virus a RNA. Tuttavia, le NP ZnO e l'esperidina hanno mostrato attività antivirale contro HAV ma le NP ZnO hanno mostrato un'attività maggiore rispetto aesperidina. Pertanto, l'esperidina e le sue nanoparticelle di ZnO mediate sono agenti antivirali volontari e sono necessari ulteriori studi contro SARS-CoV-2 da utilizzare come potenziale trattamento.

Parole chiave: SARS-CoV-2 Nutraceutici Docking molecolare Nanoparticelle di ossido di zinco Esperidina

1. Introduzione

L'attuale pandemia di COVID-19 è responsabile di oltre 69 milioni di infezioni e oltre 1,5 milioni di decessi in tutto il mondo fino ad oggi, 2,3 milioni di infezioni e oltre 55,{7}} decessi in Africa e oltre 119,{{9} } contagi e oltre 6000 morti in Egitto [1]. Nella maggior parte delle persone infette da SARS-CoV-2 i sintomi includono malattie respiratorie da lievi a moderate che potrebbero guarire senza consultare il medico. Tuttavia, gli individui con malattie croniche come malattie cardiovascolari, diabete, malattie respiratorie croniche o cancro hanno un rischio maggiore di sviluppare sintomi respiratori acuti. La trasmissione del COVID{14}} viene impedita mantenendo la distanza sociale, lavandosi le mani o utilizzando la sterilizzazione con alcol e non toccando il viso. Dove si trasmette attraverso goccioline di saliva dal naso della persona quando un individuo infetto tossisce o starnutisce [1]. Tutte le misure e i protocolli sono stati considerati solo di supporto ma non curativi. Tuttavia, ci sono molti studi clinici in corso che valutano potenziali farmaci [1]. Da quando si è affermato che il COVID-19 è una pandemia globale, è emersa la necessità di cercare farmaci o medicine tradizionali, complementari e integrative per la prevenzione, il trattamento e il recupero [2].

I prodotti naturali sono fonti non sfruttate di composti che possono essere utilizzati nella prevenzione e nel trattamento di diverse malattie. Inoltre, i composti naturali sono spesso serviti come farmaci candidati più economici e più sicuri contro diverse malattie, è stato riferito che molti composti nutraceutici hannoattività antivirali[3]. Nell'ultimo decennio, il numero di nuovifarmaci antiviraliestratto da fonti naturali è aumentato in modo significativo. I prodotti naturali aiutano nella scoperta di farmaci antivirali, direttamente o indirettamente [4].

Pertanto, lo screening di librerie di composti naturali mediante metodi di screening computazionale come l'aggancio molecolare può far risparmiare tempo e denaro nello sviluppo di farmaci [3]

D'altra parte, hanno mostrato composti contenenti Znic (Zn).proprietà antiviraliverso un certo numero di virus in base a tali processi fisici come attaccamento di virus, infezione da virus e rimozione del rivestimento. Oltre all'inibizione della proteasi virale e della polimerasi [5]. In generale, lo Zn è un elemento essenziale che si trova nei tessuti del nostro corpo come i muscoli, il cervello, la pelle, le ossa. È anche un componente essenziale di diversi sistemi enzimatici coinvolti nel metabolismo e nella biosintesi degli acidi nucleici e delle proteine ​​[5].

Va notato che le NP ZnO sono più facilmente assorbite dall'organismo rispetto allo stesso zinco. Gli ZnO NP sono attualmente utilizzati nell'industria alimentare come additivi e negli imballaggi. Inoltre, ZnO è stato classificato come sostanza sicura dalla Food and Drug Administration statunitense. Pertanto, le NP ZnO sono interessanti per l'uso in applicazioni biomediche. Le NP ZnO sono caratterizzate dal loro basso costo economico e dalla bassa tossicità, pertanto le NP ZnO possono essere ampiamente utilizzate per applicazioni biomediche come antibatteriche, antitumorali, antidiabetiche, antinfiammatorie, somministrazione di farmaci e guarigione delle ferite [6].

È stato recentemente segnalato che i composti contenenti Zn mostrano attività anti-SARS-CoV-2 [7] Pertanto, i farmaci contenenti Zn sono comunemente prescritti nei protocolli di protezione COVID-19. Di conseguenza, la sintesi verde delle NP ZnO merita un'attenzione specifica.

In questo lavoro, un certo numero di composti fenolici fitofarmaceutici provenienti da piante e alimenti medicinali comunemente usati (nutraceutici) sono sottoposti a uno studio molecolare in silico per esplorare l'attività antivirale contro la proteasi principale (Mpro) di SARS CoV{0}} e sperimentalmente il composto con il punteggio di docking più alto sarà testato accanto alle sue nanoparticelle di ZnO mediate contro il virus dell'epatite A (HAV), un virus a RNA simile al SARS−COV- 2.

2. Materiali e metodi

2.1. Aggancio molecolare

La proteasi principale (Mpro) è un importante enzima codificato dal genoma del coronavirus, con un ruolo essenziale nella replicazione del virus e nel processo di trascrizione, il che lo rende un bersaglio farmacologico adatto per SARS-CoV-2. Per rivelare il meccanismo di inibizione di composti polifenolici selezionati come rutina, corilagina, diosmina, miricetina-3-O-xilosil-(1→2)-ramnoside, epigallocatechina-3-O-gallato,esperidina, lioniresinolo, miricetina, naringenina e quercetina 3-O-glucuronide rispetto alla struttura cristallina di SARS-CoV-2 Mpro (6lu7) [8] che sono stati utilizzati con una risoluzione di 2,1 Aᵒ. È stato utilizzato per l'aggancio molecolare in silico. Questa proteina è composta da due polipeptidi noti come protomeri A e B. Questo dimero ha una simmetria cristallografica lungo un duplice asse. Contiene tre domini; il dominio I (residui 8–101), il dominio II (residui 102–184) con una struttura a foglio antiparallelo e il dominio III (residui 201–303) ha cinque eliche disposte come gruppi sferici antiparalleli. Dove il dominio III è connesso al dominio II da una regione ad anello lungo (residui 185–200). SARS-CoV-2, Mpro, ha un'attività catalitica accoppiata Cys-His, in cui il sito di legame del substrato si trova in una fessura tra il dominio I e il dominio II [8] come in Fig. 1. Nel presente studio , le procedure di docking molecolare sono state eseguite dal servizio Swiss Dock [9]. Utilizzando EADock DSS, che esegue il blind docking, le sue energie CHARMM sono state valutate su una griglia in cui le energie più favorevoli sono state stimate con FACTS e raggruppate. Questi cluster possono essere visualizzati e interpretati utilizzando Chimera come riportato in letteratura [10].

2.2. Materiali vegetali, estrazione e isolamento

Le scorze d'arancia (500 g) sono state acquistate da una fabbrica di succhi di frutta locale. Le bucce d'arancia (200 g) sono state estratte con 2 L di acqua distillata calda fino ad esaurimento. L'estratto è stato filtrato ed evaporato per diventare più concentrato sotto vuoto. L'estratto di acqua è stato partizionato da CH2Cl2 seguito da butanolo. La sottofrazione del butanolo è stata applicata a fogli di carta da filtro Whatman da 3 mm usando BAW come eluente [12,11] per produrre una banda viola scuro maggiore sotto la luce ultravioletta (UV). La banda viola scuro è stata isolata e macerata in metanolo, quindi evaporata sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotante. Il materiale essiccato è stato applicato a una colonna Sephadex LH -20 utilizzando EtOH/H2O (1:1) come eluente per ottenere 120 mg diesperidina.

2.3. Risonanza magnetica nucleare (NMR)

Gli spettri di risonanza magnetica nucleare (NMR) 1H sono stati registrati su uno spettrometro NMR Bruker Avance III, 400 MHz e 100 MHz per 13C NMR. Gli spostamenti chimici 1H (δ) sono stati misurati in ppm, rispetto ai cambiamenti chimici TMS e 13C-NMR in dimetilsolfossido-d6 e convertiti nella scala TMS aggiungendo 39,5.

2.4. Sintesi di nanoparticelle di ossido di zinco (ZnO NPs)

con 500 mg di acetato di zinco sciolti in 50 ml di acqua bidistillata e scaldati a bagnomaria bollente per 20 min. Cinque gocce di idrossido di ammonio sono state quindi aggiunte alla reazione per aumentare il pH a 12, dove si forma un precipitato di ZnO NPs. La miscela è stata lasciata per mezz'ora per la completa riduzione dell'acetato di zinco a ZnO NPs. Il precipitato formato è stato centrifugato a 8000 rpm, seguito da due lavaggi con acqua bi-distillata e due lavaggi con etanolo per produrre pellet bianchi di ZnO NP dopo liofilizzazione.

2.5. Caratterizzazione di nanoparticelle metalliche

2.5.1. Analisi spettrale UV-vis

Le preparazioni di ZnO NPs sono state esaminate utilizzando uno spettrofotometro UV, Shimadzu, UV{0}} (Shimadzu Corporation, Giappone). Gli spettri UV sono stati registrati tra 200 e 400 nm.

2.5.2. Analisi FT-IR

I gruppi funzionali delle nanoparticelle di ossido di zinco sintetizzate e del composto di esperidina sono stati caratterizzati utilizzando uno spettrometro FTIR 6100 (Jasco, Giappone) nell'intervallo di 4000 – 400 cm-1.

2.5.3. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

La morfologia e la dimensione delle particelle di ZnO NP mediate dall'esperidina sono state determinate da TEM (JEOL-JEM-1011, Giappone). Gocce della sospensione di nanoparticelle sono state poste su una griglia di rame rivestita di carbonio e il solvente è stato evaporato a temperatura ambiente prima di registrare l'immagine TEM.

2.5.4. Diffrazione dei raggi X (XRD)

Il modello di diffrazione dei raggi X ZnO NPs registrato con il diffrattometro a raggi X PANLYTICAL utilizzando la radiazione Cu K della lunghezza d'onda 1d706; =0.1541 nm nell'intervallo di scansione 21d703;=20-70∘.

2.6. Valutazione dell'attività antivirale

Lo screening antivirale è stato eseguito utilizzando il test di inibizione della placca presso il Centro regionale di micologia e biotecnologia (RCMB, Università di Al Azhar, Il Cairo, Egitto).

2.6.1. Linea cellulare di mammiferi

Le cellule Vero derivate dai reni di scimmia verde africana sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA).

Le cellule Vero sono state propagate nel mezzo Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) inattivato al calore, tampone HEPES, 1% di L-glutammina e 50 ug/mL di gentamicina. Tutte le cellule sono state coltivate a 37 ◦C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 e sono state sottocoltivate due volte per 7 giorni [14].

2.6.2. Valutazione della citotossicità

di esperidina e ZnO NP sono state aggiunte dopo 24 h dall'impianto. Diluizioni seriali doppie dei campioni testati (iniziati da 3000 ug/mL a 2 ug/mL) sono state aggiunte a monostrati cellulari confluenti dispensati in piastre per microtitolazione a fondo piatto 96- (Falcon, Jersey, NJ, USA ) utilizzando una pipetta multicanale. Le piastre per microtitolazione sono state incubate a 37°C in un'incubatrice umidificata con il 5% di CO2 per un periodo di 2 giorni. Sono stati utilizzati tre pozzetti per ciascuna concentrazione dei campioni esaminati. Le cellule di controllo sono state incubate senza campioni di test e con o senza DMSO.

Dopo il periodo di incubazione, la resa cellulare vitale è stata determinata mediante un test colorimetrico MTT [15]. La relazione tra le cellule sopravvissute e la concentrazione dei campioni testati è stata tracciata per ottenere le curve di sopravvivenza della linea cellulare Vero dopo il trattamento con i composti specificati. La concentrazione citotossica del 50% (CC50), la concentrazione richiesta per causare effetti tossici nel 50% delle cellule intatte, è stata stimata dai grafici della curva dose-risposta per ciascuna concentrazione utilizzando il software GraphPad Prism (San Diego, CA. USA). La concentrazione massima non tossica [MNTC] di ciascuna esperidina e le NP ZnO sono state determinate e utilizzate per ulteriori studi biologici.

2.6.3. Propagazione del virus

Il ceppo citopatogeno HAV HM175 (ATCC VR-1402) di HAV è stato propagato e analizzato in cellule Vero confluenti [16]. I virus infettivi sono stati enumerati determinando la dose infettiva della coltura tissutale del 50% con otto pozzetti per diluizione e 20 μL di inoculo per pozzetto utilizzando il metodo Spearman-Karber [17].

3. Risultati e discussioni

Dieci composti fenolici nutraceutici sono stati selezionati in base alla loro disponibilità e diffusione come forme farmaceutiche derivate da fonti alimentari nutritive naturali.

Questi nutraceutici erano diosmina, rutina, naringenina, quercetina 3-Oglucouronide, miricetina 3-O-xilosil-(1→2)-ramnoside, miricetina, epigallocatechina-3-O-gallato, corilagina e lyoniresinol. L'esperidina, la diosmina e la rutina sono ampiamente disponibili nei negozi farmaceutici con vari nomi commerciali e possono essere derivati ​​da vari alimenti nutritivi naturali segnalati per avere proprietà antivirali, ad esempio, è stato segnalato che l'esperidina dalle bucce di agrumi haattività antivirale[18]. Sulla base dello screening in silico, si prevedeva anche che l'esperidina colpisse il sito di interazione tra SARS-CoV-2 Spike e i recettori ACE2, bloccando così l'ingresso del virus nelle cellule polmonari umane. Pertanto, l'esperidina potrebbe essere un promettente farmaco profilattico contro COVID-19 [19].

Inoltre, la naringenina dalle bucce di agrumi è stata segnalata come agente antivirale contro il virus Zika [20], la rutina [21] ha mostrato risultati significativi come antivirale [19]. L'epigallocatechina del tè verde-3-ha l'O-gallatoeffetti antiviralicontro un certo numero di virus a DNA e RNA [22]. Corilagin previene il danno epatico inibendo la replicazione dell'HCV e modulando lo stress ossidativo [23]. Attività anti-HIV è stata segnalata per la miricetina e i suoi derivati ​​glicosilati [24]. Inoltre, è stato segnalato che diversi lignani hannoantiviraleproprietà [25].

3.1. Aggancio molecolare

Nella ricerca attuale, si è cercato di interpretare e supportare i risultati sperimentali riguardanti il ​​meccanismo di inibizione della proteasi principale COVID-19. Dieci composti polifenolici sono stati agganciati utilizzando Swiss Dock Server, in cui sono stati applicati approcci basati sui recettori a questi polifenoli. La struttura cristallina della proteasi Covid-19 6lu7, che adotta una forma a cuore, con due dimeri di subunità identiche e due siti attivi. un inibitore ad ampio spettro dovrebbe mirare al sito attivo His 41 e Cys 148 del progenitore coronavirus del pipistrello, come nella voce PDB 4yoi. Questo studio ha chiarito la modalità di legame dei composti fenolici alla struttura cristallina 6lu7 mediante docking molecolare (Fig. 2). Lo studio di docking ha confermato che l'esperidina può formare interazioni elettrostatiche con i residui di THR 25, LEU 27, His 41 e Gly143 mentre forma un'interazione pi-stacking con TYR 118 come elencato nella Tabella 1.

La maggior parte dei composti polifenolici ha mostrato attività di inibizione nella regione della fessura tra il dominio II, III (residui 185–200) e nel dominio I come si vede in Fig. 2 mentre nella Tabella 1. i composti polifenolici sono stati elencati in base alle loro energie di legame. La relazione di RMSD con la modalità di rilegatura nativa (la forma fisica completa (blu, asse X sinistro)) e l'energia (la forma fisica semplice (asse y rossa, destra)) è stata mostrata in Fig. A, (file di fornitura) . La modalità di aggancio per l'esperidina è stata mostrata in (Figg. B per SARS-CoV-2 Mpro e Fig. C per HAV 3C Proteinasi [26], struttura cristallina 2HAL), miricetina (Fig. D,1,2), diosmina (Fig. E 1,2), epigallocatechina-3-O-gallato (Figg. F1,2), rutina (Figg. G1,2), quercetina 3-O-glucuronide (Figg. H 1,2), corilagina (Figg. I1,2), miricetina (Figg. J1,2), naringenina (Figg. L1,2) e lioniresinolo (Figg. M1,2), nella scheda supplementare.

3.2. Isolamento e identificazione dell'esperidina

Poiché l'esperidina ha mostrato il punteggio di docking più alto, qui l'abbiamo isolata da un rifiuto alimentare (bucce d'arancia) ed è stata valutata la sua attività antivirale contro l'HAV (uno dei virus a RNA).

La frazione butanolica dall'estratto acquoso delle bucce d'arancia è stata applicata a fogli di carta da filtro Whatman usando BAW come eluente, per cui è stata osservata una banda viola scuro maggiore di natura flavonoidale sulla cromatografia su carta preparatoria. L'eluizione della banda viola scuro principale con metanolo ha portato all'isolamento di un composto puro la cui identità è stata confermata da 1 H, 13C come esperidina [27] come segue: 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 δ 5,50 (gg, J=12.2, 3,4 Hz, 1H, H-2), 2,78 (gg, J =3.24 Hz e 17,16, 1H, H{{22} }ax), 3,26 (dd, J=17.16, 8,22 Hz, 1H, H-3eq), 6,14 (brs, 1H, H{34}}), 6,12 (brs, 1H , H-8), 4,97 (d, J =7.2 Hz, 1H, H-1′′), 4,53 (s, 1H, H-1′′' ), 1,09 (d, J=6.2, 3H, CH3 di ramnosio). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 78,89 (C-2), 42,74(C{{64} }), 197,48 (C-4), 163,50 (C-5), 96,85 (C-6), 165,60 (C-7), 96,00 (C{{79} }), 162,96 (C-9), 103,79 (C-10), 131,35 (C-1′ ), 118,42 (C-2′ ), 146,92 (C{{ 94}}′ ), 148,43 (C-4′ ), 112,50 (C-5′ ), 114,60 (C-6′ ), 56,15 (O-Me), 99,91(C{ {109}}′′), 73,45 (C-2′′), 76,73 (C-3′′), 70,06 (C-4′′), 75,98 (C{{121 }}′′), 66,50 (C-6′′), 101,06 (C-1′′'), 70,73 (C-2′′'), 71,17 (C{{133 }}′′'), 72,53 (C-4′′'), 68,78 (C-5′′'), 18,29 (CH3 di ramnosio; C-6′′').

3.3. Formazione di nanoparticelle di ZnO

L'aggiunta di una soluzione di acetato di zinco alla soluzione di esperidina in un bagnomaria riscaldato fino a 80 ◦C seguita dall'aggiunta di alcune gocce di ammoniaca ha portato alla precipitazione di ZnO NPs [13].

3.3.1. Analisi UV

Il picco massimo di assorbimento per ZnO NP sintetizzato tramite esperidina ha mostrato un picco a 335 nm (Fig. 3a) confermando la formazione di ZnO NP [28]. ZnO su scala nanometrica ha lunghezze d'onda più corte rispetto al modello di assorbimento ZnO standard, in accordo con i rapporti secondo cui gli ossidi di materiale tendono ad avere lunghezze d'onda più corte e che i materiali su scala nanometrica tendono ad avere lunghezze d'onda più corte [29].

3.3.2. Analisi FT-IR di NP ZnO ed esperidina

Gli spettri FT-IR (Fig. 3b) delle NP ZnO preparate e dell'esperidina sono stati raccolti nell'intervallo di larghezza spettrale da 400 a 4000 cm − 1. Dove mostravano picchi per i gruppi O – H che si allungavano intorno a 3546,04, 3478,29 e 3421,80 cm − 1 rappresentano gruppi O–H di esperidina e circa 3382,99 cm− 1 per ZnO NP. Le porzioni aromatiche sono state confermate dal doppio legame di carbonio che si estende a 2918,50 cm−1. Vibrazione flessionale dell'alcolico –CO–H confermata dalla presenza di un picco a 1096,12 cm− 1. Le bande caratteristiche delle modalità di allungamento delle ZnO NPs sono assegnate a 542,9 e 891,2 cm− 1 [13,30].

3.3.3.Analisi TEM

L'analisi TEM è stata eseguita su microscopi elettronici a trasmissione a bassa e alta risoluzione e ha mostrato la formazione di NP ZnO esagonali con dimensioni delle particelle comprese tra 20 e 30 nm, Fig. 4.

3.3.4. Analisi XRD

La presenza di ZnO NP e l'indagine delle loro caratteristiche strutturali sono state confermate dalla diffrazione dei raggi X (XRD), Fig. 5. Le ZnO NP mediate dall'esperidina flavonoide hanno mostrato picchi con valori di 2θ identificati a 31.618◦, 34.334◦, 36.161◦, 47.504 ◦, 56.440◦, 62.727◦, 66.245◦, 67.864◦ e 68.925◦ corrispondenti a (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112) e (201). Questi picchi sono stati abbinati a quelli della scheda dati (00− 003-0888).

La dimensione del cristallo di ZnO NP è stata calcolata in 27,73 nm. Questi dati sono molto simili alle misurazioni TEM. Per calcolare la dimensione del cristallo applichiamo l'equazione di Scherrer

Dimensione del cristallo {{0}} (0,9 x λ)/ (dcosθ)

Θ=2θ/2, d=l'intera larghezza a metà dell'intensità massima del picco (in Rad), λ =0.154060 nm

3.4. Attività antivirale

3.4.1. Valutazione della citotossicità nei confronti delle cellule di Vero

I due campioni di esperidina e NP ZnO hanno mostrato una concentrazione citotossica cellulare del 50% (CC50)=620,8 ± 34,6 e 243,7 ± 12,7 ug/mL, rispettivamente. Come mostrato nelle Figg. K. & L., suppl. file e i valori sono stati elencati rispettivamente nelle tabelle C e D. Quindi, questi composti sono stati testatieffetti antiviralicontro HAV alla massima concentrazione non tossica (MNTC) utilizzando il metodo di dosaggio della placca illustrato in Fig. M. (file supplementare).

3.4.2. Attività anti-HAV

È stato riportato che i flavonoidi hanno attività antivirali sia in vivo che in vitro [31]. È stato riportato che il meccanismo d'azione di alcuni flavonoidi contro l'HIV (anch'esso un virus a RNA) è dovuto all'inibizione della fosforilazione delle proteine ​​mediata dalle citochine. Va inoltre notato che la segnalazione di fosforilazione mediata dalle citochine è aumentata nell'infezione da COVID-19, portando alla fosforilazione di numerose proteine ​​del citoscheletro. Pertanto, i flavonoidi, che includono l'esperidina, possono inibire la fosforilazione delle proteine, che a sua volta porta a una potente attività antivirale e alla prevenzione delle infezioni di altre cellule [32]. È stato anche riportato che le NP ZnO hanno attività antivirale [32,33].

Composti contenenti Zn segnalati che interessano diverse fasi dei cicli di replicazione virale come l'inattivazione del virus, l'inibizione della rimozione del rivestimento virale, la trascrizione del genoma virale, la traduzione della proteina virale e l'elaborazione delle poliproteine. Va notato anche che l'attività dipende dal tipo di virus e dalla concentrazione di composti contenenti zinco [34].

Nel nostro studio, i monostrati confluenti di cellule Vero sono stati infettati con diluizioni fisse del virus HAV. Dopo l'incubazione, l'inoculo è stato rimosso e sostituito con MEM privo di siero contenente l'1,5% di carbossimetilcellulosa. Le cellule sono state quindi incubate consentendo al virus di formare le placche. Le cellule sono state fissate per 2 ore a 25°C con formaldeide che è stata aggiunta direttamente al mezzo fino ad una concentrazione del 5%. Le cellule fisse sono state ampiamente lavate con acqua prima di essere colorate con una soluzione contenente l'1% di cristalvioletto e il 10% di etanolo per 30 minuti. Dopo il risciacquo con acqua, è stato contato il numero di placche e sono stati calcolati i titoli (conteggi) dei virus. Gli effetti antivirali dei due campioni testati, esperidina e ZnO NPs contro HAV alla concentrazione massima non citotossica (MNCC) sono mostrati nella Tabella B (file supplementare). Le nanoparticelle di ossido di zinco hanno mostrato un'attività maggiore rispetto all'esperidina a concentrazioni relativamente basse a causa dell'elevata area superficiale e delle piccole dimensioni delle particelle, che hanno aumentato l'attività delle nanoparticelle di ossido di zinco. Dalla tabella B, Fig. T, (file supplementare). Sia l'esperidina che le NP ZnO hanno mostrato attività antivirale contro il virus dell'epatite A (HAV) con percentuali del 44,75 e 58,83 percento alla massima concentrazione non citotossica e EC50 pari rispettivamente a 72,4 e 176,3 ug/mL, come mostrato nelle tabelle A e B (file supplementare).

4. Conclusioni

L'attuale malattia pandemica COVID-19 è responsabile di molta morbilità e mortalità in tutto il mondo. I composti fenolici dei nutraceutici e dei fitofarmaci nell'ambito del nostro studio mostrano buoni punteggi di docking e potrebbero essere un bersaglio ideale per il trattamento della SARS-CoV-2. L'esperidina, isolata dalle bucce d'arancia dei rifiuti alimentari, ha mostrato il punteggio di docking più alto (-8.84 Kcal/mol) contro la proteasi principale SARS-CoV-2 tra gli altri composti testati. L'esperidina è in grado di ridurre gli ioni di zinco per preparare ZnO NP con forma esagonale e dimensioni delle particelle di circa 25 nm. Le NP ZnO mediate dall'esperidina mostrano una maggiore attività antivirale rispetto all'esperidina stessa con percentuali del 44,75 e del 58,83 percento alla massima concentrazione non citotossica. Ulteriori studi dovrebbero essere condotti per l'esperidina, altri nutraceutici, composti fitofarmaceutici e le loro NP ZnO per trovare trattamenti sicuri, economici e potenziali per la malattia pandemica SARS-CoV-2.

Contributi degli autori Gouda H. Attia, Yasmin S. Moemen, Mahmoud Youns, Ammar M. Ibrahim, Randa Abdou, Mohamed A. El Raey Gouda H. Attia e Mohamed A. El Raey disegnano il manoscritto. Gouda H. Attia, Ammar M. Ibrahim e Mohamed A. El Raey hanno condotto la separazione cromatografica ed eseguito la delucidazione della struttura dell'esperidina pura isolata Gouda H. Attia, Randa Abdou e Mohamed A. El Raey hanno eseguito la sintesi verde di ZnO NP e descriverne le caratteristiche. Yasmin S. Moemen ha eseguito tutti gli studi sull'aggancio molecolare e Mohamed A. El-Raey ha suggerito la proteina.

Mahmoud Youns e Randa Abdou hanno eseguito i test antivirali e di citotossicità e la loro analisi dei dati. Tutti gli autori erano responsabili della stesura e della stesura della versione finale del manoscritto e dell'approvazione del manoscritto finale.

Finanziamento

Nessun finanziamento è stato ricevuto per questo lavoro.

Etica della ricerca

Confermiamo inoltre che qualsiasi aspetto del lavoro trattato in questo manoscritto che ha coinvolto pazienti umani è stato condotto con l'approvazione etica di tutti gli organismi pertinenti e che tali approvazioni sono riconosciute all'interno del manoscritto.

È stata ottenuta l'approvazione IRB (necessaria per studi e serie di 3 o più casi)

Il consenso scritto alla pubblicazione di informazioni potenzialmente identificative, come i dettagli del caso e le fotografie, è stato ottenuto dal paziente o dai loro tutori legali.

Dichiarazione di interesse concorrente

Gli autori non riportano dichiarazioni di interesse.

Ringraziamenti

Siamo grati al Deanship of Scientific Research, Najran University, KSA, per aver fornito il finanziamento per eseguire questo progetto (NU/MID/18/024).

Appendice A. Dati supplementari

Il materiale supplementare relativo a questo articolo può essere trovato, nella versione online, all'indirizzo DOI:https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.111724.

Gouda H. Attiaa,b , Yasmine S. Moemenc , Mahmoud Younsd , Ammar M. Ibrahime ,  Randa Abdouf,g , Mohamed A. El Raeyh, *  

a Dipartimento di Farmacognosia, College of Pharmacy, Università di Najran, Najran, Arabia Saudita
b Dipartimento di Farmacognosia, Facoltà di Farmacia, Università Kafr El-Shiekh, Kafr El-Shiekh, Egitto
c Dipartimento di Patologia Clinica, Istituto Nazionale del Fegato, Università di Menoufia, Menoufia, Egitto
d Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Facoltà di Farmacia, Università di Helwan, Il Cairo, Egitto
e College di scienze mediche applicate, Università di Najran, Najran, Arabia Saudita
f Dipartimento di Farmacognosia, Facoltà di Farmacia, Università Umm Al-Qura, Mecca, Arabia Saudita
g Dipartimento di Farmacognosia, Facoltà di Farmacia, Università di Helwan, Il Cairo, Egitto
h Dipartimento di Fitochimica e Sistematica Vegetale, Divisione Farmaceutica, Centro Nazionale delle Ricerche, Dokki, Il Cairo, Egitto

Riferimenti

[1] Organizzazione mondiale della sanità, malattia da coronavirus dell'OMS (COVID-19), 2020 (consultato il 22 ottobre 2020), https://www.worldometers. info/coronavirus/#paesi.

[2] J. Hunter, S. Arentz, J. Goldenberg, G. Yang, J. Beardsley, D. Mertz, S. Leeder, Protocollo di revisione rapida: zinco per la prevenzione o il trattamento di COVID-19 e altri infezioni delle vie respiratorie legate al coronavirus, Integr. Med. ris. 9 (2020), 100457. [3] GJ Kotwal, Nutraceutici antivirali dal succo di melograno (Punica granatum), in Handb. Nutraceutici, vol. I, CRC Press, 2009, pp. 338–346.

[4] L.-T. Lin, WC-C. Hsu, C.-C. Lin, Prodotti naturali antivirali e medicinali a base di erbe, J. Tradit. Complemento. Med. 4 (2014) 24–35.

[5] A. Kumar, Y. Kubota, M. Chernov, H. Kasuya, Potential role of zinc supplementation in profilassi e trattamento di COVID-19, Med. Ipotesi (2020), 109848.

[6] J. Jiang, J. Pi, J. Cai, L'avanzamento delle nanoparticelle di ossido di zinco per applicazioni biomediche, Bioinorg. Chimica. appl. (2018), https://doi.org/10.1155/2018/ 1062562.

[7] AJW Te Velthuis, SHE van den Worm, AC Sims, RS Baric, EJ Snijder, MJ van Hemert, Zn2 plus inibisce l'attività dell'RNA polimerasi del coronavirus e dell'arterivirus in vitro e gli ionofori di zinco bloccano la replicazione di questi virus nella coltura cellulare, PLoS Pathog. 6 (2010), e1001176.

[8] Z. Jin, X. Du, Y. Xu, Y. Deng, M. Liu, Y. Zhao, B. Zhang, X. Li, L. Zhang, C. Peng, Struttura di M pro da SARS- CoV-2 e scoperta dei suoi inibitori, Nature (2020) 1–5.

[9] A. Grosdidier, V. Zoete, O. Michielin, SwissDock, un servizio web di docking di proteine-piccole molecole basato su EADock DSS, Nucleic Acids Res. (2011), https://doi.org/ 10.1093/nar/gkr366.

[10] A. Kucukelbir, FJ Sigworth, HD Tagare, Quantifying the local resolution of cryo-EM density maps, Nat. Metodi 11 (2014) 63–65.

[11] HH Barakat, M. El-Raey, SA Nada, I. Zeid, M. Nawwar, Fenolici costitutivi e attività epatoprotettiva delle foglie di Eugenia supra-axillaris, EJ Chem. 54 (2011) 313–323.

[12] SM Osman, WA El Kashak, M. Wink, MA El Raey, Nuovi derivati ​​di isorhamnetina da Salsola imbricata Forssk. Foglie con spiccata attività antinfiammatoria, Pharmacogn. Mag. 12 (2016) S47.

[13] GH Attia, HS Alyami, MAA Orabi, AH Gaara, MA El Raey, Attività antimicrobica di nanoparticelle di argento e zinco mediata da Calyx verde melanzana, Int. J. Pharmacol. 16 (2020) 236–243.

[14] P. Vijayan, C. Raghu, G. Ashok, SA Dhanaraj, B. Suresh, Attività antivirale delle piante medicinali di Nilgiris, Indiano J. Med. ris. 120 (2004) 24–29.

[15] T. Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Metodi 65 (1983) 55–63.

[16] W. Randazzo, J. Piqueras, J. Rodríguez-Díaz, R. Aznar, G. S´anchez, Miglioramento dell'efficienza della vitalità-qPCR per la rilevazione selettiva di HAV infettiva in campioni di cibo e acqua, J. Appl. microbiolo. 124 (2018) 958–964.

[17] RM Pinto, JM Diez, A. Bosch, Uso della linea cellulare di carcinoma del colon CaCo-2 per l'amplificazione in vivo e il rilevamento di virus enterici, J. Med. Virolo. 44 (1994) 310–315.

[18] Z. Ding, G. Sun, Z. Zhu, Comunicazione breve L'esperidina attenua il danno polmonare indotto dal virus dell'influenza A (H1N1) nei ratti attraverso il suo effetto antinfiammatorio, Antivir. Là. 23 (2018) 611–615.

[19] C. Wu, Y. Liu, Y. Yang, P. Zhang, W. Zhong, Y. Wang, Q. Wang, Y. Xu, M. Li, X. Li, Analisi degli obiettivi terapeutici per la SARS- CoV-2 e scoperta di potenziali farmaci mediante metodi computazionali, Acta Pharm. Peccato. B (2020).

[20] AHD Cataneo, D. Kuczera, AC Koishi, C. Zanluca, GF Silveira, TB de Arruda, AA Suzukawa, LO Bortot, M. Dias-Baruffi, WA Verri, Il flavonoide di agrumi naringenina altera l'infezione in vitro dell'uomo cellule dal virus Zika, Sci. Rep. 9 (2019) 1–15.

[21] Y.-J. Lin, Y.-C. Chang, N.-W. Hsiao, J.-L. Hsieh, C.-Y. Wang, SH-H. Kung, F.-J. Tsai, Y.-C. Lan, C.-W. Lin, Fisetina e rutina come inibitori della proteasi 3C dell'enterovirus A71, J. Virol. Metodi 182 (2012) 93–98.

[22] K. Kaihatsu, M. Yamabe, Y. Ebara, Meccanismo d'azione antivirale dell'epigallocatechina-3-O-gallato e suoi esteri di acidi grassi, Molecules 23 (2018) 2475.

[23] BU Reddy, R. Mullick, A. Kumar, G. Sharma, P. Bag, CL Roy, G. Sudha, H. Tandon, P. Dave, A. Shukla, Un inibitore naturale di piccole molecole corilagin blocca la replicazione dell'HCV e modula lo stress ossidativo per ridurre il danno epatico, Antiviral Res. 150 (2018) 47–59.

[24] JT Ortega, AI Su´arez, ML Serrano, J. Baptista, FH Pujol, HR Rangel, Il ruolo della frazione glicosilica dei derivati ​​della miricetina nell'attività anti-HIV-1 in vitro, AIDS Res. Là. 14 (2017) 1–6.

[25] RB Teponno, S. Kusari, M. Spiteller, Recent Advances in research on lignans and neolignans, Nat. prod. Rep. 33 (2016) 1044–1092.

[26] J. Yin, MM Cherney, EM Bergmann, J. Zhang, C. Huitema, H. Pettersson, LD Eltis, JC Vederas, MNG James, Un catione episolfuro (anello di tiiranio) intrappolato nel sito attivo della proteinasi HAV 3C inattivato da inibitori chetonici a base di peptidi, J. Mol. Biol. 361 (2006) 673–686.

[27] VM Chari, M. Jordan, H. Wagner, PW Thies, Uno studio 13C-NMR sulla struttura di un'acil-linarina da Valeriana wallichii, Phytochemistry 16 (1977) 1110–1112.

[28] N. Srinivasan, C. Rangasami, JC Kannan, Struttura di sintesi e proprietà ottiche delle nanoparticelle di ossido di zinco, Int J Appl Eng Res. 10 (2015) 343–345.

[29] S. Fakhari, M. Jamzad, H. Kabiri Fard, sintesi verde di nanoparticelle di ossido di zinco: un confronto, Green Chem. Lett. Rev. 12 (2019) 19–24.

[30] N. Bala, S. Saha, M. Chakraborty, M. Maiti, S. Das, R. Basu, P. Nandy, Sintesi verde di nanoparticelle di ossido di zinco utilizzando l'estratto di foglie di Hibiscus subdariffa: effetto della temperatura sulla sintesi, anti -attività batterica, e attività antidiabetica, RSC Adv. 5 (2015) 4993–5003.

[31] H. Zakaryan, E. Arabyan, A. Oo, K. Zandi, Flavonoidi: composti naturali promettenti contro le infezioni virali, Arch. Virolo. 162 (2017) 2539–2551.

[32] M. Bouhaddou, D. Memon, B. Meyer, KM White, VV Rezelj, MC Marrero, BJ Polacco, JE Melnyk, S. Ulferts, RM Kaake, Il panorama della fosforilazione globale di SARS-CoV-2 infezione, cellula 182 (2020) 685–712.

[33] H. Ghaffari, A. Tavakoli, A. Moradi, A. Tabarraei, F. Bokharaei-Salim, M. Zahmatkeshan, M. Farahmand, D. Javanmard, SJ Kiani, M. Esghaei, Inibizione dell'infezione da virus dell'influenza H1N1 da nanoparticelle di ossido di zinco: un'altra applicazione emergente della nanomedicina, J. Biomed. Sci. 26 (2019) 1–10.

[34] SA Read, S. Obeid, C. Ahlenstiel, G. Ahlenstiel, Il ruolo dello zinco nell'immunità antivirale, Adv. Nutr. 10 (2019) 696–710.