Valutazione dell'immunità mediante misurazione quantitativa degli anticorpi IgG SARS-CoV-2 nei campioni prelevati dal polpastrello

Astratto

Il COVID-19 ha colpito direttamente o indirettamente miliardi di persone in tutto il mondo. La risposta alla pandemia si è concentrata sulla prevenzione della diffusione della malattia e sul miglioramento delle opzioni terapeutiche. Le tecnologie diagnostiche hanno svolto un ruolo chiave in questa risposta sin dall'inizio della pandemia. Man mano che i vaccini e altri trattamenti sono stati sviluppati e utilizzati, è aumentato l'interesse per la comprensione e la misurazione del livello individuale di protezione immunitaria. Storicamente, l'uso dei titoli anticorpali per misurare l'immunità sistemica è stato limitato da una comprensione incompleta della relazione tra anticorpi e immunità, dalla mancanza di standard internazionali per la concentrazione anticorpale per consentire confronti tra studi e da dati clinici insufficienti per consentire lo sviluppo di robusti modelli di immunità anticorpale.

Tuttavia, questi vincoli sono recentemente cambiati. Con una comprensione più approfondita degli anticorpi, la promulgazione degli standard anticorpali dell'OMS e lo sviluppo di modelli di immunità che utilizzano set di dati provenienti da più studi sui vaccini COVID-19, alcuni tipi di test anticorpali quantitativi possono ora fornire un modo per monitorare l'immunità individuale o della comunità contro il COVID-19. Nello specifico, i test che quantificano la concentrazione di IgG anti-RBD, anticorpi che prendono di mira il dominio di legame del recettore della componente della proteina spike S1 del virus SARS-CoV-2, si mostrano promettenti come misura utile e scalabile del COVID{ {6}} immunità sia degli individui che delle comunità. Tuttavia, per mantenere questa promessa, è necessario un test rapido e facile da somministrare.

Per rispondere a questa importante esigenza clinica, Brevitest ha implementato la sua piattaforma tecnologica point-of-care in grado di eseguire un rapido (<15 minute), quantitative antibody test with a sample of 10 µl of whole blood from a fingerstick. The test we validated on this platform measures the concentration of anti-RBD IgG in Binding Antibody Units per milliliter (BAU/mL) per WHO Reference Standard NIBSC 20/136.

In questo documento, presentiamo gli studi utilizzati per caratterizzare il test Brevitest anti-RBD IgG e valutarne le prestazioni cliniche, i limiti inferiori di misurazione, la precisione, la linearità, l'interferenza e la reattività crociata. I risultati dimostrano la capacità di questo test di misurare la concentrazione di IgG anti-RBD di un paziente. Queste informazioni, insieme ai modelli sviluppati dai recenti studi clinici sui vaccini COVID-19, possono fornire un mezzo per valutare l'attuale livello di protezione immunitaria di un individuo o di una comunità contro l'infezione da COVID-19.

Pertanto, nella nostra vita quotidiana, dobbiamo migliorare attivamente la nostra immunità e avere uno stile di vita sano: dormire a sufficienza, una dieta sana, un esercizio moderato ed evitare cattive abitudini come il fumo sono i prerequisiti fondamentali per migliorare l'immunità e un corretto esercizio fisico, in Inoltre, abbiamo scoperto che Cistanche può anche migliorare l'immunità ei glicosidi feniletanoidi contenuti in Cistanche possono inibire la produzione e l'effetto dei fattori immunosoppressivi, migliorando così l'immunità del corpo.

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introduzione

Il Severe Acute Respiratory Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è un nuovo coronavirus che è emerso come causa della grave malattia respiratoria (COVID-19) nel dicembre 2019 in Cina e si è rapidamente diffuso, causando una pandemia mondiale . Il virus SARS-CoV-2 fa parte del genere Betacoronavirus della famiglia Coronaviridae. Altri membri includono la sindrome respiratoria acuta grave da coronavirus 1 (SARS-CoV-1) e la sindrome respiratoria da coronavirus del Medio Oriente (MERS-CoV).1 L'elevata trasmissibilità del virus ha portato alla sua rapida diffusione in tutto il mondo nonostante gli sforzi senza precedenti dalle autorità sanitarie pubbliche per rallentare il progresso della pandemia, inclusi blocchi, mandati di maschera, promozioni di igiene pubblica, investimenti pubblici in vaccini rapidi e sviluppo terapeutico e altre misure.

I test diagnostici per il rilevamento dell'infezione attiva da parte del virus e la valutazione della risposta immunitaria del corpo a una sfida virale hanno svolto un ruolo fondamentale negli sforzi per rispondere alla pandemia, nonché per comprendere la malattia e i suoi effetti sul corpo. Per il rilevamento diretto del virus nelle vie aeree, sono stati sviluppati numerosi test di amplificazione dell'acido nucleico (compresi i test PCR) e test dell'antigene virale. Questi test hanno dimostrato di essere elementi importanti della diagnosi clinica e delle strategie di gestione della malattia. Tuttavia, i test di rilevamento e quantificazione virale non forniscono informazioni sulla storia, la risposta o lo stato immunitario del corpo, né danno alcuna indicazione del rischio di futura infezione o reinfezione.

Per capire come il sistema immunitario di un paziente risponde al virus, abbiamo bisogno di test sierologici. Prima della diffusione dei test molecolari e della vaccinazione, questi test venivano talvolta utilizzati anche per diagnosticare l'infezione da SARS-CoV-2. La logica di questo approccio era che la presenza di anticorpi contro un nuovo virus, in particolare anticorpi IgM, senza precedente storia di infezione, poteva essere utilizzata per diagnosticare l'infezione in corso se abbinata a sintomi clinici concordanti. Tuttavia, questo approccio diagnostico è stato in gran parte abbandonato all'inizio della pandemia con la rapida crescita e la facile disponibilità di test dell'antigene e dell'acido nucleico (NAT). Tuttavia, i test sierologici hanno ancora trovato alcuni usi per il monitoraggio epidemiologico e il controllo delle epidemie in alcune popolazioni.

Con il progredire della pandemia, una collaborazione tra governi, accademici e industria farmaceutica ha portato allo sviluppo e alla sperimentazione di diversi vaccini candidati, culminati in una serie di approvazioni da parte delle autorità sanitarie di tutto il mondo a partire dalla fine del 2020. Sebbene la vaccinazione abbia avuto un impatto significativo sulla portata e gravità delle infezioni nella maggior parte dei casi, ci si aspettava un inevitabile decadimento di tale protezione sulla base della precedente esperienza con i vaccini. Tuttavia, il carattere di tale decadimento e la durata effettiva della protezione variano ampiamente tra i vaccini e gli individui e l'impatto sulla comunità della perdita della protezione rimane sconosciuto. Di conseguenza, è in corso un dibattito sull'utilità, la necessità e la tempistica delle dosi di richiamo dei vaccini per mantenere la protezione immunitaria contro il virus, un dibattito che si è intensificato con l'emergere di diverse varianti del ceppo originale.

Per comprendere e rappresentare accuratamente la risposta di un individuo alla vaccinazione per aiutarlo a prendere decisioni individualizzate con le migliori conoscenze disponibili, sono necessari test anticorpali quantitativi in ​​grado di misurare in modo sensibile i livelli di anticorpi generati dal vaccino, dall'infezione naturale o da una combinazione dei due. Ma mentre la sensibilità, la specificità e la ripetibilità sono essenziali, i risultati rapidi e la facilità di somministrazione (inclusi sia la matrice del campione che la posizione del test) sono anche caratteristiche desiderabili di qualsiasi test che dovrebbe essere ampiamente utilizzato.

Diversi produttori hanno creato e commercializzato test sierologici. La tecnologia alla base della maggior parte di questi test immunologici potrebbe essere classificata come test a flusso laterale (LFT) o test immunologici legati agli enzimi (ELISA). Gli LFT sono semplici da usare e richiedono una piccola quantità di sangue, ma gli LFT più accurati richiedono una venipuntura per ottenere un campione di siero o plasma per il test. Più recentemente, sono stati sviluppati alcuni LFT sierologici che possono utilizzare campioni di sangue prelevati dal polpastrello. Esempi di LFT disponibili in commercio sono SCoV-2 Detect IgG Rapid Test2 di InBios e CareStart COVID-19 IgM/IgG3 di Access Bio. Nonostante la loro facilità d'uso e la rapida restituzione dei risultati, una sfida degli LFT è la mancanza di quantificazione e la sensibilità intrinsecamente inferiore rispetto agli ELISA di laboratorio4. La limitazione della sensibilità è dovuta all'assenza di amplificazione enzimatica del segnale e alla mancanza di fasi di lavaggio tra le reazioni per separare i reagenti chimici. Tuttavia, gli LFT svolgono un ruolo significativo nella diagnostica a causa del loro basso costo, velocità e facilità d'uso.

Un'altra importante categoria di test immunologici è costituita dagli ELISA. I test di immunoassorbimento enzimatico vengono solitamente eseguiti utilizzando uno dei due metodi:

1. Kit di laboratorio ELISA destinati a essere analizzati in laboratori certificati utilizzando 96-pozzetti di micropiastre in combinazione con lettori di piastre (ad es., il sistema di test ZEUS ELISA SARS-CoV-2 IgG5; o EUROIMMUN Anti-SARS- CoV-2 ELISA (IgG)6).

2. Cassette precaricate pensate per essere utilizzate su immunoanalizzatori di laboratorio proprietari (ad es. Elecsys Anti-SARS-CoV- 7 di Roche; o Siemens ADVIA Centaur SARS-CoV-2 IgG (sCOVG)8). Questi ELISA sono test di sensibilità più elevata che sono spesso semi-quantitativi.

Sfortunatamente, questi metodi mancano della velocità e della facilità d'uso degli LFT, richiedendo sangue venoso come campione clinico e personale addestrato per eseguire i test in un laboratorio certificato, che spesso deve effettuare investimenti di capitale significativi per raggiungere alti livelli di capacità di test. La consegna dei risultati avviene solitamente in pochi giorni, a seconda dell'efficienza dell'operazione di test. Tuttavia, anche le operazioni più efficienti possono fornire i risultati dei test solo entro poche ore, dati i limiti della tecnologia di immunodosaggio sottostante.

Brevitest Technologies, Inc. (Brevitest) ha sviluppato una piattaforma di immunodosaggio che esegue immunodosaggi legati agli enzimi presso il punto di cura entro 15 minuti. Combina i vantaggi di LFT (semplicità, basso volume del campione, costo e velocità) ed ELISA (sensibilità, specificità, precisione, quantificazione e affidabilità). La piattaforma Brevitest è costituita da un'unità di elaborazione dei campioni (SPU) che esegue test individuali su cartucce di test usa e getta. La SPU è un piccolo dispositivo robotico completamente automatizzato che interagisce con un sistema centrale di analisi e database che gira nel cloud (il Brevitest Cloud). Utilizza una cartuccia proprietaria che contiene i reagenti necessari per eseguire tutti i passaggi ELISA e utilizza magneti termici e mobili per controllare il processo di reazione.

Quando le reazioni sono complete, la SPU misura il cambiamento di colore nel reagente indicatore risultante dall'ultima fase del processo ELISA. Le letture ottiche grezze vengono trasmesse in modo sicuro al Brevitest Cloud per l'analisi e l'elaborazione prima che il risultato sia reso disponibile al paziente e al medico in tempo reale. Abbiamo precedentemente pubblicato l'uso di questa piattaforma per rilevare la presenza di IgA secretorie anti-SARS-CoV-2 nella saliva. 9

Brevitest ha sviluppato e convalidato un test per quantificare gli anticorpi IgG anti-RBD SARS-CoV-2 nel sangue prelevato dal polpastrello in meno di 15 minuti sulla sua piattaforma proprietaria. In questo rapporto, presentiamo i dati degli studi di convalida e discutiamo i potenziali usi clinici ed epidemiologici del test.

Materiali e metodi

Materiali, strumenti e reagenti: la piattaforma di analisi Brevitest ha tre componenti: un'unità di elaborazione dei campioni (SPU), una cartuccia precaricata e un software analitico basato su cloud (Brevitest Cloud). (Vedi Figura 1.) La SPU è un dispositivo robotico miniaturizzato completamente automatizzato con elementi meccanici, ottici e termoregolatori. La SPU utilizza magneti permanenti per controllare il movimento delle microsfere magnetiche attraverso diversi scomparti all'interno della cartuccia e fa oscillare i magneti in ogni scomparto utilizzando schemi di miscelazione proprietari.

In ogni compartimento, sulla superficie di queste microsfere avviene una singola fase della reazione ELISA multi-fase. La reazione finale porta alla produzione di un composto colorato che viene misurato come segnale ottico e le letture grezze vengono inviate al Brevitest Cloud per l'analisi. Esistono diverse protezioni integrate nella piattaforma per garantire che la cartuccia sia inserita correttamente, che venga eseguito il test corretto, che la cartuccia non abbia superato la data di scadenza, che i risultati del test siano validi e che le informazioni identificabili del paziente non siano a rischio.

La cartuccia è precaricata con i reagenti necessari per eseguire il test IgG COVID-19 di Brevitest. La cartuccia non è un dispositivo microfluidico, in quanto non vi è alcun movimento di reagenti all'interno della cartuccia; piuttosto, i componenti chiave dell'ELISA (antigene, anticorpo di cattura e anticorpo tracciante) sono legati a microsfere magnetiche che vengono spostate tra i pozzetti dei reagenti. L'antigene catturato utilizzato è il Receptor Binding Domain (RBD) della proteina S1 del virus SARS-CoV-2. Le IgG catturate vengono quindi rilevate utilizzando una IgG anti-umana legata a una molecola di perossidasi di rafano (HRP). Il cambiamento di colore finale avviene nel compartimento contenente TMB, che passa da incolore a blu in presenza di HRP. Ogni cartuccia è configurata per eseguire 3 reazioni ELISA contemporaneamente in canali separati. Due canali contengono rispettivamente il campione ad alta e bassa diluizione e un canale è caricato con una concentrazione nota di anti-SARS-CoV-2 Spike S1 IgG per il controllo di qualità. I materiali di prova, che includono la SPU e le cartucce, sono stati sviluppati presso Brevitest Technologies, Inc. e prodotti presso il loro laboratorio certificato CLIA.

I campioni sono stati raccolti dai soggetti secondo un protocollo approvato dall'IRB dopo il consenso con un modulo di consenso informato approvato dall'IRB. I campioni includono sangue prelevato dal polpastrello ottenuto secondo procedure standard con adeguate precauzioni di sicurezza. Per raccogliere il sangue prelevato dal polpastrello per il dosaggio Brevitest, è stata utilizzata una lancetta monouso da 28 G, seguita dalla raccolta con un tubo microcapillare monouso da 10 µl a volume fisso. I dati del produttore per il tubo microcapillare indicano che il volume del campione varia<1% on clinical tests. The clinical history of the subjects was collected in a questionnaire and recorded before taking their sample.

Convalida clinica: I campioni prelevati dal polpastrello (107 campioni) sono stati ottenuti da individui che hanno risposto a una chiamata per partecipare allo studio clinico condotto presso il laboratorio certificato CLIA di Brevitest a Houston, Texas. Novanta (90) campioni sono stati ottenuti da soggetti con una storia segnalata di infezione da SARS-CoV-2 e/o da coloro che avevano ricevuto almeno una dose di uno qualsiasi dei tre vaccini e sono stati classificati come "positivi". Diciassette (17) campioni sono stati ottenuti da individui che non avevano una storia medica di infezione da SARS-CoV-2 e hanno riferito di non aver mai ricevuto un vaccino COVID-19 e sono stati classificati come "negativi".

Precisione: la precisione del test è stata caratterizzata in uno studio guidato da CLSI EP05-A3. In questo studio sono stati testati tre campioni rappresentativi dello spettro di concentrazioni riscontrate nelle operazioni cliniche di routine. I campioni sono stati testati in replicati di due per tre giorni su due diversi lotti al giorno (per un totale di sei lotti) e tre analizzatori. Il software Analyse-it è stato utilizzato per calcolare i risultati.

Reattività crociata e interferenza: per testare la reattività crociata con il test Brevitest, è stato ottenuto da BioIVT un pannello di campioni noti per essere negativi per SARS-CoV-2 e positivi per gli anticorpi IgG ai seguenti virus: influenza A , influenza B, HBV, HCV, HIV, Haemophilus influenzae, alfa coronavirus 229E e NL63, beta coronavirus OC43 e HKU1, RSV, parainfluenza e polmonite da micoplasma. Questi campioni sono stati analizzati con il dosaggio Brevitest e quelli con risultati inferiori al limite di rilevamento (LOD; 6,2 BAU/mL) sono stati classificati come non cross-reattivi.

Gli interferenti comuni sono stati acquisiti da Sun Diagnostics per arricchire i campioni e determinarne l'effetto sul test. Quattro campioni di pungidito non contenenti l'interferente (campioni di IgG SARS-CoV -2 alti e bassi) sono stati addizionati con emolisato (1000 mg/dL), lipoproteine ​​ricche di trigliceridi (500 mg/dL) e bilirubina coniugata (40 mg /dL). La differenza percentuale rispetto al campione di controllo è stata calcolata per ciascun campione addizionato e sono state esaminate le interpretazioni dei risultati.

Prestazioni analitiche del test: le capacità di rilevamento del test, inclusi il limite del bianco (LOB) e il LOD, sono state determinate in base alle linee guida del CLSI EP{{0}}A2. Per ottenere il LOB, sono stati testati 4 campioni prelevati dal polpastrello in bianco in replicati di 2 per 3 giorni su 2 lotti e 3 analizzatori. Il LOD è stato determinato testando 4 campioni di basso livello in replicati di 2 per 3 giorni su 2 lotti e 3 analizzatori. I 4 campioni di basso livello sono stati creati miscelando campioni negativi confermati con una quantità nota di standard OMS (0,17 µl di standard 1000 BAU/mL). Il limite di quantificazione (LOQ) è stato calcolato come la concentrazione più bassa testata maggiore del LOD più 4,5 volte la deviazione standard osservata nel nostro studio LOD. L'analisi statistica è stata condotta con il software Analyse-it. Per determinare la linearità è stata eseguita una guida allo studio del CLSI EP06-A. I campioni bianchi sono stati addizionati con lo standard internazionale dell'OMS (WHO Reference Standard NIBSC 20/136) per preparare 10 campioni di concentrazione nota. I campioni sono stati analizzati in 4 replicati utilizzando 1 lotto di reagenti.

Risultati

Dati demografici: Di ​​seguito è presentata una ripartizione dei dati demografici della popolazione testata (Tabella 1).

Prestazioni cliniche: a causa dell'impraticabilità di ottenere campioni pre-COVID di sangue intero prelevato dal polpastrello e della mancanza di un test di riferimento prelevato dal polpastrello per la misurazione quantitativa degli anticorpi IgG COVID-19, è stato eseguito uno studio di concordanza clinica basato sulla storia clinica. I campioni sono stati raccolti da un totale di 107 soggetti. Anche i dati sulla storia clinica sono stati ottenuti da questi soggetti; tutti i dati sono stati auto-segnalati e la verifica dei dati è stata eseguita ove possibile.

Sulla base di questi dati di storia clinica auto-riportati, 17 soggetti non hanno mai avuto un'infezione sintomatica da COVID-19 e non sono mai stati vaccinati. Gli altri 90 soggetti erano stati infettati, vaccinati o entrambi. I soggetti che non erano stati né vaccinati né infetti dovevano non avere anticorpi rilevabili (cioè al di sotto del limite di rilevamento) e sono stati caratterizzati come negativi. I restanti soggetti dovevano avere livelli rilevabili di anticorpi (cioè superiori al limite di rilevamento) e sono stati caratterizzati come positivi.

I risultati hanno mostrato una concordanza percentuale positiva complessiva (PPA)/sensibilità del 97,8 percento (IC 95 percento: 92,42 percento - 99.40 percento) e una concordanza percentuale negativa complessiva (NPA)/specificità del 100 percento (IC 95 percento : 79,61 percento - 100 percento ). Vedere la tabella 2.

Nello studio di linearità sono state preparate soluzioni a concentrazioni note e testate sul dispositivo Brevitest per confrontare i valori ottenuti. La linearità è stata dimostrata attraverso l'intervallo di misurazione analitica da 22,2 a 2000 BAU/mL (vedere la Figura 2). Dei 10 campioni testati, 2 punti, 0 BAU/mL e 4000 BAU/mL sono stati rimossi dall'intervallo lineare (vedere Tabella 5). Prendendo in considerazione le stime di LOB, LOD, LOQ e linearità, l'intervallo di misurazione analitica va da 22,2 a 2000 BAU/mL.

Reattività incrociata e interferenza: abbiamo valutato il test per gli anticorpi potenzialmente a reazione incrociata. Alcuni campioni di HCV (2), campioni di HIV (1) e tutti i campioni di Coronavirus erano al di sopra del limite di rilevamento per il test SARS-CoV-2 IgG. Il resto dei campioni era al di sotto del LOD (vedi Tabella 6).

Discussione

Si dice spesso che l'infezione sia una guerra tra l'agente patogeno e l'ospite. In quella guerra, l'elemento centrale della nostra difesa - sia contro un'infezione individuale che contro una pandemia globale - è il sistema immunitario umano.

Al suo livello più elementare, il sistema immunitario è composto da cellule, proteine ​​e altre molecole che lavorano di concerto per identificare gli agenti patogeni, prevenire l'infezione e, se un'infezione prende piede, eliminare l'agente patogeno invasore o raggiungere uno "stallo" sostenibile con Esso.

Continuando con l'analogia della guerra, il sistema immunitario ha una vasta capacità di "intelligenza" che utilizza recettori di superficie cellulare, citochine, chemochine, cellule dendritiche, immunoglobuline, principali complessi di istamina e altri elementi per riconoscere tossine, batteri, funghi, parassiti e virus e inviare avvisi ad altre parti del sistema immunitario che è stata rilevata una minaccia ed è necessaria un'azione.

In risposta, il sistema immunitario mobilita un'ampia gamma di "armi" per neutralizzare ed eliminare la minaccia, incluse, ma non limitate a specie reattive dell'ossigeno, peptidi antimicrobici, cellule B effettrici, plasmacellule, cellule T CD4, cellule T CD8 , cellule NK, macrofagi, neutrofili e una gamma straordinariamente diversificata di immunoglobuline libere o anticorpi. Questi componenti possono essere visti come elementi di tre sottosistemi principali - immunità innata, immunità della mucosa e immunità umorale - ma l'interconnessione e l'interazione di questi sottosistemi sono estesi, aggiungendo sia ridondanza che complessità al sistema immunitario complessivo. 10

Gli anticorpi sono importanti effettori sia dell'immunità mucosa che umorale, ma partecipano anche al riconoscimento dei patogeni e ai processi di segnalazione. Le loro due modalità effettrici primarie sono la neutralizzazione e l'opsonizzazione, con la neutralizzazione di particolare importanza quando sfidata da un agente patogeno virale. I ricercatori e gli sviluppatori di vaccini hanno prestato particolare attenzione alla neutralizzazione degli anticorpi a causa della loro capacità di impedire l'ingresso dell'RNA virale nelle cellule ospiti, impedendo così il processo di replicazione virale che è una componente necessaria di qualsiasi infezione grave.

Il ruolo protettivo svolto dagli anticorpi è stato dimostrato in COVID-19 sia con siero di convalescenza che con anticorpi monoclonali terapeutici, che si sono dimostrati particolarmente utili in individui con bassi livelli di anticorpi endogeni.11,12 La FDA ha approvato gli anticorpi monoclonali a scopo terapeutico in individui recentemente diagnosticati con COVID-19 e profilatticamente in individui incapaci di attivare una risposta immunitaria contro SARS-CoV-2.13

Tuttavia, mentre gli anticorpi svolgono importanti ruoli biologici come effettori dell'immunità, potrebbero avere ruoli clinici ed epidemiologici ancora più importanti come indicatori dell'immunità.

Questi ruoli sono spesso confusi; sentiamo regolarmente che "l'immunità è più degli anticorpi" come motivo per non testare i livelli di anticorpi. Questa osservazione, ovviamente, è vera. Ci vuole più degli anticorpi per generare il tipo di risposta robusta, ridondante e rapida richiesta per la sopravvivenza della specie umana nell'ambiente ostile in cui viviamo.

Ma la domanda non è se i livelli di anticorpi siano sinonimo di immunità; la domanda è se i livelli di anticorpi sono correlati con l'immunità.

Dal punto di vista clinico, la misura più importante della protezione immunitaria complessiva è una riduzione del rischio di infezione sintomatica rispetto alla popolazione generale. (Le infezioni asintomatiche possono essere rilevanti per alcune questioni epidemiologiche, ma in genere non sono considerate uno stato patologico di importanza clinica.) Questa metrica è stata ampiamente utilizzata per valutare l'efficacia dei vaccini COVID-19.14

Gli studi sui vaccini, ad esempio, hanno un endpoint primario di "efficacia del vaccino", che è la riduzione del tasso di infezione nel braccio attivo (vaccinato) rispetto al braccio di controllo (placebo).

Tuttavia, poiché i tassi di infezione sono generalmente piuttosto bassi, le sperimentazioni sui vaccini hanno necessariamente un numero molto elevato di soggetti. La durata e il costo (sia in termini di denaro che di rischio per la salute umana) di tali studi sono stati motivo di notevole preoccupazione per i responsabili politici e l'industria, poiché limitano le risposte a epidemie virali in rapido movimento che possono diventare pandemie globali. Di conseguenza, c'è stato a lungo il desiderio di trovare un biomarcatore surrogato che possa essere utilizzato per valutare lo stato immunitario di individui e popolazioni, e quindi guidare sia lo sviluppo del vaccino che la gestione della risposta alla pandemia.

In breve, vogliamo un modo semplice per misurare l'immunità.

Dato ciò che sappiamo su come funziona il sistema immunitario, gli anticorpi sono un'ovvia categoria di misurazione da considerare per questo ruolo. Sono coinvolti sia nella risposta precoce a una sfida patogena (attraverso la generazione di IgM pentamerica e IgA secretoria dimerica) sia nell'immunità a lungo termine attraverso le cellule B della memoria che si differenziano in plasmacellule produttrici di anticorpi quando un patogeno riappare e generano un sistema immunitario secondario risposta.15

Tuttavia, l'uso degli anticorpi come correlati dell'immunità è stato ostacolato dalla mancanza di risposte a due domande fondamentali:

La recente comparsa di uno standard internazionale per la concentrazione di anticorpi è stato un primo passo importante per rispondere a queste due domande. Senza un tale standard, il confronto dei set di dati dei test anticorpali varia da difficile a poco pratico a impossibile. Lo standard di riferimento dell'OMS NIBSC 20/13616 è stato istituito nel dicembre 2020 ed è uno sviluppo cruciale e benvenuto che promette di accelerare notevolmente la nostra capacità di trovare e diffondere intuizioni di interesse per scienziati, medici e responsabili politici.

Un altro importante sviluppo recente che ha notevolmente migliorato il potenziale per misurare l'immunità è il numero e la portata senza precedenti delle sperimentazioni sui vaccini condotte negli ultimi 12 mesi. Man mano che i dati di questi studi sono stati pubblicati e analizzati, sono emerse due intuizioni molto importanti:

R. Gli anticorpi neutralizzanti sono altamente correlati all'immunità contro COVID-19.17 Dall'inizio della pandemia, i ricercatori si sono concentrati sulla proteina spike del virus SARS-CoV-2.

Tale attenzione è stata premiata e rafforzata dai dati degli studi sul vaccino mRNA, che hanno dimostrato che gli anticorpi contro la proteina spike generata dal vaccino erano altamente protettivi.

B. Alcuni test anticorpali sono buoni correlati per la protezione contro il COVID-19. 18 Sulla base dell'intuizione di cui sopra, non sorprende che i test di neutralizzazione - sia virus vivi che tipi di pseudovirus - siano buoni correlati per l'immunità contro COVID-19 e la diminuzione della gravità della malattia. Tuttavia, i test anticorpali neutralizzanti sono difficili (e, nel caso di test di virus vivi, pericolosi) da eseguire, limitando così la loro disponibilità solo a pochi contesti clinici. Tuttavia, ulteriori ricerche hanno scoperto che anche gli anticorpi leganti contro il dominio RBD sono fortemente correlati alla protezione contro COVID-19, forse a causa dell'effetto neutralizzante del legame anticorpale competitivo che interferisce con il legame della proteina spike all'ACE{ {5}} recettore.

Tutti questi recenti sviluppi - l'emergere di uno standard internazionale, l'identificazione di anticorpi neutralizzanti come eccellenti correlati di protezione e l'estensione di tale correlazione ad altri test anticorpali più accessibili - hanno creato le condizioni per un notevole miglioramento nella gestione clinica della COVID-19 utilizzando i test anticorpali come guida. Ma per implementare questo miglioramento, è necessaria una tecnologia di test in grado di fornire risultati quantitativi in ​​unità standard dell'OMS di BAU/mL con sufficiente precisione presso il punto di cura da un campione conveniente e adatto al paziente in un lasso di tempo rapido.

Il test degli anticorpi IgG Brevitest Quantimmune™ COVID-19 è un test quantitativo che presenta i risultati in BAU/mL, secondo lo standard di riferimento dell'OMS NIBSC 20/136 per gli anticorpi anti-SARS-CoV-2. Nello sviluppo di questo test, sono stati misurati e calcolati LOB, LOD, LOQ, riproducibilità e linearità. Il LOD è stato calcolato pari a 6,2 BAU/mL e Lwas OQ era 22,2 BAU/mL. Gli studi per determinare questi valori sono stati condotti su campioni prelevati dal polpastrello di pazienti che non erano stati precedentemente infettati o vaccinati. I campioni dei pazienti sono stati anche addizionati con bassi livelli di standard dell'OMS per creare bassi livelli di campioni utilizzati nei calcoli. Per testare la linearità, un campione negativo è stato arricchito con livelli noti dello standard di riferimento dell'OMS. Sulla base dei risultati, l'intervallo quantificabile del dosaggio è stato determinato essere compreso tra 22,2 e 2000 BAU/mL. Gli studi sulla precisione hanno dimostrato una precisione all'interno del lotto del 13,8% e una riproducibilità del CV del 23,4%. Sono state inoltre testate la reattività incrociata e l'interferenza per determinare se potenziali campioni o sostanze potrebbero influire sul risultato del test.

Brevitest misura gli anticorpi contro la parte RBD della proteina spike, che sono altamente correlati con l'attività neutralizzante.19 In uno studio pubblicato di recente, i ricercatori hanno analizzato l'associazione tra la concentrazione di alcuni anticorpi e la protezione contro SARS-CoV-2 quantificata come efficacia del vaccino, ovvero la riduzione del tasso di infezione sintomatica per i soggetti vaccinati rispetto ai non vaccinati. 18 Nello studio, gli anticorpi leganti e neutralizzanti a 28 giorni dopo la seconda dose sono stati misurati in destinatari di vaccino infetti e non infetti, con concentrazioni di anticorpi riportate utilizzando lo standard di riferimento dell'OMS. È stata raggiunta un'efficacia del vaccino del 50% contro l'infezione sintomatica con una variante maggioritaria Alpha (B.1.1.7) di SARS-CoV-2 con una confidenza del 95% (VE50@95) a una concentrazione di anticorpi anti-RBD di 109 BAU/mL.18

Nel test Brevitest, questo numero è stato utilizzato per impostare la differenza di cutoff tra "Basso" e "Alto", con valori inferiori al LOD riportati come "Nessuno rilevato". La Figura 3 mostra i valori limite del dosaggio Brevitest. Pertanto, i risultati del test degli anticorpi IgG Brevitest Quantimmune™ COVID-19 possono essere utilizzati per stimare il livello di protezione in ambito clinico.

La disponibilità di una sierologia rapida e quantitativa in un punto di cura da un polpastrello in grado di valutare il livello di protezione immunitaria su base individuale e comunitaria non ha precedenti e potrebbe avere un profondo impatto sulla risposta a pandemie come COVID{{ 2}}. Ad esempio, nella somministrazione di richiami vaccinali, i funzionari della sanità pubblica e gli sviluppatori di vaccini hanno generalmente raccomandato un richiamo dopo un tempo specifico. L'attuale raccomandazione per i vaccini a mRNA, ad esempio, è di ottenere un richiamo dopo 6 mesi. Tuttavia, questo approccio a "tempo di richiamo fisso" può non essere ottimale per i pazienti (in particolare quelli anziani) che tendono a perdere la loro immunità più velocemente di 6 mesi. Inoltre, per molte persone la vaccinazione contro il COVID-19 conferisce 12 mesi o più di protezione. Per quel segmento della popolazione vaccinata, potrebbe essere ottimale posticipare un richiamo finché la loro immunità non scende al di sotto di una soglia. Tale differimento potrebbe avere molteplici vantaggi: potrebbe estendere il periodo complessivo di protezione per quel paziente, forse generare una risposta secondaria più forte e più specifica e consentire un migliore utilizzo delle scorte limitate di vaccini.

La Figura 4 presenta i dati tratti dallo studio di validazione clinica Brevitest, mostrando solo i soggetti che hanno ricevuto un vaccino a mRNA (Moderna o Pfizer-BioNTech). Sebbene il set di dati sia relativamente piccolo (n=73), oltre il 12% dei soggetti era al di sotto del livello VE50@95 di 109 BAU/mL prima della data di richiamo raccomandata per 6-mesi, suggerendo che potrebbero avere un divario di protezione se dovessero aspettare per aumentare. D'altra parte, oltre il 31% dei soggetti aveva livelli anticorpali superiori a VE50@95, suggerendo che avevano ancora un'immunità residua, almeno contro la variante B.1.1.7, e potevano estendere il loro periodo di protezione immunitaria rinviando un richiamo . Mentre tali decisioni dovrebbero sempre essere prese in consultazione con un medico, questo approccio potrebbe essere una guida utile per coloro che cercano di gestire l'immunità del paziente.

Un secondo caso d'uso clinico potrebbe essere quello di valutare la risposta immunitaria dopo l'infezione o la vaccinazione. Le specifiche della sieroconversione variano tra gli individui a seconda dell'età, del corredo genetico, della malattia di base, dei farmaci e di altri fattori. Le persone che si vaccinano producono diversi tipi e concentrazioni di anticorpi e queste caratteristiche cambiano nel tempo. Le informazioni sull'attuale concentrazione di anticorpi di un paziente possono guidare le decisioni sullo stile di vita tenendo conto dei rischi associati ai livelli di protezione e alla possibile esposizione virale in ambienti diversi.

Un terzo utilizzo potrebbe riguardare lo screening e il monitoraggio di pazienti sottoposti a terapia anticorpale poiché le decisioni possono essere influenzate dai livelli di anticorpi rilevati. Ad esempio, è stato dimostrato che il plasma convalescente e i trattamenti terapeutici con anticorpi monoclonali sono più efficaci per i pazienti senza anticorpi rispetto ai pazienti con anticorpi endogeni contro SARS-CoV-2. 11,12 Pertanto, queste informazioni possono essere utilizzate anche per identificare i pazienti che trarrebbero maggiori benefici dalla somministrazione di anticorpi monoclonali, a livello terapeutico o profilattico, e aiutare gli operatori sanitari a gestire la somministrazione di tali terapie.

Infine, gli studi di sieroprevalenza potrebbero essere notevolmente migliorati utilizzando un test anticorpale quantitativo per valutare l'immunità di gregge. Se fatto a livello di comunità o in altri contesti appropriati come uffici, impianti di produzione o scuole, la modellazione epidemiologica e il processo decisionale sulla salute pubblica sarebbero notevolmente migliorati con un test più accurato e facile da somministrare, in particolare uno che è connesso al cloud e quindi in grado di fornire una visione "a volo d'uccello" dell'immunità integrando i risultati degli anticorpi in tempo reale in un sistema software di geolocalizzazione e mappatura.

Conclusione

Studi recenti hanno dimostrato che un test quantitativo degli anticorpi IgG anti-RBD è un utile correlato per la protezione immunitaria contro COVID-19. Per massimizzare l'impatto di questa importante intuizione, un test rapido (<15 minutes) and precise, requiring only a fingerstick sample of blood, and capable of running in a point-of-care setting is needed.

Il test Brevitest può quantificare la quantità di anticorpi IgG SARS-CoV-2 nei campioni prelevati dal polpastrello in BAU/mL, secondo lo standard di riferimento dell'OMS 20/136. Le sue caratteristiche prestazionali sono presentate in questo lavoro. Nei test di convalida del dosaggio, sono stati determinati e valutati i limiti inferiori di misurazione, precisione, linearità, interferenza e reattività incrociata.

Tra i possibili usi, questo test potrebbe essere uno strumento prezioso per ottimizzare i tempi di richiamo del vaccino, verificare la sieroconversione nei gruppi immunocompromessi e in altri gruppi a rischio, ottimizzare l'uso terapeutico e profilattico degli anticorpi monoclonali e, più in generale, valutare l'individuo e la popolazione risposte immunitarie, in particolare la produzione di anticorpi IgG, innescate da SARS-CoV-2 o dal vaccino. Le informazioni sul numero di anticorpi SARS-CoV-2 presenti in un campione di un individuo in un dato momento potrebbero essere preziose in quanto potrebbero guidare decisioni terapeutiche, preventive o sullo stile di vita che potrebbero prevenire o gestire COVID-19 .

Riferimenti

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12 Horby, PW, Mafham, M., Peto, L., Campbell, M., Pessoa-Amorim, G., Spata, E., ... & Landray, MJ (2021). Casirivimab e imdevimab in pazienti ricoverati in ospedale con COVID-19 (RECOVERY): uno studio su piattaforma randomizzato, controllato, in aperto. medRxiv.

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Javier T. Garza1* , Jacob Quick1* , Dev Chatterjee1* , Robert P. Garr1 , Atul Varadhachary1 , Leo Linbeck III1* 1Brevitest Technologies, Inc., Houston, TX. *Questi autori hanno contribuito allo stesso modo

Autori corrispondenti:

Javier Garza: javierg@fannininnovation.com

Dev Chatterjee: dev@fannininnovation.com

Interessi conflittuali:

JTG, JQ, DC, AV e LL sono dipendenti di Brevitest Technologies, Inc.

Supporto alla ricerca:

Lo sviluppo della piattaforma Brevitest è stato supportato dal National Institute on Drug Abuse (NIDA) e dal National Institute on Minority Health and Health Disparities (NIMHD) presso il National Institutes of Health (NIH), Grant Numbers: 1 R43 DA{{2} }; 1 R43 MD013409-01A1; 1 R43 DA043325-01, 2 R44 DA043325-02, 5 R44 DA043325-03; 3 R43 DA041966-01S1, la Fondazione Vijay e Marie Goradia e Fannin Innovation Studio.

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