Attenuazione dell'uveite autoimmune sperimentale nei ratti Lewis da parte della betaina

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L'uveite autoimmune sperimentale (EAU) è un modello animale di uveite autoimmune umana caratterizzata dall'infiltrazione di cellule T autoimmuni con aumenti concomitanti di citochine pro-infiammatorie e specie reattive dell'ossigeno. Questo studio mirava a valutare se la betaina regola la progressione dell'EAU nei ratti Lewis. L'EAU è stata indotta tramite immunizzazione con la proteina legante i retinoidi (IRBP) e la somministrazione orale di un veicolo o di betaina (100 mg/kg) per 9 giorni consecutivi. Milza, sangue e retina sono stati campionati dai ratti sperimentali al momento del sacrificio e utilizzati per il test di proliferazione delle cellule T, l'analisi sierologica, la reazione a catena della polimerasi in tempo reale e l'immunoistochimica. Il test di proliferazione delle cellule T ha rivelato che la betaina ha avuto scarso effetto sulla proliferazione delle cellule T spleniche contro l'antigene IRBP in un test in vitro il giorno 9 dopo l'immunizzazione. L'analisi sierologica ha mostrato che il livello di superossido dismutasi sierica è aumentato nel gruppo trattato con betaina rispetto a quello nel gruppo trattato con veicolo.estratto di cistanche tubulosaL'effetto antinfiammatorio della betaina è stato confermato dalla downregulation di molecole correlate all'infiammazione, inclusa la molecola di adesione delle cellule vascolari I e l'interleuchina-1 nelle retine dei ratti con EAU. I risultati istopatologici concordavano con quelli dell'immunoistochimica della molecola l dell'adattatore legante il calcio ionizzato, verificando ulteriormente che l'infiammazione nella retina e nei corpi ciliari era significativamente soppressa nel gruppo trattato con betaina rispetto al gruppo trattato con veicolo. I risultati del presente studio suggeriscono che la betaina è coinvolta nella mitigazione dell'EAU attraverso attività antiossidanti e antinfiammatorie.

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Parole chiave:Anti-infiammazione, Anti-ossidazione, Betaina, Uveite autoimmune sperimentale, Retina

introduzione

L'homing delle cellule T autoreattive e l'infiltrazione di cellule infiammatorie, come i monociti, innescano uveite e retinite nell'EAU [6]. La retina è danneggiata dall'infiammazione con l'attivazione delle cellule gliali che subiscono lo stress ossidativo[7].

La betaina, chiamata anche trimetilglicina (CH:NO:), è una sostanza naturale alcaloide e non tossica di Fructus Lycia e una sostanza antiossidante rappresentativa [8]. La betaina migliora l'infiammazione correlata all'età nei ratti attraverso il coinvolgimento del fattore nucleare-kB tramite la chinasi nucleare I kappa B chinasi e le protein chinasi attivate dal mitogeno [9], malattie cardiovascolari umane sopprimendo le citochine infiammatorie, inclusa l'interleuchina (IL){{ 6}} e il fattore di necrosi tumorale-a(TNF-a)[10], e la tumorigenesi del colon indotta da destrano solfato di sodio [11].recensioni di cistanche tubulosa,Inoltre, la betaina ha impedito l'angiogenesi/neovascolarizzazione patologica nei ratti con retinite diabetica [12] e ha protetto le cellule gangliari retiniche per aumentare l'acuità visiva in un modello animale di glaucoma [13]. Tuttavia, si sa poco sui meccanismi precisi alla base degli effetti della betaina nell'uveite.

In questo studio è stata valutata l'efficacia della betaina nell'alleviare l'EAU. Abbiamo studiato l'effetto antinfiammatorio della betaina in EAU sulla base dell'esame istopatologico e delle misurazioni delle citochine. Inoltre, il meccanismo specifico della betaina come antiossidante è stato valutato nei ratti con EAU.

MATERIALI E METODI

Animali

Entrambi i sessi di ratti Lewis (7 ~ 9 settimane; Orient Bio Inc, Gyeonggi-do, Corea) sono stati alloggiati nella nostra struttura in condizioni di laboratorio (12- h ciclo luce/oscurità, temperatura 23 ± 2 gradi). Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite seguendo le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio della Jeju National University (numero di autorizzazione:2020-0012). Tutti i protocolli sugli animali erano conformi alle leggi internazionali e alle politiche NIH, inclusa la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazione NIH n.85-23,1985, rivista 1996).

Induzione di EAU

I ratti sono stati immunizzati con 200 ul di un'emulsione mista composta da un volume uguale di proteina legante i retinoidi dell'interfotorecettore bovino (IRBP) (I mg/ml; PTARSVGAADGSS-WEGVGVVPDV, Komabiotech, Seoul, Repubblica di Corea) e adiuvante completo di Freund (CFA )integrato con me mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra(Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) sui polpastrelli degli arti posteriori.

Gruppi sperimentali

Per valutare gli effetti della betaina (Fig.1A) sull'EAU, sono stati designati quattro gruppi sperimentali come segue: controllo normale (n=8); Controllo CFA (n=8); EAU più veicolo (n=8) e EAU più betaina(n=8). La dose nel trattamento per testare l'effetto terapeutico della betaina(1 0 mg/kg di peso corporeo/giorno, B2629, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) è stato selezionato sulla base di uno studio precedente [14]. I ratti sono stati trattati per via orale 9 con betaina dal giorno 0 dopo l'immunizzazione fino al giorno 9 dopo l'immunizzazione.

Preparazione dei tessuti

I ratti sono stati sacrificati in anestesia profonda tramite inalazione di gas CO2 il giorno 9 dopo l'immunizzazione.cistanche Regno UnitoI tessuti per l'esame istopatologico sono stati inclusi in paraffina e sezionati

con un microtomo (RM 2135; Leica, Nussloch, Germania) ad uno spessore di 5 um e colorato con ematossilina ed eosina. Il sangue e la retina sono stati conservati a -80 gradi per l'analisi del siero e l'analisi della reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale.

Saggio di proliferazione dei linfociti T

Le cellule mononucleate della milza degli animali in ciascun gruppo sono state dissociate e sospese come descritto nel nostro studio precedente [15]. Quindi, ai pozzetti sono stati aggiunti 10 ug/ml di IRBP (concentrazione finale). Dopo 48 h di stimolazione con IRBP, le cellule sono state incubate in 1 μCi di 'H-metil timidina （attività specifica 42 Ci/mmol; Amersham, Arlington Heights, IL, USA) per 18 h. Quindi, le cellule sono state raccolte per misurare l'incorporazione di timidina.

Cistanche può antietà

Analisi sierologica

I ratti sono stati sacrificati alla data di campionamento e il sangue è stato raccolto attraverso il cuore. I campioni di sangue intero sono stati separati in siero e globuli utilizzando una centrifuga (VS-5500CFN; Vision Scientific, Daejeon, Repubblica di Corea). L'attività della superossido dismutasi (SOD) nel siero è stata valutata utilizzando un kit SOD (ab65354; Abcam, Cambridge, Regno Unito).

Immunoistochimica

L'immunoistochimica è stata eseguita utilizzando lo stesso protocollo descritto nel nostro studio precedente [16]. Gli anticorpi primari, inclusa la molecola ionizzata dell'adattatore legante il calcio (Ibal)(1:1,{5}};019-19741, Wako Pure Chemical Industries,Ltd,Osaka, Giappone),CD68(ED1;1:800;MCA341,Serotec,Kidlington,UK) e glutammina sintetasi(GS)(1:5,{14}};MAB302,Chemicon In -international, Temecula, CA, USA) sono stati usati rispettivamente come marker per microglia, macrofagi e cellule di Müller.

PCR in tempo reale

L'RNA totale nei bulbi oculari in tutti i gruppi (n=5 per gruppo) è stato isolato con TRIzol RNA Isolation Reagent (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) e il cDNA è stato preparato utilizzando CellScript M All-in -Un primo master mix di sintesi cDNA standard 5X (CellSafe, Gyeonggi-do, Repubblica di Corea). Le informazioni del primer sono elencate nella Tabella 1. La PCR è stata eseguita con un ciclatore MIC (BMS, Queensland, Australia) utilizzando 2x SYBR Green (PhileKorea, Seoul, Repubblica di Corea) e il seguente programma: 55 cicli di denaturazione (5 s,95 gradi), ricottura (20 s, 60 gradi) ed estensione (10 secondi, 72 gradi).

Analisi Western blot

L'analisi Western blot è stata eseguita con lo stesso protocollo descritto nel nostro studio precedente [16].cistanche wirkungGli anticorpi primari, tra cui la proteina 1 associata all'ECH simile a Kelch (Keap1)(1:1,{6}};abl19403,abcam,MA,USA) e il fattore nucleare eritroide-2-fattore correlato2(Nrf2 )(1:1,000;sc-722,Santa cruz,CA,USA).

analisi statistica

Tutte le misurazioni sono riportate come la media di tre esperimenti indipendenti. Tutti i valori sono presentati come l'errore standard medio della media (SEM). I risultati sono stati analizzati utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza seguita dal test posthoc Student-Newman-Keuls per confronti multipli. Un valore p<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">

RISULTATI

Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 rispetto a EAU più veicolo). Questi dati indicano che la betaina non era coinvolta nei linfociti T specifici dell'IRBP o nella loro auto-reattività.

La betaina ha sovraregolato i livelli sierici di SOD in EAU

Abbiamo valutato il danno ossidativo nel siero, utilizzando SOD come marker di modificazione ossidativa. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra i gruppi normali e CFA. L'attività SOD è diminuita significativamente nel gruppo EAU più Veicolo, rispetto ai livelli nei gruppi di controllo normale e CFA. Il trattamento con betaina ha ripristinato significativamente il livello di attività SOD a quello dei normali gruppi di controllo e CFA (Fig. 2). Questo risultato indica che il trattamento con betaina ha soppresso lo stress ossidativo nei ratti con EAU.

La betaina ha ridotto l'infiltrazione di cellule Ibal-positive nei corpi ciliari e nelle retine dei ratti indotti da EAU

Il corpo ciliare è il principale sito di infiltrazione delle cellule infiammatorie a causa dell'abbondanza di vasi sanguigni[18]. Solo poche cellule di tipo rotondo sono state rilevate nei corpi ciliari nei gruppi normali e CFA (Fig. 3A, 3B), mentre l'infiltrazione di alcune cellule di tipo rotondo è stata confermata nei gruppi indotti da EAU (frecce in Fig. 3C ,3D). I gruppi normale (Fig.3E) e CFA (Fig.3F) hanno mostrato risultati simili a quelli osservati per l'immunoreattività di Ibal. L'immunoreattività Ibal-positiva è aumentata nei gruppi EAU più veicolo e EAU più betaina (punte di freccia in Fig.3G, 3H). Tuttavia, il numero di cellule Ibal-positive è diminuito significativamente nel gruppo EAU più betaina rispetto al gruppo EAU più veicolo (Fig. 3I). Abbiamo anche analizzato la localizzazione di EDI come ulteriore approccio per valutare la posizione precisa dell'infiltrazione di cellule infiammatorie nel corpo ciliare. Le cellule positive 1-ED sono state rilevate raramente nel normale (Fig. 3G) e CFA (Fig. 3K )gruppi. Al contrario, numerose cellule ED1-positive sono state rilevate nei gruppi EAU più veicolo e EAU più betaina (doppie punte di freccia in Fig.3L, 3M).bioflavonoidi degli agrumiUn'analisi semiquantitativa del numero di cellule ED1-positive ha confermato che il trattamento con betaina ha soppresso l'infiltrazione di cellule infiammatorie nei corpi ciliari di ratti indotti da EAU.

Successivamente, abbiamo studiato i cambiamenti istopatologici nella retina (Fig. 4). Alcune cellule infiammatorie sono state rilevate nelle retine con EAU, ma non nelle retine di ratto normali e CFA (Fig. 4A ~ 4D). Le lesioni sono state valutate istopatologicamente in base alla gravità dell'EAU [17], rivelando un sollievo dall'infiammazione retinica (Fig.4E). L'attivazione delle cellule microgliali e di Müller che indica l'infiammazione retinica è stata confermata sulla base dell'immunoreattività globale (Fig.4F ~ 4I) e GS (Fig.4K ~ 4N), rispettivamente. La localizzazione di Ibal nella microglia era molto rara nei gruppi normali e CFA (punte di freccia in Fig. 4F, 4G, rispettivamente). L'attivazione della microglia è stata inibita nei ratti EAU (punte di freccia in Fig.4H) dal trattamento con betaina (Fig.4I, 4J). Il risultato dell'immunoreattività GS-positiva era simile a quello globale nella retina (Fig.4K ~ 4N). Le cellule di Müller attivate nel gruppo EAU plus Vehicle avevano livelli di immunoreattività GS inferiori (Fig. 40).

Molecola di adesione soppressa betaina e mediatori pro-infiammatori in EAU

Successivamente, abbiamo esaminato l'espressione della molecola di adesione utilizzando la PCR in tempo reale (Fig. 5A). È stata osservata una forte diminuzione del livello di mRNA della molecola di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM1) nel gruppo EAU più betaina (p<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">

La betaina ha sovraregolato gli enzimi antiossidanti catalasi (CAT) e SODinEAU

Lo studio dei livelli di danno ossidativo nel siero ci ha spinto a studiare lo stato di risposta antiossidante degli enzimi antiossidanti, inclusi CAT, SOD1, SOD2 e SOD3 (Fig.5C). Abbiamo osservato livelli di espressione significativamente sovraregolati di CAT, SOD1, SOD2 e SOD3 nei bulbi oculari del gruppo EAU più betaina rispetto al gruppo EAU più veicolo.

La betaina ha attivato la via Keapl-Nrf2

Per supportare l'effetto antiossidante della betaina, è stata esaminata la via Keapl-Nrf2 (Fig. 6). I livelli proteici di Keapl (0.75±{6}}.05 volte cambia,p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">

rispetto al controllo normale. D'altra parte, Keapl e Nrf2 hanno mostrato 1,46±0.{4}} cambiamenti di piega o 1.13±{7}}.34 cambiamenti di piega rispetto a quelli del gruppo EAU più Vehide (p<0.01 and=""><0.001,>

DISCUSSIONE

Questo è il primo studio che riporta che la betaina mitiga la progressione della patogenesi dell'EAU attraverso effetti antinfiammatori e antiossidanti, ma non sopprimendo la proliferazione delle cellule T (illustrazione schematica in Fig.7).

Si ritiene che l'effetto regolatorio della betaina nelle malattie autoimmuni, come evidenziato utilizzando l'EAU, un prototipo di malattia autoimmune, sia dovuto alla riduzione dello stress ossidativo e dei mediatori pro-infiammatori, ma non alla proliferazione dei linfociti T, da parte della betaina [19]. Allo stesso modo, il presente studio ha rivelato che la betaina ha scarso effetto sulla proliferazione delle cellule T e sul profilo delle citochine nel surnatante di coltura in un modello EAU, suggerendo che la betaina non influenza la risposta immunitaria della proliferazione delle cellule T autoimmuni nell'EAU. L'uvea è un organo bersaglio nell'EAU. L'uvea e la retina sono organi immunologicamente isolati senza linfatici [20]. Le cellule T autoimmuni nell'EAU sono invase da un ramo delle arterie ciliare e oftalmica [21]. Lo stress ossidativo è un segnale critico per la progressione della risposta infiammatoria e l'aumento delle specie reattive dell'ossigeno causa disfunzione endoteliale e danno tissutale [22]. Le cellule endoteliali disturbate portano alla promozione del passaggio di cellule infiammatorie e molecole infiammatorie [22]. I mediatori infiammatori e le cellule dell'uvea vengono attivati ​​nelle cellule epiteliali del pigmento retinico, che disturbano le giunzioni tra bastoncelli e coni e le cellule epiteliali pigmentate, portando a una retina distaccata [23]. Il corpo ciliare è un sito di ingresso per l'infiammazione oculare. La tipica infiammazione retinica è coinvolta nell'attivazione della microglia residente e nell'infiltrazione di cellule infiammatorie a causa della rottura della barriera emato-retina [24]. In condizioni neuropatologiche, inclusi tumori cerebrali [25], assotomia [26] e infezione da virus [27], i macrofagi e la microglia attivati ​​sono stati distinti da Ibal. Inoltre, le microglia residenti attivate sono coinvolte nei cambiamenti patologici che si verificano nelle malattie degenerative della retina e rilasciano mediatori infiammatori che esacerbano il processo patologico [28]. Questi risultati suggeriscono che la betaina esercita effetti antinfiammatori nell'uvea e nel corpo ciliare, i principali bersagli dell'EAU, e può ridurre lo stress ossidativo nel siero. Tuttavia, il meccanismo preciso resta da studiare.

Le microglia attivate sono la principale fonte di citochine pro-infiammatorie in condizioni degenerative della retina [29]. Le citochine pro-infiammatorie, inclusi IL e TNF, sono fortemente associate all'infiammazione oculare [30] e alla retinite [6,29]. Oltre alla microglia, le cellule di Müller vengono attivate in tutti gli eventi patologici che si verificano nella retina [31]. Le cellule di Müller attivate sono coinvolte nell'effetto neuroinfiammatorio nella retina sintetizzando e rilasciando molecole correlate all'infiammazione [31]. Postuliamo che la betaina mitighi la risposta infiammatoria nei ratti indotti da EAU sopprimendo l'attivazione della microglia e delle cellule di Müller. La sovraregolazione di VCAMl è fortemente coinvolta nell'infiltrazione delle cellule infiammatorie [32]. Il VCAMl viene inviato ai fagociti CD4 Tlym attraverso il cross-talk con l'antigene tardivo-4[3]. Inoltre, Serpina3n, un enzima che avvia infiammazione [34], è stata rilevata nelle cellule di Müller, negli astrociti e negli epiteli del pigmento retinico di retine danneggiate dalla luce [35] e ha livelli significativamente variabili nella retina del topo con cellule coniche danneggiate [36]. Serpina3n è aumentato in EAU ratti con grave infiammazione della retina ma è diminuita significativamente nel gruppo EAU trattato con betaina. Un risultato simile è stato riportato per la schizofrenia con neuroinfiammazione [34], poiché Serpina3n murino è un ortologo di Serpina3 umana [37]. Inoltre, è stato osservato un aumento di IL-1 nel danno retinico ad alto contenuto di fruttosio [38]. Postuliamo che l'effetto antinfiammatorio della betaina sia associato alla down-regulation di VCAM1, Serpina3n e IL-1 nei ratti indotti da EAU. Il percorso Keep-Nrf2 viene utilizzato per monitorare lo stress ossidativo [39]. La betaina era nota come molecola antiossidante, che era associata alla via Keapl-Nrf2 nel modello di danno epatico acuto indotto da paracetamolo [40]. Inoltre, il profilo dell'espressione genica epatica è stato eseguito dopo il trattamento con 3H-1,{46}}ditiolo{47}}tione, avente il ruolo di potenziare la disintossicazione degli agenti cancerogeni e di proteggere dalle neoplasie [4]. Il risultato di questa profilazione ha rivelato che il gene Keap1-Nrf2 regolava nrf2-dipendente 3H-1,{54}}ditiolo-3-inducibile gene, compreso AF033381, come la betaina omocisteina metil transferasi, è stata aumentata e coinvolta nella disintossicazione e nell'antiossidazione [41]. La risposta infiammatoria nell'EAU è stata indotta dall'infiltrazione di cellule infiammatorie, come cellule T e macrofagi [42], e dalla produzione di stress ossidativo, specialmente nei mitocondri dei fotorecettori della fase iniziale [43]. Secondo questi risultati, il trattamento con betaina era un candidato per alleviare il danno tissutale indotto da EAU modulando il percorso Keap1-Nrf2, come percorso chiave per la regolazione dello stress ossidativo.

L'effetto antiossidante della betaina è stato ampiamente valutato in modelli di danno indotto da radicali [44]. Nel cervello con danno ossidativo indotto dalla levodopa, la betaina è stata aumentata ai livelli di CAT e SOD, che sono enzimi antiossidanti rappresentativi [4]. SOD1, SOD2 e SOD3 sono attivati ​​da diversi meccanismi e sono localizzati rispettivamente nel citoplasma, nei mitocondri e nella matrice extracellulare [45]. La betaina, come molecola antiossidante, è coinvolta nella riduzione del danno ossidativo [46]. Il ridotto stress ossidativo è stato esteso alla risoluzione dell'infiammazione, indicata da macrofagi/microglia Ibal-positivi in ​​molte malattie, tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la sclerosi multipla [47]. Il trattamento con betaina è stato sovraregolato ai livelli di mRNA del marcatore di stress ossidativo, rispetto a quelli del gruppo EAU più veicolo. Questo risultato implica che il trattamento con betaina ha ridotto lo stress ossidativo nel sistema circolatorio senza interferire con la proliferazione delle cellule T negli organi immunitari del modello EAU di ratto.

Collettivamente, il presente studio suggerisce che la betaina può mitigare l'infiammazione nelle retine e nei corpi ciliari dei ratti indotti da EAU, possibilmente attraverso meccanismi anti-ossidazione e anti-infiammatori.

Questo articolo è estratto da https://doi.org/10.5607/en21011