Beta Vulgaris Rubra L. (Barbabietola) L'estratto di metanolo da buccia riduce lo stress ossidativo e stimola la proliferazione cellulare aumentando l'espressione di VEGF nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana stressate da H2O2

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Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subash-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 e Amna Abdullah Alotiby 2

Astratto:La capacità antiossidante dei polifenoli eflavonoidipresente negli agenti alimentari aiuta ad arrestare lo sviluppo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e a proteggere le cellule muscolari lisce endoteliali dallo stress ossidativo/necrosi indotta. La barbabietola (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) è un ortaggio comunemente consumato che rappresenta una ricca fonte diantiossidanti. I composti bioattivi della buccia di barbabietola e il loro ruolo nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) sono ancora poco studiati. Nel presente studio, è stato preparato l'estratto di metanolo con buccia di barbabietola (BPME) e il suo effetto sulla bioefficacia, sull'integrità nucleare, sul potenziale della membrana mitocondriale, sulla crescita delle cellule vascolari e sui livelli di espressione genica correlati all'immunoregolazione negli HUVEC con indottoossidativolo stress è stato analizzato. I risultati della gascromatografia-spettroscopia di massa (GC-MS) hanno confermato che il BPME contiene 5-idrossimetilfurfurale (32,6 percento), metil piruvato (15,13 percento), furfurolo (9,98 percento) e2,3-diidro{{11} },5-diidrossi-6-metil-4H-Pyran-4-uno (12,4 percento). L'estratto di BPM ha migliorato efficacemente la proliferazione cellulare ed è stato confermato dal test MTT; l'integrità nucleare è stata confermata dal saggio di colorazione con ioduro di propidio (PI); il potenziale di membrana mitocondriale (∆ψm) è stato confermato dal saggio di colorazione JC-1. Il dosaggio dell'allegato V ha confermato che gli HUVEC trattati con BPME hanno mostrato il 99% di cellule vitali, ma solo il 39,8% di vitalità è stata mostrata negli HUVEC trattati con H2O2 da solo. Inoltre, il trattamento BPME di HUVEC per 48 ore ha ridotto l'espressione dell'mRNA del perossido lipidico (LPO) e ha aumentato NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, sintasi di ossido nitrico endoteliale (eNOS ) e livelli di espressione di mRNA del fattore di crescita delle cellule vascolari (VEGF). Abbiamo scoperto che il trattamento con BPME ha ridotto il proinfiammatorio (fattore nucleare-κ (F-κ), fattore di necrosi tissutale- (TNF-), recettore toll-like-4 (TLR-4), interleuchina{{37} } (IL-1 )) e vascolareinfiammazione(molecola di adesione intracellulare (ICAM), molecola di adesione cellulare vascolare (VCAM), EDN1, IL-1) espressioni di mRNA correlate. In conclusione, il trattamento con buccia di barbabietola ha effettivamente aumentato i fattori di crescita delle cellule lisce vascolari e lo sviluppo dei microtubuli, mentre ha ridotto i regolatori dell'infiammazione vascolare. Il BPM può essere utile per la rigenerazione delle cellule lisce vascolari, la riparazione dei tessuti e il potenziale anti-invecchiamento.

Parole chiave:barbabietola; lo stress ossidativo; mitocondri; angiogenesi; infiammazione

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1. Introduzione

L'angiogenesi è il processo fisiologico di vasculogenesi dal sistema vascolare esistente del corpo [1]. È essenziale non solo per lo sviluppo e la riproduzione embrionale, ma anche per il ciclo cellulare e la riparazione dei tessuti [2,3]. Tuttavia, è associato alla patogenesi di varie malattie, come la crescita del tumore, l'artrite reumatoide e varie malattie ischemiche e infiammatorie [3-5]. L'endotelio vascolare svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'emostasi vascolare regolando il tono dei vasi sanguigni e le reazioni immunitarie e infiammatorie [6,7]. Le cellule endoteliali (EC) sono sottili strati monocellulari che rivestono tutte le superfici interne dei vasi sanguigni e producono una varietà di molecole che agiscono localmente o in siti distanti [7]. L'endotelio è fondamentale per l'omeostasi corporea, e qualsiasi alterazione nella risposta cellulare dell'endotelio porta agli eventi primari dei processi infiammatori e vascolari, come l'aterosclerosi e l'ipertensione [6,8,9]. Queste malattie causano stress ossidativo, che altera la struttura dell'EC e l'integrità della funzione e porta alla disfunzione endoteliale [9]. Le EC della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state ampiamente utilizzate come modello per gli studi relativi all'endotelio vascolare umano. Inoltre, rappresentano un modello utile per lo studio delle principali vie biologiche coinvolte nella funzione dell'endotelio [10]. Composti bioattivi e sostanze fitochimiche si trovano in abbondanza in frutta, verdura, erbe verdi e molte piante, che mostrano numerosi benefici per la salute, come proprietà antinfiammatorie, antiossidanti, antitumorali e angiogeniche [11-13]. A questo proposito, la barbabietola rossa (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) appartiene alla famiglia delle Amaranthaceae ed è classificata come una delle migliori fonti di alti livelli di antiossidanti [14,15]. In particolare, contiene più sostanze fitochimiche biologicamente attive, tra cuibetalaine, flavonoidi,polifenoli, enzimi terapeutici, acido ascorbico, acido deidroascorbico (DHAA) e nitrato inorganico (NO3) [16-18]. Inoltre, fornisce preziosi nutrienti essenziali, come potassio, calcio, magnesio, sodio, ferro, zinco, fosforo, rame e manganese [19]. Diversi studi hanno riportato che l'estratto di barbabietola rossa (radice) ha numerosi effetti benefici a causa delle sue proprietà ipoglicemizzanti, ipolipemizzanti, antinfiammatorie, antiipertensive e antiproliferative [20-22]. Queste proprietà benefiche possono essere tutte collegate alle capacità di scavenging dei radicali liberi dei composti bioattivi. Pertanto, il consumo di barbabietola rossa è stato collegato a numerosi benefici nutrizionali e per la salute. A causa del suo valore nutritivo, può essere utilizzato come fonte di cibo funzionale contro gli stress ossidativi che inducono malattie metaboliche croniche, come il diabete di tipo 2 e le malattie cardiovascolari [23]. Sulla base della revisione della letteratura, Beta vulgaris possiede potenti proprietà antiossidanti, immunoregolatrici e angiogeniche. L'apigenina è stata trovata nelle foglie di barbabietola; ha effetti antiproliferativi nel fegato e nelle cellule intestinali e può migliorare la comorbidità dell'obesità indotta da dieta ricca di grassi tramite l'attivazione di AMPK [24,25]. De Silva et al., (2020) [26] hanno identificato che Beta vulgaris protegge le EC vascolari dallo stress ossidativo indotto dall'esterno, che può essere dovuto all'effetto combinato di diversi composti bioattivi presenti in questa pianta. Finora, l'azione meccanicistica per la proliferazione dell'EC e l'effetto angiogenesi della buccia della radice di Beta vulgaris è stata poco studiata. Quindi, abbiamo mirato a condurre il presente studio per esaminare la proliferazione delle cellule vascolari, lo sviluppo dei microtubuli, lo stress ossidativo e la capacità di angiogenesi correlata alla buccia della radice di Beta vulgaris utilizzando la morfologia cellulare e l'analisi dell'espressione genica negli HUVEC. Vengono esplorati gli effetti angiogenici dell'estratto di metanolo con buccia di barbabietola rossa associati all'integrità nucleare, allo sviluppo dei microtubuli, all'efficienza mitocondriale e alla stimolazione del ciclo cellulare nelle EC vascolari umane.

2. Materiali e metodi

2.1. Preparazione della barbabietola(Beta vulgaris rubra L.) Estratto di metanoloCampioni di barbabietola fresca (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) sono stati inizialmente ottenuti da negozi di ortaggi, Riyadh, Regno dell'Arabia Saudita (KSA). Le barbabietole fresche sono state lavate con acqua distillata per eliminare i gambi e gli agenti contaminanti. La pelle esterna è stata sbucciata per essere rimossa e tagliata a pezzetti. I campioni sono stati essiccati in un forno ad aria calda a 40 ◦Ce poi macinati in polvere utilizzando un frullatore elettronico. Quindi, 5{{10}}0 g della polvere sono stati estratti in una bottiglia sterile contenente 1 L di metanolo (Sigma, St. Louis, MO, USA) per 24 ore a temperatura ambiente su uno shaker e ripetuto tre volte. Successivamente, per filtrare l'estratto è stato utilizzato un Whatmanfifilter (Whatman, Clifton, NJ, USA). Infine, riducendo la pressione, il solvente è stato separato dall'estratto e l'estratto è stato raccolto come sostanza secca solida dopo evaporazione del metanolo. Il campione estratto è stato conservato in frigorifero a 4 ◦C fino al successivo utilizzo. 2.2. Gascromatografia e analisi della spettroscopia di massa L'estratto di metanolo di buccia di barbabietola (BPME) è stato iniettato in una colonna capillare di silice (30 m × {{60}}.25 mm ID × 0 0,25 µm di spessore della pellicola) dello strumento GC-MS (Agilent 6890N/5973I, California, CA, USA) con un rilevatore di massa selettiva per rilevare le composizioni chimiche. La temperatura dello strumento è stata impostata come iniziale da 7{{90}} ◦C, mantenendo 2 min, a 305 ◦C a 20 ◦C/min, seguita da 1 min. Il tempo di esecuzione totale del GC è stato impostato su 45 minuti con il gas elio (99,999 percento) come gas di trasporto (una frequenza costante di 1,2 mL/min), 250 ◦C come temperatura dell'iniettore e 230 ◦C come sorgente di ioni temperatura. Sulla base dello spettro GC-MS, è stata calcolata la percentuale relativa del componente corrispondente e sono stati identificati gli spettri di massa del componente sconosciuto rispetto ai 62,{29}} pattern noti disponibili nel National Institute of Standard and Technology libreria informatica (NIST08). 2.3. Materiali per colture cellulari e sostanze chimiche Gli HUVEC sono stati acquistati dall'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Materiali di coltura cellulare come Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, EDTA, tripsina e altri sono stati ottenuti da Gibco (Paisley, Regno Unito). La penicillina-streptomicina (PS) e il siero fetale bovino (FBS) sono stati acquistati da Hyclone Laboratories, USA. Le sostanze chimiche utilizzate nell'esperimento di biologia molecolare sono state ottenute da Sigma-Aldrich, in particolare, MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5- difeniltetrazolio bromuro], PI e JC-1. Il SYBR Green PCR Master Mix e il kit di sintesi del cDNA sono stati ottenuti da Qiagen (Hilden, Germania). 2.4. HUVEC Gli HUVEC sono stati coltivati ​​in DMEM e integrati con l'1% di PS e il 10% di complesso FBS. Le cellule sono state incubate in un'atmosfera umidificata a 37 ◦C, 5% di CO2 e sottocoltivate circa ogni 3 giorni. 2.5. Vitalità cellulare e proliferazione cellulare mediante test MTT Le HUVEC (1 × 104 cellule/pozzetto) sono state coltivate con un mezzo di mantenimento e lasciate aderire per una notte in una piastra di coltura 96-. Quindi, il mezzo è stato sostituito con un nuovo mezzo di coltura contenente concentrazioni crescenti di BPME (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 e 3,2 µg/mL) secondo la mappa della piastra del dosaggio MTT e incubato per 24 e 48 h; cellule non trattate sono state utilizzate come controlli. Dopo il periodo di incubazione, le cellule sperimentali sono state trattate con 20 µL/pozzetto di 5 mg/mL di MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2, 5-bromuro di difeniltetrazolio che è stato sciolto in dimetilsolfossido (DMSO)) e ulteriormente incubato per 4 ore a 37 ◦C. Quindi, il mezzo è stato scartato e il formazan viola prodotto è stato sciolto in 100 µl di DMSO al 100%. L'assorbanza della soluzione è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) a una lunghezza d'onda di 570 nm. La percentuale (percentuale) di proliferazione cellulare è stata calcolata mediante la seguente equazione: (assorbanza del campione/assorbanza media del controllo) × 100. 2.6. Disegno sperimentale Secondo il presente saggio di proliferazione cellulare, la concentrazione inferiore testata di BPME (0,1 e 0,2 µg/mL) ha mostrato HUVEC proliferanti e morfologia dei microtubuli senza tossicità. Volumi di 0,1 e 0,2 µg/mL di dose di BPME sono stati selezionati e trattati con HUVEC normali e 10 mM di HUVEC stressati ossidativi indotti da H2O2- per 48 ore per determinare la proliferazione cellulare, i potenziali antinfiammatori, angiogenici e apoptotici (Figura 1). Anche il controllo del veicolo è stato mantenuto per 48 ore in entrambi i gruppi. La quercetina (10 µM) è stata utilizzata come controllo di riferimento in entrambi i gruppi sperimentali. Dopo l'incubazione, le cellule non trattate e sperimentali sono state analizzate per la morfologia cellulare e nucleare e il potenziale della membrana mitocondriale utilizzando un kit BDTM MitoScreen (JC-1); l'apoptosi è stata determinata dal metodo di smistamento cellulare basato sull'annessina V/apoptosi in un'altra citometria. Sono stati studiati i livelli di espressione genica correlati allo stress ossidativo, proinfiammatorio e all'angiogenesi.

2.7. Saggio di colorazione dello ioduro di propidio per danni nucleari Morfologie cellulari per danno nucleare caratteristico, picnosi o cambiamenti morfologici apoptotici dopo il trattamento con 0.1 e 0.2 µg/mL di BPME (con o senza H2O2) negli HUVEC è stato determinato utilizzando l'analisi della colorazione PI al microscopio a fluorescenza invertita, come descritto da Leite et al. [27].

2.8. Saggio del potenziale della membrana mitocondriale (∆ψm) mediante colorazione del colorante JC-1 Il potenziale della membrana mitocondriale (∆ψm) è stato determinato mediante saggio JC-1 per valutare l'efficienza mitocondriale nel controllo del veicolo e {{4} }.1 e 0.2 µg/mL di HUVEC trattati con BPME (con e senza H2O2). In breve, la soluzione colorante JC-1 è stata miscelata con un volume simile di mezzo di coltura e quindi aggiunta alle HUVEC sperimentali e incubata al buio per 20 minuti a 37 ◦C. Quindi, il colorante JC-1 non legato è stato lavato delicatamente due volte utilizzando 200 µl di tampone di lavaggio colorante JC-1 a 4 ◦C. Successivamente, l'accumulo di j-aggregato contro la colorazione JC-1 è stato osservato al microscopio a fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza e sono state acquisite le immagini. Inoltre, il potenziale della membrana mitocondriale è stato misurato in citometria a flusso utilizzando il kit BDTM MitoScreen (JC-1).

2.9. Analisi dell'annessina V/apoptosi mediante citometria a flusso Il metodo del kit di rilevamento dell'annessina V/PI basato sulla citometria (Sigma Chemicals, USA) è stato utilizzato per quantificare le cellule vitali, proapoptotiche, apoptotiche precoci e necrotiche. Le HUVEC indotte da stress ossidativo (1 × 105/pozzetto) sono state piastrate in 24-piastre a pozzetti e incubate con BPME (0.1 e 0,2 µg/mL) o controllo del veicolo per 48 ore Dopo l'incubazione, le cellule sono state incubate in 400 µl di 5 µl di annessina V-fluoresceina isotiocianato (FITC) e 5 µl di tampone di legame contenente PI; in seguito, le cellule sono state mantenute per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) al buio. Le cellule sono state analizzate mediante citometria (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) per identificare cellule apoptotiche (PI negativo e annessina V positiva) e apoptotiche tardive (PI-positive e annessina V positive) [28].

2.10. Analisi PCR quantitativa in tempo reale Il kit Fastlane® Cell to cDNA (Qiagen, Hilden, Germania) è stato utilizzato per estrarre l'RNA totale e il cDNA di sintesi dal controllo del veicolo, HUVEC trattati con BPME (con e senza H2O2) utilizzando una PCR quantitativa (qPCR) semiautomatica strumento (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Livelli di espressione dello stress ossidativo inclusi (perossido lipidico, NOS-3), antiossidante (Nrf-2, GSK-3 e GPx), proinfiammatorio (fattore nucleare-κ (NF-κ), fattore di necrosi tumorale- (TNF- ), interleuchina-1 (IL-1 ), fattore di crescita delle cellule vascolari (VEGF), recettore toll-like-4 (TLR-4)) e infiammazione vascolare (molecola di adesione intracellulare (ICAM), molecola di adesione cellulare vascolare (VCAM), EDN1 e geni correlati all'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS)) e il gene di riferimento, -actina, sono stati analizzati in HUVEC e quantificati dal metodo di Yuan et al. [29]. I valori di amplificazione (∆Ct) sono stati calcolati dalla differenza tra Ct (trattato) e Ct (controllo). L'espressione genica è stata tracciata utilizzando l'espressione del valore 2−∆∆Ct.

2.11. Analisi statistica Tutti gli esperimenti sono stati triplicati ei dati risultanti sono stati espressi come valori medi ± deviazione standard (DS). L'analisi statistica delle differenze tra i gruppi è stata eseguita mediante analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) utilizzando il software SPSS (versione 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Quindi, il test di confronto multiplo di Tukey è stato condotto se sono state rilevate differenze significative. Tutti i risultati sono stati presentati come media ± DS per sei repliche in ciascun gruppo. Un valore p < 0.05="" è="" stato="" considerato="" significativo="">

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3. Risultati

3.1. Molecole bioattive nella BPME I costituenti chimici della BPME sono stati confermati mediante GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). La composizione chimica dell'estratto di buccia di barbabietola è stata determinata confrontando gli spettri di massa disponibili con il database spettrale del National Institute of Standard and Technology (NIST). I risultati GC-MS hanno confermato che il BPME conteneva idrossiacetone (8,18 percento), 5-idrossimetilfurfurale (32,6 percento), metil piruvato (15,13 percento), beta-d-allopiranosio (1,48 percento), furfurolo (9,98 percento), 2-idrossi-gamma-butirrolattone (1,32 percento) e 2,3-diidro-3,5-diidrossi- 6-metil-4H-pirano -4-uno (12,4 percento; Figura 2a, Tabella 1). 3.2. Proliferazione cellulare Il potenziale di proliferazione cellulare in vitro di BPME contro HUVEC è presentato nella Figura 2b. Nessuna significativa inibizione della crescita cellulare è stata osservata nei gruppi sperimentali rispetto al controllo del veicolo. È stato confermato dal presente studio che l'aumento della concentrazione di BPME trattata con HUVEC ha comportato un aumento della proliferazione cellulare e della vitalità dopo 48 ore (112%) rispetto a 24 ore (103%) di trattamento. Inoltre, le immagini al microscopio ottico degli HUVEC trattati con BPME dopo 48 ore hanno confermato le cellule normali con la forma uniforme della morfologia cellulare aderente, era evidente un aumento del numero di cellule proliferanti (replicanti) senza alcun danno (Figura 2c). 3.3. Analisi della morfologia cellulare e nucleare, della formazione di microtubuli e della colorazione JC-1 negli HUVEC La Figura 3 mostra la morfologia dello sviluppo dei microtubuli nelle immagini microscopiche a fluorescenza FL. Gli HUVEC stressati ossidativi indotti da H2O2- hanno mostrato scarsa proliferazione e morfologia irregolare delle cellule aderenti rispetto agli HUVEC di controllo. Gli HUVEC normali trattati con 0.2 µg/mL di BPME hanno mostrato cellule proliferanti tramite replicazione o neogenesi con morfologia dei microtubuli. Nel frattempo, una dose di 0,1 µg/mL di cellule trattate con BPME ha mostrato l'100% di cellule aderenti con stadi iniziali di microtubuli. Gli HUVEC stressati ossidativi trattati con 0,2 µ g/mL di BPME hanno identificato la proliferazione di nuove cellule con morfologia dei microtubuli e una diminuzione del danno cellulare ossidativo. Inoltre, 0,1 µ g/mL di BPME ha anche aumentato la normale morfologia delle cellule vascolari con cellule proliferanti.

La Figura 4a mostra la normale morfologia della struttura nucleare, con una forma sferica, nel controllo e negli HUVEC trattati con BPME (0.1 o 0.2 µg/mL). La Figura 4b mostra le immagini per la colorazione PI di normali e HUVEC con stress ossidativo indotto da H2O2. Le HUVEC trattate con H2O{{10}} mostrano nuclei di forma irregolare, con condensazione e picnosi dopo 30 min. Tuttavia, 0.2 µg/mL di trattamento con BPME per HUVEC sotto stress ossidativo ha mostrato nuclei circolari con morfologia normale. Rispetto a 0,2 µg/mL di estratto di BPME, 0,1 µg/mL di BPME ha avuto un effetto protettivo minore contro lo stress ossidativo indotto da H2O2- negli HUVEC.

Figura 2. Risultati per il cromatogramma GC-MS dell'estratto di metanolo della buccia di barbabietola (a), della proliferazione cellulare in vitro (b) e delle immagini al microscopio ottico per la morfologia cellulare (c) negli HUVEC, trattati con una concentrazione crescente di estratto di metanolo dalla buccia di barbabietola (BPME) ) (forma uniforme delle cellule aderenti e proliferanti indicate dalla punta di freccia rossa). Tutti i valori sono medie ± SD (n=6). * p Minore o uguale a 0.05 rispetto al controllo del veicolo.

Figura 3. Analisi della formazione di microprovette basata su fluorescenza microscopica nel controllo del veicolo, 0.1 e 0.2 µg/mL di estratto di buccia di barbabietola con metanolo (BPME) trattato normale e H2O{{6} } HUVEC indotti da stress ossidativo dopo 48 h. Dopo 48 h, gli HUVEC stressati ossidativi indotti da H2O2- hanno mostrato una morfologia alterata rispetto al controllo del veicolo. Volumi di 0.1 e 0.2 µg/mL di HUVEC trattati con estratto di metanolo da buccia di barbabietola (BPME) hanno mostrato una morfologia normale con microtubuli vascolari con cellule proliferanti che assomigliano alla morfologia comune del comportamento delle cellule muscolari lisce.

Figura 4. Analisi della colorazione con ioduro di propidio (PI) per la morfologia nucleare nel controllo del veicolo, 0.1 e 0.2 µg/mL di estratto di metanolo da buccia di barbabietola (BPME) trattato normale (3a) e HUVEC (3b) stressati ossidativi indotti da H2O2- dopo 48 h. Nella colorazione PI, il controllo del veicolo ha mostrato che il nucleo sembrava essere normale senza segni di rimpicciolimento, picnosi o nucleo apoptotico. Nella sola H2O2, le cellule trattate hanno mostrato una membrana nucleare polarizzata dopo 48 h. Il trattamento con 0,2 µg/mL di BPME ha normalizzato la polarizzazione della membrana nucleare indotta da H2O2- rispetto a 0,1 µg/mL di BPME o quercetina 10 µM.

La Figura 5a mostra i risultati della colorazione JC-1 per gli HUVEC, comprese le cellule di controllo e trattate con BPME; la figura illustra cellule sane con mitocondri attivi, come confermato dall'assorbimento mitocondriale caricato negativamente del cationico lipofilo extramitocondriale JC-1 (colore verde) e aggregati J convertiti con colore rosso intramitocondrialmente. La Figura 5b mostra i risultati della colorazione JC-1 per 0.2 µg/mL di BPME somministrato a HUVEC con stress ossidativo indotto da H2O2; i risultati hanno confermato che quasi il 94% dei mitocondri carichi negativamente ha convertito il cationico lipofilo JC-1 (colore verde) in aggregati J di colore rosso rispetto a 0.1 µg/mL di trattamento con BPME (61,4%) o stress ossidativo indotto da H2O{{20}} negli HUVEC (2 percento). È stato osservato che il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) è maggiore nelle cellule trattate con BPME rispetto al farmaco di riferimento quercetina. 3.4. Potenziale della membrana mitocondriale assistita da FACS (∆ψm; BD MitoScan) e analisi dell'annessina V/apoptosi negli HUVEC La Figura 6 mostra la capacità potenziale della membrana mitocondriale nell'analisi BD MitoScan dopo 0.2 µg/mL di trattamento con BPME di HUVEC normali e HUVEC con stress ossidativo indotto da H2O2. Abbiamo scoperto che 0,2 µg/mL di trattamento con BPME aumentavano l'MMP (∆ψm) al 92,7% ± 3,7% rispetto agli HUVEC trattati con H2O2 da solo (27,9% ± 7,2%). Al contrario, le cellule trattate con quercetina hanno mostrato una percentuale del 41,4% ± 1,6% di aumento della MMP (∆ψm) rispetto agli HUVEC trattati con BPME e H2O2 o H2O2 da soli.

Figura 5. Analisi del potenziale di membrana mitocondriale utilizzando la colorazione JC-1 per il controllo del veicolo, 0.1 e 0.2 µg/mL di estratto di metanolo di buccia di barbabietola (BPME) trattato normalmente (a ) e HUVEC (b) stressati ossidativi indotti da H2O2- dopo 48 h. JC{{1{16}}}}immagini di fluorescenza che mostrano immagini unite dei segnali rosso e verde del colorante, corrispondenti a JC-1 in aggregati J rispetto alla forma monomerica. Abbiamo trovato meno HUVEC trattati con H2O2 con aggregati J. In 0,2 μg/mL HUVEC trattati con BPME che mostrano aggregati j elevati che rappresentano direttamente (MMP elevato, ∆ψm) un potenziale di membrana mitocondriale elevato rispetto a 0,1 μg/mL di BPME o 10 μM di quercetina.

4. Discussione

In caso di stress extracellulare o intracellulare, la biodisponibilità delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) supera la difesa antiossidante e lo stress ossidativo interrompe la segnalazione e il controllo redox [31]. Lo sviluppo dello stress ossidativo è associato alla patogenesi di malattie croniche, come malattie neurodegenerative, diabete e aterosclerosi. Ad esempio, lo stress ossidativo avvia la disfunzione endoteliale e promuove l'infiammazione sistemica e il reclutamento di macrofagi [32]. Le cellule immunitarie attivate migrano nel sistema vascolare e rilasciano citochine e chemochine associate alla vasocostrizione e al rimodellamento dei vasi sanguigni delle cellule muscolari lisce e all'infiammazione che colpisce le cellule muscolari lisce vascolari e la parete vascolare [33]. L'aumento dello stress ossidativo vascolare termina con danni vascolari, rigidità delle cellule muscolari lisce e anomalie strutturali dell'elastina. Inoltre, lo stress ossidativo vascolare è stato stimolato in altre condizioni patologiche, come l'obesità viscerale o l'aterosclerosi, a causa dell'aumentata attività della NADPH ossidasi (NOX-2) nel tessuto adiposo perivascolare [34]. Lo stress ossidativo vascolare provoca i principali cambiamenti epigenetici che si verificano durante l'invecchiamento e termina con un processo di invecchiamento precoce [35]. Lo sviluppo della produzione di ROS e dello stress ossidativo nel sistema biologico dipende in gran parte dalla disfunzione mitocondriale, oltre a NOX-2, xantina ossidasi endoteliale, eNOS disaccoppiata e lipossigenasi [36]. Le proprietà antiossidanti degli agenti dietetici possono neutralizzare la generazione di ROS attraverso una maggiore capacità antiossidante [26]. L'estratto di Ginkgo Biloba protegge dallo sviluppo dell'aterosclerosi riducendo la generazione di ROS e l'attività della lipossigenasi nella disfunzione endoteliale indotta da OxiLDL [37]. Inoltre, vari composti fenolici eflavonoidi dapiante e cereali commestibili hanno la proprietà di spazzare via i ROS e la perossidazione lipidica [38]. L'estratto metanolico di buccia di barbabietola (Beta vulgaris) ha un potenziale antiossidante grazie alla disponibilità di fibre, antociani e flavonoidi come vitexina e betanina [39]. Nel presente studio, BPME è stato selezionato per identificare l'approccio meccanicistico mitocondriale-dipendente per scoprire il suo effetto sul potenziale della membrana mitocondriale, sull'estinzione dell'LPO e sull'inibizione dei livelli di espressione dell'mRNA correlati all'infiammazione vascolare. Il test MTT ha confermato che la BPME ha aumentato significativamente la proliferazione cellulare, come confermato dalla maggiore integrità nucleare nella colorazione PI con la dose efficace di 0.2 µg/mL di BPME rispetto a 0.1 µg/mL testato di BPME. L'identificazione della dose efficace con bassa concentrazione e massima attività può essere considerata fisiologicamente sicura. Abbiamo trovato la colorazione microscopica della fluorescenza FL di JC-1 e il potenziale della membrana mitocondriale è stato ripristinato sia negli HUVEC normali che in quelli H2O{{10}} indotti da stress ossidativo stimolati esternamente dopo 0,2 µg/mL di BPME trattamento. La disfunzione mitocondriale altera la fosforilazione ossidativa, che non riesce a trasformare i radicali dell'ossigeno (O2·−) in H2O2 e H2O dalla glutatione perossidasi. A causa dell'insufficiente disintossicazione dei ROS o della produzione incontrollata di ROS, l'aumento dello stress ossidativo mitocondriale è collegato all'aterosclerosi [40]. Gli estratti di buccia di barbabietola hanno efficacemente ripristinato il potenziale della membrana mitocondriale, aumentando con successo la disintossicazione dei ROS e la generazione di H2O2. L'analisi della colorazione con annessina V/PI ha confermato che il trattamento con BPME ha mantenuto la percentuale di cellule vitali e ha migliorato lo stadio di proliferazione cellulare sia nelle HUVEC normali che nelle HUVEC con stress ossidativo indotto da H2O2. In questo contesto, Choo et al. [41] hanno confermato che dopo la generazione di ROS in eccesso o H2O2 esogena nel sito ischemico, le cellule staminali mesenchimali (MSC) trapiantate possono compromettere l'autoproliferazione e la capacità multi-lignaggio. Nella medicina rigenerativa, le cellule muscolari lisce vascolari sono i principali regolatori delle arterie del tono contrattile attraverso il mantenimento della resistenza periferica arteriosa, i regolatori della pressione sanguigna, i compagni di sangue e la riparazione delle arterie [42]. Inoltre, la modulazione fenotipica delle EC indotta dall'età è associata a una diminuzione della contrattilità cellulare e all'aumento della senescenza cellulare. In caso di stress continuo oa causa della ridotta meccanosensibilità, nelle cellule muscolari lisce invecchiate viene identificato un ridotto adattamento dei segnali del microambiente [43]. I risultati attuali hanno confermato che il trattamento con BPME ha mantenuto la popolazione cellulare vitale, come evidenziato dalla capacità di angiogenesi. La capacità di proliferazione identificata di BPME sugli HUVEC è stata supportata dalla riduzione dell'espressione di LPO e dall'aumento delle espressioni geniche antiossidanti. ROS e LPO sono inizialmente generati dal complesso mitocondriale (I e III) e NOX-4 durante la proliferazione o differenziazione cellulare [44]. I ROS eccessivi reagiscono e danneggiano le biomolecole, in particolare alterando l'integrità del DNA genomico, che è fondamentale per la proliferazione e le funzioni cellulari [45]. Tuttavia, è stato confermato che l'assunzione con la dieta di polifenoli antiossidanti, come epigallocatechina e tocoferolo, protegge le cellule dallo stress ossidativo e aumenta la capacità di proliferazione [46]. Nel nostro studio, i livelli di espressione dell'mRNA di LPO sono diminuiti e si è riscontrato che NOS-3, Nrf-2 ed eNOS sono aumentati di due volte nelle HUVEC con stress ossidativo indotto da H2O2. eNOS è l'isoforma predominante di NOS, responsabile della maggior parte dei prodotti NO·nelle cellule muscolari lisce e nei tessuti vascolari. NO· dilata tutti i tipi di vasi vascolari e protegge l'aggregazione piastrinica e l'adesione dei leucociti nelle EC [47]. Finora, ci sono stati molti rapporti contrastanti sui fattori di rischio cardiovascolare e la disfunzione endoteliale è stata associata a una ridotta o aumentata espressione di eNOS [48]. Elevata espressione di eNOS osservata su malattie vascolari, che potrebbe essere una conseguenza dell'eccessiva produzione di H2O2. L'O2·−, un prodotto di dismutazione, può aumentare l'espressione di eNOS attraverso meccanismi trascrizionali e post-trascrizionali [49]. La patogenesi della malattia vascolare è accompagnata da una degradazione accelerata di NO· dopo la reazione con O2·− e, infine, dalla forma ONOO−, che porta al disaccoppiamento di eNOS e alla disfunzione dell'enzima NOX [50]. Lo stress ossidativo è stato soppresso dagli enzimi antiossidanti e i livelli di mRNA di GSK-3 e GPX sono stati aumentati dopo il trattamento con BPME. Il BPME contiene molteplici sostanze fitochimiche biologicamente attive, tra cui betalaine, flavonoidi, polifenoli, enzimi terapeutici, acido ascorbico, acido deidroascorbico (DHAA) e nitrato inorganico (NO3), e questi possono essere coinvolti nella sovraregolazione della capacità antiossidante negli HUVEC. In questo contesto, Cha et al. (2014) [51] hanno riportato che l'acido clorogenico protegge efficacemente dal danno al DNA indotto dallo stress ossidativo nei cheratinociti umani. L'endotelina-1 (Edn-1), un vasocostrittore derivato dall'endotelio, esegue la migrazione delle cellule muscolari lisce e agisce come fattore antiapoptotico nelle cellule con stress indotto dall'ossido nitrico [52,53]. I processi di rimodellamento vascolare, migrazione, proliferazione e accumulo di matrice extracellulare sono stati stimolati sia da Edn-1 che da NO [54,55]. Abbiamo osservato un aumento dell'espressione di Edn-1 dopo il trattamento con BPME negli HUVEC con stress ossidativo. In caso di stress ossidativo o accumulo di LPO, la fase iniziale dell'infiammazione vascolare è l'adesione dei leucociti alle cellule muscolari lisce endoteliali, è importante per gli eventi critici di ischemia e aterosclerosi [56]. È mediato dalle espressioni VCAM e ICAM; è stato stimolato da molte delle chemochine e agenti chemiotassi, come le espressioni di NF-κB, IL-1 e TNF [57]. L'inibizione dell'attivazione di IL-1 seguita dall'espressione della molecola di adesione è stata ottenuta dal composto fenolico dietetico acido ellagico [58]. Il trattamento con BPME per HUVEC stimolati esternamente con stress ossidativo ha ridotto significativamente i fattori proinfiammatori specifici delle cellule vascolari, come VCAM, ICAM, NF-κB, IL{73}} e livelli di espressione di TNF. In questo contesto Crespo et al. [59] hanno riportato che il kaempferolo e la quercetina inibivano i geni pro-infiammatori, come le espressioni VCAM, ICAM, NF-κB e IL{78}}, rispettivamente. Nel complesso, l'inibizione dello stress ossidativo e del potenziale di espressione genica correlato all'infiammazione vascolare di BPME ha favorito l'espressione dei fattori di crescita delle cellule vascolari e la proliferazione e la crescita delle cellule vascolari potenzialmente aiutate.

5. Conclusioni

I presenti risultati confermano che l'aumentata espressione di geni antiossidanti era associata all'estinzione dello stress ossidativo, aiutando a superare il deterioramento della proliferazione e dell'angiogenesi di HUVEC. L'aglio nero contenente idrossimetilfurfurale sopprime l'effetto infiammatorio dell'adesione delle cellule monocitarie indotta da TNF agli HUVEC e sopprime ulteriormente la generazione di ROS, l'espressione di VCAM-1 e l'attivazione di NF-κB [60]. Inoltre, He et al. [61] hanno confermato che l'idrossimetilfurfurale ha il potenziale per proteggere le EC dall'ipossia. È stato anche identificato che la buccia di barbabietola contiene flavonoidi, furano e componenti antiossidanti, come 5-idrossimetilfurfurale, metil piruvato, furfurolo e 2,3-diidro-3,5- diidrossi{10}}metil-4H-Pyran-4-uno; questi componenti sono responsabili della maggiore capacità antiossidante e della soppressione delle molecole di adesione delle cellule muscolari lisce vascolari proinfiammatorie. La buccia di barbabietola è stata utilizzata come stimolante per pool di antiossidanti per estinguere lo stimolo esterno o lo stimolo patologico interno dello stress cellulare perossidativo. I nostri risultati hanno evidenziato che i componenti della barbabietola aiutano a ridurre lo stress metabolico e l'infiammazione negli HUVEC, che possono essere utili per la proliferazione delle cellule vascolari e l'angiogenesi.

Contributi dell'autore:

Concettualizzazione, LNA-H. e S.-BP; metodologia, LNA-H. e S.-BP; software, GS; convalida, LNA-H. e S.-BP; analisi formale, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi) e GS; indagine, LNA-H., S.-BP e AMA-D.; risorse, LNA-H.; cura dei dati, S.-BP e LNA-H.; scrittura: preparazione della bozza originale, LNA-H. e S.-BP; scrittura—revisione e montaggio, LNA-H., AMS, GS e AAA (Amna Abdullah Alotiby); visualizzazione, S.-BP e AAA (Ali A Alshatwi); supervisione, LNA-H. e S.-BP; amministrazione del progetto, LNA-H.; acquisizione di finanziamenti, LNA-H. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto. Finanziamento: gli autori esprimono il loro apprezzamento al Deanship of Scientific Research presso la King Saud University per aver finanziato questo lavoro attraverso il gruppo di ricerca no RG-1442-432.Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale: non applicabile.Dichiarazione di consenso informato: non applicabile.Dichiarazione di disponibilità dei dati : I dati presentati in questo studio sono disponibili su richiesta dell'autore corrispondente. Conflitti di interesse: Non vi è alcun conflitto di interessi per questo studio.

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