Una breve inalazione di sevoflurano può ridurre la formazione di cicatrici gliali dopo lesione cerebrale ipossico-ischemica nei ratti neonati Parte 2

PCR in tempo reale

L'RNA totale è stato estratto dai tessuti dell'ippocampo dei cuccioli a 12, 24 e 48 ore dopo l'intervento chirurgico utilizzando TRIzolreagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Il DNA complementare è stato sintetizzato utilizzando un kit avanzato RT-PCR Superscript II (Invitrogen).

Il danno ipossico-ischemico si riferisce a uno stato patologico causato da ischemia cerebrale, ipossia, disordine metabolico e danno alle cellule nervose dovuto a disturbi del sistema cardiovascolare e cerebrovascolare. Con il progresso sociale e i cambiamenti dello stile di vita, il danno ipossico-ischemico sta diventando sempre più comune. Questa condizione può causare molti danni alla salute umana, compreso il danneggiamento dell'intelligenza e della memoria.

Sebbene l’ipossia e l’ischemia possano causare un declino della funzione cerebrale, ciò non significa che la memoria sarà influenzata negativamente. Al contrario, possiamo migliorare la memoria e aumentare l'efficienza del cervello attraverso i metodi giusti. Ecco alcuni modi per migliorare la tua memoria:

1. Dieta sana: l'impatto della dieta sulla memoria è molto importante. Gli alimenti ricchi di proteine, vitamine e minerali possono aiutare a mantenere un sistema nervoso e una funzione cognitiva sani.

2. Fare più esercizio fisico: l'esercizio fisico può favorire la circolazione sanguigna, aumentare il flusso di ossigeno, migliorare l'immunità del corpo e ridurre il rischio di malattie. Attraverso l'esercizio, puoi migliorare la tua capacità di memoria.

3. Rafforzare la fiducia in se stessi: la fiducia è un fattore importante nella memoria di una persona. Se credi di poter completare un determinato compito, otterrai facilmente i risultati desiderati e potrai anche migliorare efficacemente la tua memoria.

Si può vedere che il danno ipossico-ischemico non è una condizione che inevitabilmente danneggerà la memoria umana. Finché padroneggiamo i metodi corretti e ci prendiamo cura del nostro cervello, possiamo abbracciare un futuro sano con un atteggiamento positivo. Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre l’ossidazione e le reazioni infiammatorie nel cervello, proteggendo così il cervello. salute del sistema nervoso. Inoltre, Cistanche deserticola può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, l’apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire lo sviluppo di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.

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Il colorante fluorescente SYBR Green I (SYBR Green PCRMaster Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e 1μL di DNA complementare trascritto inverso sono stati utilizzati per rilevare la sintesi del DNA mediante PCR in tempo reale con primer specifici HIF-1 -.

Nel sistema di amplificazione del DNA in tempo reale del gene del rotore (Corbett Research, Sydney, Australia), la PCR è stata eseguita con i seguenti cicli: denaturazione a 95 gradi per 15 minuti; 40 cicli di 95 gradi (20 secondi), ricottura a 58 gradi per 25 secondi e tirare verso il basso a 72 gradi per 35 secondi. Il monitoraggio del prodotto fluorescente è stato effettuato per un periodo prolungato a 72 gradi.

Il software di analisi genetica del rotore (Corbett Research) è stato utilizzato per standardizzare il gene housekeeping GAPDH e quantificare la relativa espressione genica. Tutte le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 1.

Colorazione di Nissl
Cervelli di ratto sono stati preparati in fette 28 giorni dopo l'intervento chirurgico come descritto sopra per l'immunoistochimica. Ciascun cervello è stato sezionato consecutivamente e tre sezioni simili del cervello sono state selezionate per la colorazione di Nissl.

Utilizzando una fotocamera per microscopio digitale Nikon C1 (Nikon Corporation, Tokyo, Giappone), sono state catturate microfotografie tipiche delle aree CA1, CA3 e DG dell'ippocampo. Il conteggio di diverse cellule in ciascuna delle tre sezioni è stato eseguito in cieco utilizzando il software ImageJ.

Test comportamentali

I ratti sono stati svezzati a 3 settimane, divisi in tre-cinque gruppi e tenuti in gabbie in base all'assegnazione del gruppo. Sono stati condotti test comportamentali sui ratti P28–P33 (ovvero 21–26 giorni dopo l'intervento chirurgico), come descritto in precedenza (Wang et al., 2019a). )ma con leggere modifiche. Per escludere l'influenza del ciclo estrale sul comportamento dei roditori, sono stati testati solo ratti maschi.

Labirinto d'acqua di Morris

Il test del labirinto acquatico di Morris è stato utilizzato per valutare le capacità di apprendimento spaziale e di memoria dei ratti P28-P33 (Wang et al., 2019a).

Il test consisteva in due fasi, inclusa la sezione di formazione e il test di ricerca spaziale. Per 5 giorni consecutivi, sono state implementate quattro sezioni di formazione ogni giorno a partire dalle 8:00am. Per i test di rilevamento della piattaforma, 10 ratti di ciascun gruppo sono stati posti individualmente nell'acqua in vari punti, stocasticamente, di fronte alla parete della piscina.

Se un ratto rilevava con successo la piattaforma entro 90 secondi, veniva costretto a rimanere sulla piattaforma per 20 secondi e il tempo impiegato per rilevare la piattaforma veniva registrato come latenza di fuga. Ogni ciclo di test è durato 90 secondi e la latenza di fuga è stata misurata come il tempo trascorso dal momento in cui il ratto è stato messo in acqua all'imbarco riuscito sulla piattaforma.

Se il ratto non riusciva a trovare la piattaforma entro 90 secondi, la registrazione veniva interrotta e venivano eseguiti l'apprendimento e la guida della memoria (lo sperimentatore utilizzava una lunga asta per guidare il ratto sulla piattaforma e gli permetteva di rimanere sulla piattaforma per 20 secondi per imparare). Durante il test, la latenza di fuga dei ratti che non riuscivano a entrare nel palco è stata registrata pari a 90 secondi.

Nel test con sonda spaziale effettuato il sesto giorno di test, la piattaforma è stata rimossa e il ratto è stato posizionato nel quadrante opposto e gli è stato permesso di nuotare per 90 secondi. La velocità del nuoto, la latenza della fuga e il numero di volte in cui hanno attraversato il luogo in cui si trovava precedentemente la piattaforma sono stati registrati dal sistema di tracciamento video (Shanghai Mobile Datum Ltd., Shanghai, Cina).

Prova di sospensione

Il test di sospensione è stato eseguito sui ratti P28-P32 per valutare la loro funzione motoria, a partire dalle 15:00 ogni giorno. Una corda di plastica orizzontale con un diametro di 0,5 cm è stata posizionata a una distanza di 45 cm dal suolo e i ratti sono stati guidati a tenere la corda di plastica con entrambi gli arti superiori, a quel punto è stato misurato il tempo trascorso fino alla caduta del ratto. latenza della sospensione. La prova terminava se: (i) il ratto cadeva; (ii) la latenza della sospensione è stata superiore a 60 secondi; oppure (iii) la corda è stata impigliata negli arti posteriori.

Prova in campo aperto

Sono stati condotti test in campo aperto su ratti P28 utilizzando un'attrezzatura esterna composta da una scatola di plexiglas (100 cm × 100 cm; Borj Sanat, Teheran, Iran) circondata da un muro alto 45- cm, con un pavimento diviso in 16 quadrati. L'area centrale era l'area 50 cm × 50 cm al centro dell'arena. Ogni ratto è stato posizionato individualmente al centro dell'arena e gli è stato permesso di esplorare senza limitazioni per 10 minuti.

È stato utilizzato un sistema di tracciamento video (Borj Sanat) per registrare e analizzare il percorso totale (come indicatore dell'attività fisica) e il tempo trascorso nell'area centrale (come indicatore del comportamento ansioso) (Zhai etal., 2019).

Colorazione del Golgi

Dopo il completamento dei test comportamentali (cioè 26 giorni dopo l'intervento chirurgico), cinque ratti sono stati selezionati casualmente da ciascun gruppo. La colorazione del Golgi è stata eseguita su sezioni cerebrali congelate di 150-μm di spessore utilizzando un FD Rapid Golgi Stain Kit (FDNeuroTechnologies, Columbia, MD, USA) secondo il protocollo del produttore.

Il software ImageJ è stato utilizzato per analizzare la densità delle spine (numero di spine per 10 μm) di ciascun neurone. Le spine sono state contate su due o tre segmenti di dendriti secondarie.

analisi statistica

SPSS 17.0 per Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) è stato utilizzato per analizzare i dati, che sono mostrati come media ± errore standard della media (SEM). Il test di Shapiro-Wilk è stato utilizzato per testare l'ipotesi di normalità tra tutte le variabili continue. Inoltre, l'analisi della varianza unidirezionale seguita dai test di confronto multiplo post hoc di Tukey è stata affrontata in una serie di esperimenti.

Se i dati non soddisfacevano il presupposto di normalità, il test Kruskal-Wallis H o il test Mann-Whitney Utest venivano completati separatamente. La latenza di fuga è stata analizzata sulla base dell'analisi bidirezionale della varianza per misurazioni iterative. I valori P < 0.05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Risultati

L'SPC migliora la perdita di cellule neuronali dell'ippocampo

L'ippocampo, comprese le tre regioni esaminate, è associato all'apprendimento e alla memoria (Jung et al., 2020). Dopo i test comportamentali, è stata eseguita la colorazione di Nissl per esaminare l'architettura dell'ippocampo.

Nel gruppo HI, la densità neuronale vitale era ridotta rispetto al gruppo sham. Tuttavia, il numero di neuroni era aumentato negli animali esposti a SPC; questo effetto è stato invertito da YC-1, che ha ridotto la densità neuronale (Figura 1A). Questo fenomeno è stato osservato nelle regioni CA1, CA3 e DG dell'ippocampo (P< 0.05; Figure 1B–D).

L'SPC migliora e riduce la densità delle spine dendritiche nell'area CA1 dell'ippocampo

La colorazione del Golgi è stata utilizzata per rilevare la densità della colonna vertebrale neuronaldendritica piramidale CA1 (Figura 2A). Poiché le dimensioni delle spine sono molto varie (ad esempio, dendriti ramificati, sottili o a forma di fungo), abbiamo determinato solo che la densità delle spine dendritiche era significativamente aumentata nel gruppo HIS rispetto al gruppo HI (P < 0.{{6 }}5), mentre la densità delle spine dendritiche è stata ridotta nel gruppo HIS + YC-1 rispetto al gruppo HIS (P < 0,01; Figura 2B).
L'SPC migliora l'espressione di PSD95 e GAP43 nell'ippocampo

Abbiamo valutato l'espressione delle proteine ​​associate alla sinapsi GAP43 e PSD95 per determinare se fossero inibite dalle cicatrici gliali. L'HI ha ridotto significativamente l'espressione delle proteine ​​PSD95 (P < 0.01) e GAP43 (P < 0,05) rispetto allo shamgroup (Figura 2C–E). Rispetto al gruppo HIS, i livelli di espressione di PSD95 e GAP43 erano notevolmente diminuiti dopo l'iniezione di YC-1.

La formazione di astrogliosi e cicatrici gliali danneggia l'architettura dell'ippocampo dopo HI

Successivamente, abbiamo cercato di verificare se il sevoflurano migliorasse l'apprendimento e la funzione della memoria proteggendo l'architettura dell'ippocampo e attenuando l'astrogliosi. Apoptosi neuronale indotta da HIE neonatale nell'ippocampo, nonché astrogliosi reattiva nella regione dell'infarto che successivamente si sviluppa in una cicatrice gliale (Rolls et al., 2009).

Nel gruppo HI, gli strati piramidali CA1 e CA3 e la regione DG hanno mostrato evidenti diminuzioni dei neuroni (P < 0.01, P < 0.001; Figure 3E e 4C), così come un aumento del numero di astrociti con cambiamenti morfologici distinti (P ​​<0,001; Figure 3C e 4B). Abbiamo valutato l'espressione di GFAP e NeuN nelle tre aree dell'ippocampo sinistro utilizzando l'immunoistochimica e l'analisi western blotting.

I nostri risultati hanno mostrato che rispetto al gruppo fittizio, gli astrociti erano attivati ​​nel gruppo HI, inseriti nello strato piramidale CA1 (Figura 4A) e CA3 (Figura 3A) e circondavano i neuroni nel DG (Figura 3B). Un'astrogliosi eccessiva ha comportato un'ulteriore estensione dei processi gliali verso le normali strutture neuronali, formando una rete di astrociti aberrante simile a una parete (Figure 3A, B e 4A).

Inoltre, l'immunoreattività GFAP (Figure 3C, D e 4B, E) e i livelli di proteine ​​erano aumentati (P ​​<0.01; Figura4E), mentre l'immunoreattività NeuN era diminuita (P < {{7} }.01 oP < 0,001; Figure 3E, F e 4C). Per verificare ulteriormente la formazione della cicatrice gliale, abbiamo valutato i livelli di espressione della neurocanproteina e l'immunoreattività nell'ippocampo (Figure 5A, B e 6A).

I risultati dell'immunofluorescenza a doppia etichettatura hanno rivelato notevoli differenze nell'intensità della fluorescenza dell'immunocolorazione neurocan+/GFAP+ tra i gruppi HI e sham (P < 0.001, P < 0,05, P < 0,01; Figure 5G, H e 6D), coerenti con i risultati del western blot (P< 0.01; Figure 6F).

L'SPC attenua l'astrogliosi e la formazione di cicatrici gliali nell'ippocampo

Successivamente, il nostro studio ha valutato se l'SPC attenuasse la scarformazione gliale. Rispetto al gruppo HI, l'immunoreattività di GFAP (Figure 5C, D e 6C) e neurocan (Figure 5E, F e 6B) nel gruppo HIS era marcatamente sottoregolata nell'ippocampo (P < 0.{{6} }1 o P < 0,001).

Al contrario, l'espressione di GFAP e neurocani nel gruppo HIS + YC-1 era notevolmente aumentata rispetto al gruppo HIS e non era diversa dai gruppi HIS + YC-1 e HI (P > 0.05; Figura 6E e F).

Inoltre, l'immunopositività NeuN era sovraregolata e le strutture apparivano più ordinate nel gruppo HIS rispetto al gruppo HI, che era invertito da YC-1 (Figure 3E, F e 4C).

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