Una breve inalazione di sevoflurano può ridurre la formazione di cicatrici gliali dopo lesione cerebrale ipossico-ischemica nei ratti neonati Parte 3

L'SPC sovraregola l'espressione HIF-1 nell'ippocampo

In uno studio precedente, abbiamo scoperto che il post-condizionamento del sevoflurano attenuava l'astrogliosi e la formazione di cicatrici gliali nell'ippocampo e migliorava l'apprendimento e il deterioramento della memoria dopo l'HI.

La cicatrizzazione gliale è una malattia legata al sistema nervoso. La malattia è spesso associata alla perdita di memoria e provoca un notevole disagio ai pazienti. Tuttavia, dovremmo renderci conto che esiste una forte relazione tra cicatrici gliali e memoria, ma ciò non significa che la memoria inevitabilmente diminuirà.

Durante il trattamento delle cicatrici gliali sono molto importanti un atteggiamento positivo e metodi di trattamento corretti. Dobbiamo sforzarci di mantenere un atteggiamento ottimista, incoraggiare i pazienti a sottoporsi a cure adeguate e fornire loro l’aiuto necessario.

Inoltre, una dieta adeguata e l’esercizio fisico sono modi importanti per aiutare a prevenire e curare le cicatrici gliali. Una dieta equilibrata e ricca può fornire nutrienti sufficienti per aiutare il corpo a recuperare. Un corretto esercizio fisico può favorire la circolazione sanguigna e il metabolismo e migliorare l'immunità del corpo.

In conclusione, sebbene le cicatrici gliali possano influenzare la memoria, un atteggiamento positivo e il giusto trattamento possono aiutarci a superare le difficoltà e mantenere un corpo sano e una mente acuta. Affrontiamo quindi le sfide con un atteggiamento positivo e andiamo avanti con coraggio. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentare i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche deserticola può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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L'HIF{{0}} è stato confermato come un fattore chiave in questo meccanismo neuroprotettivo (Yang et al., 2019). Per studiare ulteriormente la regolazione specifica indotta dal sevoflurano, abbiamo esaminato l'espressione della proteina HIF-1 nell'ippocampo 12 , 24 e 48 ore dopo l'SPC. I nostri risultati hanno rivelato cambiamenti dinamici nell'espressione di HIF-1: 12 ore dopo il trattamento, è stato osservato un aumento dell'espressione di HIF-1 nei gruppi HI e HIS rispetto al gruppo fittizio (P < 0,0001), ma non c'erano praticamente differenze tra i gruppi HI e i suoi gruppi (Figura 7A e B).

Ventiquattro ore dopo l'SPC, l'espressione di HIF1 era diminuita nel gruppo HI rispetto al gruppo HIS (P <0.001) ma era comunque aumentata rispetto al gruppo fittizio (P < 0,001; Figura 7C) .

Quarantotto ore dopo SPC, l'espressione HIF-1 nel gruppo HI è tornata a un livello molto basso e non era diversa dal gruppo fittizio; tuttavia, l'espressione di HIF-1 era ancora mantenuta a un livello molto elevato nel gruppo HIS (P < 0.01; Figura 7D). Successivamente, abbiamo esaminato l'espressione dell'mRNA di HIF-1 ( relativo a GAPDH) nell'ippocampo 12, 24 e 48 ore dopo l'analisi SPC mediante PCR in tempo reale.

I risultati hanno rivelato che l'espressione dell'mRNA di HIF{{0}} ha raggiunto il picco 24 ore dopo HI (P < 0,001; Figura7E) e non sono state riscontrate differenze evidenti tra i gruppi HI e HIS nei tre punti esaminati. Pertanto, la regolazione dinamica dell'HIF-1 indotta dal sevoflurano probabilmente ha coinvolto la regolazione post-traduzionale, che è in linea con la nostra ipotesi.

Per indagare ulteriormente la nostra ipotesi che l'SPC riduca l'astrogliosi dopo la lesione da HI nei ratti neonati sovraregolando DJ-1 per inibire l'ubiquitilazione di HIF-1, abbiamo esaminato l'espressione delle proteine ​​VHL e DJ-1 (Figura 8A).

La proteina VHL interagisce fisicamente con DJ{{0}} (Parsanejad et al., 2014), come analizzato in uno schermo imparziale di spettrometria di massa e confermato nel modello aPD. I nostri risultati hanno indicato che DJ-1 potrebbe inibire l'ubiquitilazione dipendente da VHL e stabilizzare l'espressione di HIF-1. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che l'espressione di VHL diminuiva quando l'espressione di DJ-1 veniva aumentata nel gruppo HIS rispetto al gruppo Gruppo HI (P <0,05; Figura 8B e C).

L'inibitore di HIF-1 YC-1 attenua il miglioramento dell'apprendimento e della memoria indotto dal sevoflurano

L'HIE neonatale porta a molti effetti negativi a lungo termine; una delle disfunzioni più gravi è il deterioramento dell’apprendimento e della memoria. Numerose prove hanno dimostrato che l’SPC può proteggere dai danni dell’HI e migliorare la funzione di apprendimento e memoria (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019; Yanget al., 2019).

Abbiamo iniettato YC{{0}}, un inibitore dell'HIF-1, per verificare se il meccanismo protettivo del sevoflurano è correlato all'HIF-1. Il labirinto acquatico di Morris è stato utilizzato per valutare l'apprendimento e il riconoscimento nei giorni 29-34 dopo l'intervento chirurgico (Figura 9A). C'erano differenze evidenti nella latenza di fuga tra i gruppi HI e HIS (P <{9}}.0001). Il trattamento con YC-1 ha aumentato notevolmente la latenza di fuga dopo l'esposizione al sevoflurano (P < 0,01; Figura 9B).

Nel test della sonda spaziale, il gruppo HIS ha ottenuto risultati migliori rispetto a HI (P < {{0}}.01) e HIS + YC-1 (P < 0,05; Figura 9C) gruppi.Tuttavia, il gruppo con iniezione YC-1 non ha mostrato un miglioramento marcato rispetto al gruppo HI. Oltre a questo, non è stata osservata alcuna compromissione motoria in base ai risultati dei test di velocità di nuoto o di sospensione (P > 0,05; Figura 9D ed E).

I risultati dei test in campo aperto non hanno rivelato differenze nel tempo trascorso al centro o nella distanza totale percorsa tra i gruppi (P > 0.05; Figura 9F–H), indicando che non vi era alcuna divergenza nell'attività locomotoria o nel comportamento ansioso tra i quattro gruppi.

Discussione

Il modello classico Rice-Vannucci è stato utilizzato in questo studio per valutare gli effetti dell'SPC sull'HIE nei ratti P7 (Jevtovic-Todorovicet al., 2003; Grandvuillemin et al., 2017). I nostri risultati hanno mostrato che: (1) l'SPC ha migliorato l'apprendimento a lungo termine e la memoria nell'HIE neonatale attenuando l'eccessiva astrogliosi dell'ippocampo e le cicatrici gliali; (2) il sevoflurano può indurre la neuroprotezione osservata stabilizzando l'espressione di HIF-1 attraverso l'inibizione della sua ubiquitilazione; e (3) l'inibizione dell'ubiquitinazione dell'HIF-1 da parte del sevoflurano può essere indotta tramite la sovraregolazione di DJ-1, che ha dimostrato di essere neuroprotettivo nel PD (Parsanejad et al., 2014) ed è regolato dall'SPC.

Le cicatrici gliali influenzano l'allineamento neuronale e la generazione di sinapsi nel cervello in via di sviluppo. Qui, abbiamo scoperto che il sevoflurano sovraregola la proteina protettiva del cervello DJ-1, riduce il livello di ubiquitinazione dell'HIF-1, migliora le cicatrici gliali e influenza le funzioni di apprendimento e memoria a lungo termine per esercitare la protezione del cervello. La maggior parte dei bambini nati vivi i sopravvissuti all'HIE soffrono di gravi disfunzioni neurologiche, come paralisi cerebrale, epilessia e soprattutto disturbi dell'apprendimento e della memoria a lungo termine (Edwards et al.,2010; Descloux et al., 2015).

Tuttavia, l’attuale trattamento dell’HIE si concentra principalmente sul trattamento sintomatico (Yuan,2009). Solo pochi trattamenti, come l’ipotermia moderata di tutto il corpo, possono fornire neuroprotezione e migliorare i risultati a lungo termine.

L'applicazione dell'anestetico inalatorio evoflurano dopo l'HIE neonatale fornisce neuroprotezione che può invertire il danno causato dall'HI, come verificato in studi sugli animali (Lai et al., 2016; Kim et al., 2017). Anche l’influenza degli anestetici sullo sviluppo del sistema nervoso è da molti anni un tema caldo di ricerca (Archer et al., 2017).

Gli effetti degli anestetici inalatori sul cervello dipendono dalla concentrazione. I trattamenti a bassa concentrazione e a breve termine hanno effetti protettivi sul cervello ferito, mentre i trattamenti ad alta concentrazione e a lungo termine possono danneggiare il tessuto cerebrale. Tuttavia, il meccanismo alla base della protezione dai danni cerebrali non è stato ancora chiarito.

Pertanto, abbiamo esplorato i potenziali meccanismi del sevoflurano sul miglioramento dell'apprendimento e della funzione di memoria. Gli astrociti sono componenti chiave del sistema nervoso centrale nella risposta alle lesioni, inclusa l'asfissia neonatale (Zhao e Rempe, 2010). Nella fase acuta successiva al danno da HI, queste cellule gliali si attivano e iniziano a proliferare.

La proliferazione delle cellule gliali è fondamentale per sigillare il sito della lesione, rimodellare la struttura del tessuto ippocampale e controllare temporalmente e spazialmente la risposta immunitaria locale; tuttavia, questa risposta diventa dannosa nella fase cronica (Peknyand Nilsson, 2005; Pekny et al., 2014). Infatti, questa eccessiva ipertrofia degli astrociti compromette le strutture anatomiche dell’ippocampo.

Più specificamente, i nostri risultati di immunofluorescenza hanno mostrato che gli astrociti attorno allo strato piramidale CA1 e CA3, così come nella regione DG (in particolare il confine tra lo strato di cellule granulari e l'ilo), hanno gravemente distrutto la normale struttura del tessuto. I processi delle impalcature gliali si sono sviluppati nella normale schiera di neuroni.

I risultati morfologici hanno dimostrato che queste glia radiali che esprimono un eccesso di GFAP orientano i loro processi in una fitta rete, che forma una struttura simile a un muro che ostacola lo sviluppo delle sinapsi e compromette direttamente l'apprendimento e la memoria dipendenti dallo spazio (Wanner et al., 2008). un classico test comportamentale utilizzato per rilevare l'apprendimento e la memoria correlati all'ippocampo (Wu et al., 2018), è stato combinato in questo studio con i risultati della colorazione con immunofluorescenza per fornire nuove prove che il sevoflurano potrebbe migliorare l'apprendimento e la memoria riducendo l'astrogliosi eccessiva e le cicatrici gliali.

Non solo l'intensità dell'immunofluorescenza degli astrociti ipertrofici neurocan e GFAPin è diminuita dopo l'SPC, ma sono diminuiti anche i livelli di espressione proteica. Nel frattempo, la colorazione di Nissl ha rivelato un'architettura dell'ippocampo più densa e regolare, un citoplasma ipercromatico, una perdita neuronale molto ridotta e una marcata atrofia cellulare dopo SPC.

La colorazione del Golgi ha inoltre fornito la prova che l'SPC potrebbe aumentare il numero di spine dendritiche. Un'altra nuova scoperta di questo studio è che l'SPC ha sovraregolato l'espressione dei marcatori sinaptici PSD95 e GAP43 nell'ippocampo rispetto al gruppo HI.

Questo fenomeno indica che oltre ad attenuare le cicatrici gliali, il sevoflurano può facilitare la formazione di sinapsi ippocampali, che migliora direttamente le funzioni di apprendimento e memoria (Zhanget al., 2015; Lu et al., 2017).

L'SPC ha attenuato le cicatrici gliali e l'eccessiva proliferazione degli astrociti nell'HIE neonatale durante lo sviluppo. I numeri di dendritespina possono essere elevati dopo SPC, fornendo così la prova che il sevoflurano può indurre la formazione di sinapsi dopo HI (Roberts et al., 2010). L'applicazione di YC-1, un inibitore di HIF1, ha invertito l'effetto terapeutico indotto dall'SPC, indicando che la protezione della formazione di sinapsi è altamente correlata all'HIF-1.

Essendo un fattore di trascrizione cruciale, l'HIF-1 ha vari geni bersaglio che svolgono funzioni distinte, come i processi coinvolti nella sopravvivenza cellulare, nel trasporto e nel metabolismo del glucosio e nell'angiogenesi, dopo l'ischemia (Ostrowski e Zhang, 2020). Inoltre, l'HIF{{ 2}} l'espressione è strettamente regolata da vari meccanismi. Studi precedenti hanno dimostrato che l'HIF-1 non può esistere costantemente nel tessuto cerebrale a un livello elevato ed efficace a causa del percorso di degradazione dell'ubiquitilazione dipendente dall'ossigeno (Hirayama e Koizumi, 2017).

Pertanto, trovare un modo per mantenere i livelli di espressione dell'HIF può estendere i suoi effetti protettivi dopo l'HI. Recentemente è stata proposta una nuova modalità di trattamento, in cui viene applicato un lieve postcondizionamento ipossico dopo un periodo di lesione da HI per alleviare il danno cerebrale (Zhan et al., 2012). .È stato verificato che il postcondizionamento ipossico riduce l'attivazione gliale, inclusi sia gli astrociti che la microglia.

Inoltre, sono state osservate diminuzioni dei marcatori infiammatori dopo il postcondizionamento ipossico (Teo et al., 2015). È stato dimostrato che il potenziale meccanismo alla base di questa protezione è strettamente correlato al mantenimento dell'espressione di HIF-1 (Zhu et al., 2014). Al momento, il post-condizionamento dell'ipossia è quasi impossibile da applicare nella pratica clinica come trattamento dannoso convenzionale e presenta molti pericoli potenziali. Inoltre, le differenze individuali nella tolleranza all’ipossia rendono difficile standardizzare il controllo della dose del trattamento post-condizionamento dell’ipossia (Zhan et al., 2012).

Nell'HIE neonatale, è estremamente probabile che un post-condizionamento impreciso del trattamento dell'ipossia causi lesioni secondarie. Al contrario, il sevoflurano è più sicuro, più delicato e più controllabile nella pratica clinica e, come dimostrato nella nostra ricerca, può anche sovraregolare l'espressione di HIF-1.

Similmente al suo ruolo neuroprotettivo nel PD, nella nostra ricerca DJ-1 sembra svolgere un ruolo essenziale nell'SPC. Il substrato meglio definito del VHL, un complesso di ubiquitina ligasi E3 ampiamente noto, è HIF-1 (Zhang et al., 2018). È stato verificato che DJ-1 interagisce con VHL e può effettivamente ridurre l'espressione di VHL, il che induce la stabilizzazione dell'HIF-1 (Parsanejad et al., 2014).

Abbiamo ipotizzato che il sevoflurano protegga il cervello dal danno ipossico aumentando la regolazione del DJ-1 e inibendo l'attività di ubiquitinazione del VHL. I nostri nuovi risultati ottenuti dalla PCR in tempo reale e dall'analisi Western Blot supportano questa ipotesi. Innanzitutto, la differenza nell'HIF-1 tra SPC e gruppi HI non è il risultato di alterazioni trascrizionali.

In secondo luogo, l'espressione VHL è diminuita mentre l'espressione DJ-1 è aumentata nel gruppo SPC. In terzo luogo, la stabilizzazione dell'HIF-1 ha protetto la formazione delle sinapsi, la funzione di apprendimento e di memoria, la reversedastrogliosi e le cicatrici gliali. Pertanto, molto probabilmente il sevoflurano regola l'HIF-1 attraverso l'inibizione dell'ubiquitinazione da parte di VHL tramite un'interazione DJ-1. Uno studio precedente ha dimostrato che l'HIF-1 svolge un ruolo essenziale nella regolazione delle cellule progenitrici staminali neurali e nella promozione delle risposte all’ipossia (Cunningham et al., 2012).

L'HIF-1 è un regolatore intrinseco della multipotenza delle cellule progenitrici staminali neurali e dei risultati dello sviluppo in seguito alla differenziazione. Ulteriori indagini hanno dimostrato che l'HIF-1 ha promosso la differenziazione delle cellule staminali neurali in neuroni e ha inibito la loro differenziazione in cellule gliali attraverso la regolazione delle vie di segnalazione Notch e Wnt nella zona subventricolare (Lie et al.,2005; Morris et al., 2007; Kuwabara et al., 2009; Mazumdaret al., 2010).

Nell'ippocampo di ratto neonatale, l'HIF-1 può anche fornire neuroprotezione modulando i risultati della differenziazione delle cellule progenitrici neurali per attenuare l'astrogliosi eccessiva. Tuttavia, il meccanismo specifico deve ancora essere chiarito e richiede ulteriori ricerche. Lo studio attuale presentava diverse limitazioni. Innanzitutto, non sono stati osservati né registrati cambiamenti dinamici nell’attivazione degli astrociti.

In secondo luogo, non è stato studiato il meccanismo definitivo mediante il quale HIF1 riduce l’astrogliosi. In terzo luogo, sebbene sia stato osservato che l’attivazione degli astrociti e della microglia avviene simultaneamente, il nostro studio si è concentrato sugli astrociti anziché sull’attivazione della microglia o sulla successiva reazione infiammatoria, che sarebbe estremamente utile da indagare.

In secondo luogo, le prestazioni dei test comportamentali delle ratte femmine erano leggermente migliori di quelle dei ratti maschi, e anche l'aumento delle cellule gliali delle ratte femmine era leggermente inferiore a quello dei ratti male.

Tuttavia, i risultati dei test comportamentali dei due sessi non hanno mostrato differenze statistiche dopo il post-condizionamento con sevoflurano. Il meccanismo specifico alla base degli effetti specifici del sesso sullo sviluppo dopo HI sarà studiato nella nostra ricerca futura. Inoltre, metodi genetici come l'eliminazione del gene che codifica DJ-1 sarebbero utili per dimostrare se gli effetti neuroprotettivi del trattamento SPC derivano dall'inibizione dell'ubiquitilazione di HIF-1.

Indipendentemente da ciò, i nostri risultati indicano che il sevoflurano allevia l'astrogliosi e la formazione di cicatrici gliali nell'ippocampo del ratto e riduce il deterioramento dell'apprendimento e della memoria dopo un infortunio da HI stabilizzando l'espressione di HIF-1. Questo meccanismo potrebbe essere correlato alla sovraregolazione indotta dal sevoflurano della proteina neuroprotettiva DJ-1, riducendo così la VHL, l'ubiquitinligasi dell'HIF-1. Questi risultati forniscono nuovi bersagli per il trattamento dell’encefalopatia ipossica ischemica neonatale.

Contributi dell'autore: Concezione e progettazione dello studio: PZ e QSG; implementazione sperimentale: QSG, YHZ e ZYW; analisi dei dati: QSG; fornitura di reagenti/materiali/strumenti di analisi: HX, CL; scrittura su carta:QSG; perizia statistica, ottenimento di finanziamenti, supporto amministrativo, tecnico o materiale e supervisione: PZ. Tutti gli autori hanno approvato la versione finale dell'articolo.

Conflitti di interessi: gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi. Sostegno finanziario: questo studio è stato sostenuto dalla National NatureScience Foundation of China, n. 81671311, 81870838; il Programma chiave di ricerca e sviluppo della provincia cinese di Liaoning, n. 2018225004; e l'eccezionale fondo scientifico dell'ospedale cinese di Shengjing, n. 201708 (tutti a PZ). Le fonti di finanziamento non hanno avuto alcun ruolo nella concezione e progettazione dello studio, nell'analisi o interpretazione dei dati, nella stesura dell'articolo o nella decisione di sottoporre questo articolo per la pubblicazione.

Contratto di licenza sul copyright: il contratto di licenza sul copyright è stato firmato da tutti gli autori prima della pubblicazione. Dichiarazione di condivisione dei dati: i set di dati analizzati durante lo studio attuale sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta ragionevole. Controllo del plagio: controllato due volte da iThenticate. Revisione tra pari: peer-reviewed esternamente .

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