CaWRKY30 regola positivamente l'immunità al peperoncino prendendo di mira CaWRKY40 contro l'inoculazione di Ralstonia Solanacearum attraverso la modulazione dei geni correlati alla difesa Parte 1

Astratto:

La rete dei fattori di trascrizione WRKY (TF) è composta dal sottoinsieme dei TF WRKY, che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dell'immunità delle piante. Tuttavia, le funzioni della rete delle TF WRKY rimangono poco chiare, in particolare in piante non modello come il peperone (Capsicum annum L.). Questo studio ha caratterizzato funzionalmente CaWRKY30, un membro della proteina WRKY del pepe del gruppo III, per l'immunità del pepe contro l'infezione da Ralstonia solanacearum. Il CaWRKY30 è stato rilevato nel nucleo e i suoi livelli di espressione trascrizionale sono stati significativamente sovraregolati dall'inoculazione di R. solanacearum (RSI), dall'etilene per applicazione fogliare (ET), dall'acido abscissico (ABA) e dall'acido salicilico (SA). Il silenziamento genico indotto da virus (VIGS) di CaWRKY30 ha amplificato la vulnerabilità del peperone all'RSI.

Inoltre, il silenziamento di CaWRKY30 da parte di VIGS ha compromesso la morte cellulare simile a HR innescata da RSI e geni marcatori associati alla difesa sottoregolati, come CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, CaHIR1 e CaWRKY40. Al contrario, la sovraespressione transitoria di CaWRKY30 nelle foglie di peperone ha istigato la morte cellulare simile alle risorse umane e geni marcatori correlati alla difesa sovraregolati. Inoltre, la sovraespressione transitoria di CaWRKY30 ha sovraregolato i livelli trascrizionali di CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 e CaWRKY40.

D'altra parte, la sovraespressione transitoria di CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 e CaWRKY40 ha sovraregolato i livelli di espressione trascrizionale di CaWRKY30. I risultati suggeriscono che CaWRKY30 recentemente caratterizzato regola positivamente l'immunità del peperone contro l'attacco di Ralstonia, che è governato dalla segnalazione sinergicamente mediata da fitormoni come ET, ABA e SA, e dall'assimilazione trascrizionale nelle reti WRKY TFs, costituite da CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 e CaWRKY40 . Collettivamente, i nostri dati faciliteranno la spiegazione del meccanismo alla base del crosstalk tra l'immunità del peperone e la risposta all'RSI.

I fattori di trascrizione svolgono un ruolo chiave nel sistema immunitario, controllando la regolazione dell'espressione genica e la formazione di tipi cellulari specifici. Quanto segue è la relazione tra fattori di trascrizione e immunità:

1. Fattore di trascrizione - NF-κB: NF-κB è un fattore di trascrizione chiave coinvolto nella regolazione delle risposte immunitarie adattative delle cellule T e B. L'attivazione di NF-κB può promuovere la risposta infiammatoria, la risposta immunitaria e l'apoptosi cellulare.

2. Fattori di trascrizione—STAT: gli STAT sono fattori di trascrizione che mediano la segnalazione del vettore e le risposte cellulari. Le STAT possono essere attivate, svolgere un ruolo chiave nelle cellule T e B attivate e partecipare a processi come la proliferazione, la differenziazione e l'attivazione delle cellule immunitarie.

3. Fattore di trascrizione - AP-1: AP-1 è una famiglia di fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione di varie funzioni cellulari e risposte immunitarie. L'attivazione di AP-1 può promuovere processi come la proliferazione cellulare, la differenziazione e la trasformazione, oltre a mantenere risposte antivirali e immunitarie.

4. Fattori di trascrizione—CEBP: i CEBP sono una vasta famiglia di fattori di trascrizione, tra cui CEBP , , , ecc. in varie cellule tissutali. Nel sistema immunitario, la CEBP è coinvolta nell'attivazione dei macrofagi e nel rilascio di citochine, nonché nella differenziazione e nell'attivazione delle cellule B e delle cellule T.

Presi insieme, i fattori di trascrizione svolgono un ruolo importante nell'immunità, partecipando alla regolazione e al mantenimento dell'attività del sistema immunitario in diversi tipi e funzioni cellulari. Pertanto, dobbiamo anche prestare attenzione al miglioramento dell'immunità nella nostra vita quotidiana. La cistanche può migliorare l'immunità e i polisaccaridi nella carne possono regolare la risposta immunitaria del sistema immunitario umano, migliorare la capacità di stress delle cellule immunitarie e migliorare l'effetto di sterilizzazione delle cellule immunitarie.

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Parole chiave:

peperoncino (Capsicum annuum); Ralstonia solanacearum; CaWRKY30; WRKY TF.

1. Introduzione

Le piante sono spesso esposte a vari stress biotici e abiotici durante la loro vita a causa della loro natura immobile [1,2]. Le piante hanno sviluppato diversi meccanismi di difesa in risposta alla ripetuta pressione selettiva da parte dei principali vincoli ecologici e ambientali. Diversi fattori trascrizionali (TF) si interconnettono per sviluppare sofisticate reti trascrizionali per regolare questi classici meccanismi di difesa a livello trascrizionale [3,4]. Le reazioni di difesa a vari stress sono adeguatamente sincronizzate e controllate in quanto sono fondamentali per le piante sotto forma di dispendio energetico e sviluppo [5]. I meccanismi di difesa potrebbero variare nelle diverse specie vegetali a causa delle diverse circostanze ambientali che influenzano il loro acclimatazione [6-8].

Quindi, il sistema di difesa impiegato dalle piante modello non può essere pienamente implicito nelle piante non modello. Pertanto, i sistemi di difesa delle piante sono stati un obiettivo primario negli ultimi decenni; tuttavia, questi studi si sono concentrati principalmente su piante modello, ad esempio Arabidopsis thaliana e riso (Oryza sativa L.). Tuttavia, la sincronizzazione funzionale di questi complessi trascrizionali per regolare la risposta delle piante a vari stress è stata scarsamente studiata, principalmente in piante non modello.

Le proteine ​​WRKY comprendono la più grande famiglia di TF nelle piante. I TF WRKY contengono uno o due domini WRKY e comunemente una sequenza WRKYGQK all'N-terminale seguita dal motivo a dito di zinco C2HC o C2H2 [4,9,10]. Le proteine ​​WRKY sono filogeneticamente divise in tre gruppi principali (cioè gruppi I-III) basati su diversi domini WRKY e sulla struttura del motivo a dito di zinco.

Il gruppo II di TF WRKY è nuovamente suddiviso in cinque sottogruppi (IIa, IIb, IIc, IId e IIe) [11-13]. I membri WRKY si legano principalmente con le W-box [TTGAC(C/T)] che si trovano nelle regioni del promotore di vari geni bersaglio inserendo un cuneo esclusivo verticalmente nel solco maggiore del DNA [14] mediante il motivo WRKY GQK sul secondo filamento b, che stimola modulazione trascrizionale dell'espressione di geni bersaglio [14-16]. I WRKY sono stati coinvolti in diversi sistemi biologici nelle piante, tra cui la dormienza dei semi, la germinazione dei semi, la senescenza e lo sviluppo dei semi. Allo stesso modo, questi sono anche coinvolti nella risposta a stress biotici e abiotici e nella commutazione della trascrizione dei loro geni bersaglio [17-20].

È stato riportato che un gruppo di TF WRKY o un TF WRKY indotto trascrizionalmente da un solo stress modula diversi stress. Le W-box sono arricchite all'interno delle regioni del promotore [21-24]. Questi studi descrivono la presenza di reti WRKY implicate in risposta a un particolare stress, o una combinazione di due o più. Il ruolo delle proteine ​​WRKY e dei meccanismi sottostanti in risposta a stress biotici e abiotici è stato spesso studiato negli ultimi dieci anni; tuttavia, l'enfasi di questi studi era principalmente su un gene in risposta a uno stress nelle piante modello, ad esempio, A. thaliana e O. sativa. Recentemente, è stata suggerita un'importante varianza funzionale tra stretti omologhi di WRKY TF di varie specie vegetali [24,25]. Le funzioni di WRKYs e WRKY web in piante non modello come Capsicum annuum L., in risposta a stress singoli o combinati, sono state poco studiate fino ad ora.

Il pepe è conosciuto in tutto il mondo per la sua importanza economica. Viene seminato in montagna durante le stagioni temperate [26,27]. Il peperone è esposto a varie malattie trasmesse dal suolo come la peronospora e l'appassimento batterico causate da agenti patogeni batterici, ad esempio Phytophthora capsicum e Ralstonia solanacearum, rispettivamente [28,29]. La coincidenza di questi agenti patogeni conferisce impatti devastanti sulla produzione di peperoni ad alte temperature e alta umidità (HTHH). L'HTHH compromette l'immunità del peperone mediata dalla proteina R e accelera la crescita e lo sviluppo del patogeno. Inoltre, l'attacco del patogeno e l'HTHH esercitano simultaneamente una pressione di selezione naturale sul peperone, che ha influenzato l'evoluzione del peperone in passato [30-32]. Al contrario, il verificarsi simultaneo di infezione da patogeni e HTHH potrebbe non influenzare l'evoluzione delle piante modello, come A. thaliana e O. sativa. Quindi, il pepe sembra più appropriato per la ricerca sull'immunità contro gli stress biotici o abiotici, cioè RSI o HTHH.

Ralstonia solanacearum provoca avvizzimento batterico in numerose colture, ad esempio peperone, pomodoro, patata, ecc. È un batterio gram-negativo presente nel terreno [33]. Forma colonie rapide nei tessuti xilematici, che portano alla malattia da avvizzimento batterico nelle piante infestate [34].

È noto che le risposte delle specie vegetali allo stress biotico e abiotico sono regolate dai fitormoni [35]. I fitormoni sono minuscole molecole coinvolte nella regolazione della crescita delle piante, nella riproduzione delle piante e nella sopravvivenza. L'acido salicilico (SA) e l'acido jasmonico (JA) sono fondamentali per le risposte immunitarie delle specie vegetali. Questi due sono considerati fondamenti critici delle risposte immunitarie delle piante contro i patogeni. La biosintesi e la segnalazione di SA sono vitali per la difesa contro i patogeni biotrofici, mentre JA fornisce una difesa contro i patogeni necrotrofici [36,37]. L'etilene (ET) aiuta nelle risposte di difesa contro diverse interazioni pianta-patogeno [37].

Varie cultivar di peperone autoctone delle aree subtropicali dimostrano una resistenza alle malattie accelerata, anche sotto HTHH [38]. L'elemento cis HSE correlato al calore generalmente coesiste con i fitormoni, inclusi SA, JA, ET, ABA o elementi cis correlati ai patogeni nelle regioni promotrici della maggior parte delle MAPK e CDPK coinvolte nell'immunità delle piante [39-41]. Raccomanda la presenza di diafonia tra immunità e HTHH. Il genoma del pepe è 27 e 7,5 volte più grande rispetto a A. thaliana e O. sativa, rispettivamente. Tuttavia, ha solo 73 geni WRKY, mentre i genomi più piccoli di A. thaliana e O. sativa hanno rispettivamente 72 e 122 geni WRKY [9,42,43]. Abbiamo precedentemente rilevato che CaWRKY6 [44], CaWRKY22 [9], CaWRKY40 [45] e CaWRKY58 [46] sono stati coinvolti nella risposta di pepper contro la RSI.

Tra questi, CaWRKY6, -22, -27 e -40 agiscono come regolatori positivi dell'immunità delle piante, mentre CaWRKY58 è un regolatore negativo. Questi geni possiedono un sottoinsieme di elementi HSE e W-box nella loro regione del promotore e i promotori di altri TF WRKY, deducendo il ruolo delle reti WRKY nella regolazione della risposta del pepe contro RSI. Inoltre, CaWRKY40 è stato regolato direttamente da CaWRKY6 [44] e CabZIP63 [16], mentre CaWRKY40 è stato regolato indirettamente da CaCDPK15 [47]. Al contrario, la maggior parte dei TF WRKY del peperone non è stata ancora caratterizzata per la loro risposta agli attacchi dei patogeni.

Nel presente studio, è stato isolato un cDNA a lunghezza intera per la famiglia di peperoni WRKY TFs e denominato CaWRKY30. Lo abbiamo caratterizzato espressivamente e funzionalmente e abbiamo scoperto che CaWRKY30 è stato indotto dall'RSI e dall'applicazione fogliare di SA, JA, ET e ABA. La sovraespressione transitoria di CaWRKY30 nelle foglie di pepe ha innescato la morte cellulare simile alle risorse umane e la produzione di H2O2. Il silenziamento di CaWRKY30 nel peperone ha compromesso l'immunità del peperone all'RSI. Questi risultati suggeriscono che CaWRKY30 regola positivamente l'immunità del peperone all'RSI.

2. Risultati

2.1. Clonazione e analisi di sequenza di CaWRKY30

Un nuovo gene WRKY CaWRKY30 (CA01g34480) è stato identificato dall'analisi dell'intero genoma. Il gene CaWRKY30 è stato scelto per la caratterizzazione funzionale poiché l'esistenza di elementi cis correlati all'immunità come TGA (fattore di legame del motivo TGACG), motivo TGACG, TATC-box, TATAbox e W-box nella regione del promotore designano il suo possibile ruolo nell'immunità del peperone (Figura S1). Un frammento di cDNA di CaWRKY30 (CA01g34480) di 924 bp open-reading-frame (ORF) è stato clonato utilizzando primer gene-specifici (Tabella S1). La lunghezza della sequenza amminoacidica dedotta di CaWRKY30 era di 307 residui amminoacidici, possedeva un dominio WRKY conservato ed era classificata nel gruppo III (Figura 1). La proteina prevista ha una dimensione e un pI teorico di 34,55 kDa e 7,32, rispettivamente. Il CaWRKY30 condivide l'88, 60, 68 e il 57% di identità di amminoacidi con NsWRKY53, CcWRKY53, NaWRKY53 e StWRKY53, rispettivamente (Figura S2).

2.2. Espressione trascrizionale di CaWRKY30 sotto RSI e trattamento con vari fitormoni

La presenza di elementi cis associati all'immunità nella regione del promotore di CaWRKY30 indicava il suo ruolo potenziale nell'RSI dell'immunità del peperone. Per verificare la nozione, è stata eseguita l'analisi qRT-PCR per valutare i livelli trascrizionali di CaWRY30 su RSI. I livelli trascrizionali di CaWRKY30 sono stati aumentati nelle foglie trattate con Ralstonia rispetto alle foglie trattate in modo fittizio (Figura 2A). I livelli di espressione trascrizionale potenziati di CaWRKY30 erano coerenti tra 0 e 48 ore dopo il trattamento (HPT). I più alti livelli di espressione trascrizionale sono stati registrati a 48 hpt (Figura 2A).

I fitormoni, comprese le vie di segnalazione mediate da ET, ABA, SA e JA, sono regolatori chiave delle reazioni delle piante agli stress biotici e abiotici. La regolazione di CaWRKY30 mediante vie di segnalazione mediate da fitormoni è stata studiata mediante applicazione fogliare di ET, ABA, SA e JA utilizzando l'analisi qRT-PCR. I risultati hanno indicato che i livelli di espressione trascrizionale relativa di CaWRKY30 sono stati migliorati da 0 h a 48 hpt con 100 µM ET rispetto al mock. Questi livelli trascrizionali erano più alti a 48 hpt con ET (Figura 2B). L'applicazione fogliare di 100 µM di ABA ha aumentato significativamente i livelli trascrizionali di CaWRKY30 rispetto al mock. I livelli trascrizionali hanno raggiunto il livello più alto a 12 hpt con ABA (Figura 2C). I risultati hanno indicato che l'accumulo trascrizionale di CaWRKY30 era significativamente aumentato dopo l'applicazione di 1 mM SA, rispetto al mock. Questi livelli di espressione trascrizionale potenziati erano più alti a 24 hpt (Figura 2D).

Figura 2. Il saggio qRT-PCR dei livelli di espressione trascrizionale relativa di CaWRKY30 nelle foglie di peperone sottoposte a inoculazione di Ralstonia solanacearum (RSI) e applicazione fogliare di vari fitormoni. L'analisi qRT-PCR è stata utilizzata per controllare i livelli trascrizionali di CaWRKY30 nelle foglie di peperone sottoposte a vari trattamenti tra cui RSI (A), applicazione di 100 µm ET (B), applicazione di 100 µm ABA (C) e applicazione di 1 mM SA (D) a diversi intervalli di tempo. L'abbondanza trascrizionale nelle foglie trattate con RSI è stata confrontata con le foglie di controllo trattate con MgCl 2 - (mock), il cui livello di espressione relativo è stato impostato su "1". (B-D) I livelli di espressione trascrizionale nelle foglie trattate con fito-ormoni sono stati confrontati con le foglie trattate con ddH2O (finto), il cui livello di espressione è stato impostato su "1". L'altezza della barra indica le medie e le barre di errore indicano l'errore standard delle medie. Lettere diverse sopra le barre mostrano una differenza significativa tra i mezzi basati sul test LSD protetto di Fisher.

2.3. CaWRKY30 è stato trovato per essere localizzato nel nucleo

L'analisi della sequenza utilizzando WoLFPSORT ha dimostrato che la sequenza proteica CaWRKY30 prevista possiede un segnale di localizzazione nucleare putativo (Figura 1), che mostra il suo potenziale targeting nel nucleo. Per convalidare questa percezione, è stato generato un costrutto di fusione GFP aCaWRKY30 guidato da un promotore costitutivo di CaMV35S. Successivamente, questo vettore costituito è stato trasferito nel ceppo di Agrobacterium GV3101. Abbiamo sovraespresso transitoriamente il costrutto CaWRKY30 GFP nelle foglie di Nicofiamabenthamiana mediante iniezione di A. tumefacient, e i segnali GFP sono stati esaminati dal microscopio confocale fluores.science. I risultati hanno dimostrato che i segnali GFP di CaWRKY30-GFP erano presenti nei nuclei, mentre la GFP di controllo è stata rilevata in varie porzioni subcellulari, come citoplasma e nuclei (Figura 3).

Figura 3. Localizzazione subcellulare di CaWRKY30. Il CaWRKY30 si è completamente localizzato nel nucleo delle foglie di nicotiana benthaminna. Il colore verde dimostra GFP Il colore blu dimostra la colorazione DAPI del nucleo. Il colore ciano dimostra la fusione di CFP verde e nuclei colorati con DAPI blu. CPP signaGreen) per il controllo, le foglie di N. benthamiana sono state rilevate in tutta la cellula. le immagini sono state catturate mediante microscopia confocale a 48 ore dopo l'inoculazione. Misure=25 ehm.

2.4. Il silenziamento di CaWRKY30 da parte del VIGS ha ridotto l'immunità di Pepper all'RSI e i geni marcatori associati all'immunità sottoregolata.

Il CaWRKY30 è stato messo a tacere dal silenziamento genico indotto da virus (VIGS) per studiarne il ruolo nell'immunità del peperone. Sono stati acquisiti un totale di 50 impianti CaWRKY30-non silenziati (TRV:00) e 50 CaWRKY30- silenziati (TRV: CaWRKY30). Sei piante silenziate CaWRKY30 sono state selezionate casualmente per verificare la loro efficienza di silenziamento genico mediante inoculazione radicale con cellule di ceppo virulento R. solanacearum compatibile. I nostri risultati hanno indicato che i livelli trascrizionali di CaWRKY30 erano diminuiti del 30% circa nelle piante silenziate CaWRKY30 trattate con Ralstonia rispetto alle piante non silenziate, convalidando il silenziamento di CaWRKY30 (Figura 4A).

Le piante silenziate CaWRKY30 hanno mostrato una suscettibilità significativamente maggiore all'RSI rispetto alle piante non silenziate. La suscettibilità del pepe all'agente patogeno è stata aumentata mostrando un aumento della crescita della popolazione di Ralstonia, contrassegnato da valori di cfu più elevati nelle piante di pepe silenziate CaWRKY30 rispetto alle piante non silenziate a 3 d e 5 giorni dopo l'inoculazione (dpi) (Figura 4B). Il test di colorazione istochimica è stato eseguito per rilevare la produzione di H2O2 e la necrosi cellulare nelle foglie di pepe inoculate con Ralstonia CaWRKY30 silenziate (TRV: CaWRKY30) e non silenziate (TRV: 00). Una colorazione DAB scura (un segno della produzione di H2O2) e una morte cellulare simile all'HR indicata da una colorazione blu tripan scuro sono state notate in foglie di pepe non silenziate a 48 hpi (ore dopo l'inoculazione). Al contrario, le concentrazioni di tripan blu e colorazione DAB sono state significativamente ridotte nelle foglie di pepe silenziate CaWRKY30 (Figura 4C). La conduttività elettrica, un indicatore della perdita di ioni, è stata calcolata per studiare il danno alla membrana plasmatica e la morte cellulare dopo RSI.

I risultati hanno mostrato che le piante non silenziate trattate con RSI hanno mostrato una maggiore perdita di ioni rispetto alle piante silenziate CaWRKY30 trattate con Ralstonia a 24 e 48 dpi (Figura 4D). L'indice di malattia relativo è stato stimato fino a 10 dpi per dedurre il livello di malattia nelle piante CaWRKY30- silenziate e non silenziate dopo RSI (Tabella Supplementare S2). Sintomi di malattia prominenti sono stati notati nelle piante silenziate CaWRKY30 a 10 dpi, mentre le piante non silenziate esprimevano piccoli sintomi di malattia (Figura 4E). Sei piante CaWRKY30- silenziate e non silenziate sono state scelte a caso e infiltrate con R. solanacearum nelle radici per l'analisi del fenotipo. Nel pepe silenziato CaWRKY30 a 10 dpi sono stati notati evidenti sintomi di malattia da avvizzimento, mentre le piante non silenziate hanno espresso sintomi di avvizzimento molto deboli (Figura 4F). L'analisi qRT-PCR è stata condotta per studiare l'accumulo trascrizionale di geni marcatori correlati all'immunità e i risultati hanno espresso che i livelli di espressione trascrizionale di geni marcatori associati all'immunità come CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 e CaHIR1 erano ridotti in CaWRKY{{ 25}} piante silenziate rispetto a piante non silenziate a 48 dpi (Figura 4G).

Figura 4. Il silenziamento di CaWRKY30 da parte del VIGS ha ridotto la resistenza del peperone all'RSI e ha sovraregolato i geni marcatori associati all'immunità. Il dosaggio qRT-PCR dei livelli espressivi di CaWRKY30 in R. solanacearum inoculato, finto (inoculato con soluzione di MgCl2) CaWRKY 30- piante di peperoncino silenziate (TRV: CaWRKY30) e piante di controllo (TRV: 00) (UN). La differenza nella crescita di R. solanacearum tra piante di pepe CaWRKY30- silenziate e non silenziate (controllo) inoculate con R. solanacearum a 3 e 5 dpi (B). Colorazione istochimica (colorazione DAB e trypan blue) in foglie di pepe CaWRKY30-silenziate (TRV: CaWRKY30) e non silenziate (TRV:00) inoculate con R. solanacearum a 48 dpi. Barra della scala=50 µm (C). Misurazione della perdita di elettroliti come conducibilità ionica per valutare le risposte di morte cellulare nei dischi fogliari di piante di pepe CaWRKY30-silenziate (TRV: CaWRKY22) e non silenziate (TRV:00) a 24 e 48 hpi con e senza R. solanacearum (D). Il silenziamento di CaWRKY30- da parte di VIGS ha migliorato la suscettibilità delle piante di peperone all'infezione da R. solanacearum.

L'indice di malattia è aumentato significativamente con il tempo. Le piante CaWRKY30- silenziate (TRV: CaWRKY30) hanno espresso nel tempo un'elevata suscettibilità all'infezione da R. solanacearum rispetto alle piante non silenziate (TRV:00). Le medie si basano su quattro repliche biologiche con cinque piante per replica (E). L'effetto fenotipico del trattamento con R. solanacearum su piante di pepe CaWRKY30- silenziate (TRV: CaWRKY30) e non silenziate (TRV:00) a 10 dpi (F). Saggio qRT-PCR dei livelli trascrizionali dei geni marcatori associati alla difesa nelle piante di pepe CaWRKY30-silenziate (TRV: CaWRKY30) e non silenziate (TRV:00) a 48 h post-inoculazione con R. solanacearum (G). Il livello di espressione trascrizionale relativo delle piante non silenziate trattate in modo fittizio è stato impostato su "1". L'altezza della barra indica le medie e le barre di errore indicano l'errore standard delle medie. I dati rappresentano i mezzi ± SE da quattro repliche biologiche. Lettere diverse sopra le barre mostrano differenze significative tra le medie.

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