Capitolo 2: I composti che prendono di mira l'OSBPL7 aumentano l'efflusso di colesterolo dipendente dall'ABCA1- preservando la funzione renale in due modelli di malattia renale

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Discussione

Il presente studio descrive l'identificazione di una classe di composti mediante la scoperta di farmaci fenotipici (PDD) che sovraregolano l'efflusso di colesterolo dipendente da ABCA1-. La deconvoluzione del bersaglio ha rivelato che OSBPL7 è il bersaglio molecolare. In modelli animali di malattia renale, questi composti hanno ridotto l'accumulo renale di lipidi, prevenuto la perdita di podociti, normalizzato la proteinuria e ridotto il declino della funzione renale.

Terapie attuali per cronicomalattie renalisono limitati agli ACEi, agli ARB e, più recentemente, agli inibitori del cotrasportatore di sodio-glucosio di tipo 2 (SLGT2i). Nonostante l'efficacia di questi agenti nel ritardare la progressione della malattia renale cronica, principalmente nei pazienti con malattia renale proteinurica, il bisogno medico insoddisfatto nell'insufficienza renale cronica rimane immenso3,3940. In uno studio randomizzato su 4300 pazienti, SGLT2i si è rivelato inaspettatamente efficace indipendentemente della presenza di diabete4, suggerendo che sono coinvolti meccanismi di renoprotezione diversi dall'abbassamento del glucosio. Infatti, uno studio recente ha dimostrato che SGLT2i può aumentare le HDL plasmatiche e può ridurre l'accumulo di grasso cardiaco42. Questa recente comparsa di SGLT2i sottolinea il vantaggio di prendere di mira più meccanismi di guida della CKD per sviluppare terapie più efficaci.

Noi, e altri, abbiamo descritto l'accumulo di colesterolo glomerulare inmalattie renaliderivanti da origini sia metaboliche che non metaboliche. L'accumulo di lipidi glomerulari, in associazione con la diminuzione dell'efflusso di colesterolo mediato da ABCAl, si verifica in DKD7-11, FSGS12-14 e AS13. Questi dati suggeriscono che il ripristino della funzione ABCAl può essere efficace nel trattamento di questi tipi di malattie renali. Abbiamo recentemente dimostrato che la deplezione renale di colesterolo con ciclodestrina, o sovraespressione genetica di ABCAl, protegge dadisfunzione renalenei modelli di DKD9, FSGS13,14 e ASl3. Abbiamo anche dimostrato che il deficit di ABCAl specifico per i podociti peggiora il fenotipo renale in DKD7. Studi con agonisti LXR, come T1317, hanno anche fornito un forte supporto per un ruolo chiave di ABC Al, che è rimasto un bersaglio terapeutico attraente nonostante la limitazione di questi agenti.

Abbiamo cercato agenti mediante la scoperta di farmaci fenotipici e l'ottimizzazione del drugstore candidato a piccole molecole. Abbiamo identificato una serie di 5-arilnicotinammidi, diversi rappresentanti dei quali aumentavano i livelli di proteina ABCAl e l'efflusso di colesterolo dalle cellule cariche di colesterolo. L'assenza di attività di efflusso nei fibroblasti di un paziente con malattia di Tangeri e l'assenza di un aumento dell'mRNA di ABCAl, hanno rivelato un nuovo meccanismo d'azione.

Gli sforzi di deconvoluzione dell'obiettivo hanno identificato OSBPL7 come un obiettivo di alto interesse. La sonda molecolare （³H-Cpd K） ha legato in modo efficiente l'OSBPL7 nelle cellule viventi e potrebbe competere efficacemente con composti non etichettati. Ancora più importante, abbiamo dimostrato una correlazione "attività-attività" per un insieme più ampio di composti tra la loro capacità di aumentare l'efflusso di colesterolo ABCAl e la loro capacità di competere per il legame della sonda all'OSBPL7. L'analisi mutazionale, combinata con modelli molecolari e studi di docking, indica l'interazione diretta dei composti con la prevista tasca di legame degli steroli OSBPL7. Infine, studi siRNA hanno confermato il coinvolgimento di OSBPL7 nella funzione ABC Al.

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Abbiamo anche identificato CBIR come potenziale obiettivo. Diversi rapporti suggeriscono un ruolo per la segnalazione degli endocannabinoidi nella regolazione del colesterolo cellulare. Rimonabant ha dimostrato di sovraregolare moderatamente il recettore scavenger B1 (SR-B1) e ABCGl, ma non ABC Al, coerentemente con i nostri dati45. È stato dimostrato che il cannabinoide sintetico WIN55,212-2 riduce l'espressione di ABC Al mentre aumenta il recettore scavenger CD36 nei macrofagi RAW264.7 caricati con oxLDL46. Insieme, questi dati non supportano un ruolo importante per CBIR nella regolazione dell'ABCA1.Nei nostri studi, rimonabant e altri agonisti/antagonisti del CBIR tra cui AM251, WIN55-212-2 e arachidonico cloroetilamina (ACEA), erano inattivi per indurre ABCA1 efflusso di colesterolo (Figg. 3a, 4a).

Le proteine ​​leganti l'ossisterolo dei mammiferi (OSBP) erano originariamente implicate nella biosintesi del colesterolo e della sfingomielina47-49. Diversi studi hanno collegato OSBP specifiche con la regolazione della stabilità della proteina ABC Al e dell'efflusso di colesterolo mediato da ABCAl50,51. Nessun dato precedente al presente rapporto ha implicato OSBPL7 come regolatore di ABCA1. I nostri dati suggeriscono che OSBPL7 può fornire un chaperone o una funzione di trasferimento del substrato che influisce su ABC Al. Esperimenti preliminari di co-immunoprecipitazione in cellule trasfettate non hanno identificato un'interazione diretta tra le due proteine. Tuttavia, una meta-analisi di studi di associazione sull'intero genoma (GWAS) ha identificato OSBPL7 tra 60 loci genetici che influenzano i livelli di colesterolo plasmatico negli esseri umani.

Il nostro interesse a lungo termine per il ruolo di ABC Al nelle malattie renali ci ha portato a valutare le 5-arilnicotinimmidi in vitro e in vivo modelli di malattia renale. Abbiamo scoperto che l'OSBPL7 è espresso nei reni, compresi i glomeruli e i podociti, e che Cpd A e Cpd G sovraregolano l'efflusso di colesterolo mediato da apo Al dai podociti carichi di colesterolo. Cpd A e Cpd G promuovono un aumento di ABCAl sulla membrana plasmatica senza influenzare l'espressione dell'mRNA. Questo meccanismo contrasta con gli agonisti LXR, che sovraregolano l'mRNA di ABCAl portando ad un aumento di ABC Al sia nel plasma che nelle membrane intracellulari. Abbiamo valutato l'efficacia terapeutica di Cpd A e Cpd G in vivo in un modello murino di FSGS (nefropatia indotta da ADR). Entrambi gli agenti sono stati trovati per ridurre il contenuto di colesterolo renale, correlando con ridotta proteinuria, perdita di peso e alterazioni patologiche renali. Cpd G è stato altamente efficace per prevenire la perdita di podociti indotta da ADR e i cambiamenti strutturali glomerulari. La significativa riduzione di ABCAl nei reni, accompagnata da un aumento diinfiammatorioproteine, è stato prevenuto da Cpd G, sostenendo un ruolo chiave per ABCA1. Cpd G ha ridotto efficacemente i livelli di albuminuria, BUN e creatinina sierica nei topi AS. Ancora più importante, Cpd G ha prolungato la durata della vita negli animali Col4a3 più anziani con insufficienza renale avanzata.

Questi dati supportano il potenziale terapeutico dei composti che prendono di mira ABCAl e suggeriscono fortemente che questa nuova modalità d'azione offrirà un'efficacia aggiuntiva o complementare ai farmaci mirati alla sintesi o all'assorbimento di RAAS, SGLT2, NRF2 e colesterolo. In particolare, in contrasto con l'effetto di Cpd G, il blocco RAAS non prolunga la durata della vita nei topi Col4a3 più anziani, nonostante sia la terapia più efficace per l'intervento precoce in questo modello53,54. L'attività antiproteinurica di Cpd G era superiore agli effetti del ramipril precedentemente riportati in un modello singenico di AS38. Cpd G può quindi mirare meglio alla popolazione di pazienti con SA e proteinuria rispetto al bardoxolone, un agonista NRF-2 che ha dimostrato di aumentare la GFR ma non ha avuto alcun effetto sulla proteinuria, il più potente predittore di 10- anno Rischio ESRD nella popolazione generale55,56. Le statine sono risultate protettive nell'AS57 sperimentale e sono raccomandate in tutti i pazienti con insufficienza renale cronica per ridurre il rischio cardiovascolare, ma si sono dimostrate inefficaci nel rallentare la progressione della malattia renale 8. Infine, abbiamo recentemente riportato un potenziale beneficio di ezetimibe nell'AS mediante la riduzione di assorbimento di acidi grassi e trigliceridi. Tuttavia, ezetimibe non ha influenzato il contenuto di colesterolo nel rene e la sua efficacia nel migliorare il GFR e ridurre la proteinuria era inferiore agli effetti che riportiamo qui per Cpd G

In sintesi, il presente rapporto descrive l'identificazione mediante la scoperta di farmaci fenotipici di piccole molecole simili a farmaci di prima classe che inducono l'efflusso di colesterolo mediato da ABCAl. La biologia chimica ha identificato l'OSBPL7 come bersaglio molecolare e ha dimostrato che le molecole interagiscono intimamente all'interno del dominio di legame dell'ossisterolo previsto. A nostra conoscenza, questo è solo uno dei pochi esempi di composti simili a farmaci inizialmente scoperti mediante approcci fenotipici, il cui bersaglio è stato successivamente identificato con successo44. I composti G e A si sono dimostrati altamente efficaci per migliorare la funzione renale nei modelli murini, riflettendo due diverse eziologie di malattia renale progressiva. Sembrano essere sicuri e ben tollerati, come si evince dalla loro capacità di ridurre i livelli di AST nei topi sfidati dall'ADR e, in modo più convincente, di prolungare la durata della vita dei topi Col4A3 KO. Questi composti possono offrire una potenziale nuova terapia per la malattia renale prendendo di mira il metabolismo cellulare del colesterolo attraverso una nuova modalità d'azione. Questi agenti, insieme agli attuali farmaci che prendono di mira la pressione sanguigna o il controllo del glucosio, possono affrontare il significativo bisogno insoddisfatto nell'insufficienza renale cronica.

Metodi

Composti. I composti utilizzati in questo studio sono riassunti nella tabella supplementare 5 e sono stati sintetizzati presso F.Hoffmann-La Roche Ltd, Basilea, Svizzera, se non diversamente indicato. Per gli esperimenti in vitro, i composti liofilizzati sono stati ricostituiti in DMSO (Sigma) e le aliquote sono state conservate a -20 gradi. Per gli esperimenti in vivo, i composti liofilizzati sono stati risospesi in veicoli contenenti 1,25% di idrossipropilmetilcellulosa,0,10% di sale sodico docusato,0,18% di propilparaben sodio e 0,02% di acido citrico monoidrato, a pH 6. Una sospensione di particelle fini è stata generata da tre brevi sonicazioni a impulsi eseguite su ghiaccio.

Procedure di chimica sintetica e dati analitici. Fare riferimento al file dei dati supplementari 1.

Biologia chimica/screening del target del candidato In breve, un plasmide che esprime un target candidato di interesse fuso con un tag FLAG è stato trasfettato in cellule HEK293. Dopo 24 ore, è stato aggiunto il composto K triziato a una concentrazione in grado di indurre ABCA1-efflusso di colesterolo mediato （1.0 μM） per 3 ore, quindi le cellule vive sono state esposte alla luce UV (K{{ 7}} nm) per interrogare potenziali reticolazioni composti/bersaglio in situ. Sono stati preparati lisati cellulari, la proteina espressa è stata quindi immunoprecipitata selettivamente utilizzando un anticorpo anti-FLAG accoppiato a perline di sefarosio, le proteine ​​legate sono state separate mediante SDS-PAGE e due macchie identiche sono state preparate e sondate mediante western blot e mediante autoradiografia per rilevare l'espressione proteica e presenza o assenza di reticolazione composta, rispettivamente. Il diagramma di flusso di questa schermata è illustrato in Fig. 2. La Figura 2d illustra la capacità di Cpd A e Cpd G di spostare Cpd K triziato da OSBPL7 sovraespresso e immuno-precipitato. La Figura 3b illustra l'uso di questo test per rilevare il legame di Cpd K triziato a varianti sovraespresse e immunoprecipitate di OSBPL7 contenenti mutazioni puntiformi nella tasca di legame dell'ossisterolo prevista di OSBPL7. I vantaggi di questo metodo sono i. l'uso della trasfezione plasmidica porta a un'elevata espressione di ciascun candidato che riduce la probabilità di perdere un obiettivo autentico per quelli che possono essere espressi a bassi livelli endogeni, iii. l'interazione della sonda chimica con il suo bersaglio avviene in un contesto biologico rilevante (cellule vive) ad una concentrazione farmacologicamente attiva, e iii. l'immunoprecipitazione consente di purificare la proteina di interesse espressa dalle proteine ​​di fondo, migliorando sostanzialmente il rapporto segnale/rumore.

Coltura cellulare. Le linee cellulari sono state acquistate da ATCC e sottocoltivate per non più del passaggio 15, ad eccezione dei podociti umani, che erano originariamente dal Dr. Jochen Reiser. Podociti umani condizionalmente immortalati sono stati coltivati ​​in condizioni permissive a 33 gradi, in terreno RPMI (Corning) contenente l'10 percento di FBS (GIBCO), l'1 percento di penicillina/streptomicina,0.01 mg/ml di insulina umana ricombinante, 0,0055 mg/ml di transferrina umana (sostanzialmente priva di ferro) e 0,005 ug/ml di selenite di sodio (ITS, Corning). Per indurre la differenziazione, i podociti sono stati coltivati ​​a 37 gradi per 14 giorni in un mezzo RPMI contenente il 10% di FBS (GIBCO) e l'1% di penicillina/streptomicina. I podociti differenziati sono stati affamati in RPMI-0.2% FBS per 18 ore e quindi trattati con 1 uM, 5 uM e 10 μM di composti preparati al momento in DMSO per 18 ore a 37 gradi come indicato.

Efflusso di colesterolo nei macrofagi e nei fibroblasti. La capacità dei composti di indurre l'efflusso di colesterolo mediato da ABCAl è stata determinata in colture replicate di cellule THP1 o fibroblasti in 96-micropiastre a pozzetti. Le cellule sono state piastrate a una densità di 150,{4}} cellule/pozzetto. I monociti THP1 sono stati differenziati in macrofagi mediante l'aggiunta di PMA (100 nM) per 72 ore in un mezzo RPMI contenente il 10% di siero bovino fetale e 3 pl di 2-mercaptoetanolo. Le cellule sono state lavate una volta con RPMI-1640 e quindi caricate con 50 ug/ml di LDL acetilato e 10μCi/ml 【'H】-colesterolo in terreno RPMI-1640 contenente il 2% di FCS, per 48 ore a 37 gradi . Dopo il caricamento, le cellule sono state lavate una volta con RPMI-1640 e incubate con i composti del test per altre 24 ore in terreno RPMI-1640 contenente 1 mg/ml di albumina sierica bovina priva di acidi grassi (BSA). Le cellule sono state quindi lavate una volta e l'efflusso di colesterolo è stato indotto dall'aggiunta di 10 ug/ml di apoAI umana o 30 ug/ml di HDL2, HDL3 o LDL in RPMI-1640 contenente I mg/ml di BSA per un ulteriore 6h. La radioattività nei supernatanti di coltura è stata determinata mediante conteggio per scintillazione. L'efflusso di colesterolo è stato espresso come valore relativo rispetto ai controlli incubati in assenza di accettori di colesterolo. Le curve dose-risposta sono state calcolate utilizzando XLfit3 (ID Business Solutions Ltd. UK).

Efflusso di colesterolo nei podociti. I podociti umani differenziati per 13 giorni sono stati etichettati per 24 ore a 37 gradi in terreno RPMI contenente il 2% di FBS e [PH]-colesterolo (1 uCi/ml, American Radiolabeled Chemicals). Le cellule sono state quindi lavate 3 volte con PBS e incubate con RPMI integrato con 0,2% di BSA senza grassi (Sigma) con o senza composti per 18-ha 37 gradi. I composti sono stati utilizzati alle seguenti concentrazioni ∶ Cpd C（1 μM）, Cpd A （1 μM, 5 uM） e Cpd G（l uM, 5 uM,10 μM）. Dopo l'incubazione di 18-h, l'apoAI umana (Calbiochem) è stata aggiunta al terreno (concentrazione finale di 20 ug/mL) e le cellule sono state incubate per altre 18 ore a 37 gradi . Aliquote di mezzo raccolte prima (T =0 h) e dopo (T=18 h) l'aggiunta di apoAI sono state centrifugate a 12,00 × g per 5 min e la radioattività nel surnatante è stato contato per scintillazione liquida. Le cellule sono state quindi lavate con PBS, lisate SDS allo 0,1 percento, NaOH 0,1 M e la radioattività nei lisati è stata quantificata mediante scintillazione liquida. L'efflusso di colesterolo mediato da apo Al, espresso in percentuale, è stato calcolato come la quantità di etichetta rilasciata nel mezzo dopo l'aggiunta di apo Al (la differenza di radioattività nel mezzo prima e dopo l'aggiunta di ApoA1) divisa per la quantità di etichetta totale in ciascun pozzetto (radioattività rilasciata nel mezzo più radioattività nelle cellule lisate).

studi siRNA. I pool di siRNA specifici per l'OSBPL7 umano, il CBIR umano e il controllo negativo siRNA non target sono riassunti nella Tabella supplementare 6. I monociti THPI sono stati seminati a una densità di 80,000 cellule/pozzetto in {{4} }piastre a pozzetti e differenziati con PMA come descritto sopra. Dopo 72 h, il mezzo è stato sostituito da 50 ul di mezzo fresco per pozzetto. Le cellule sono state quindi trasfettate utilizzando il reagente Viromer Blue (Origene) seguendo le indicazioni del produttore. In breve, 10 ul di siRNA (5 μM) sono stati miscelati con 90 ul di Viromer Blue (diluiti all'1 percento v/v nel tampone fornito). Dopo 15 minuti di incubazione, i complessi del reagente di trasfezione siRNA sono stati diluiti a 1:6,5 in mezzo fresco e aggiunti a un volume di 50 ul per pozzetto. Dopo 24 ore, le cellule sono state quindi caricate con colesterolo mediante incubazione con LDL acetilato (25 ug/ml) in mezzo RPMI, 1% FBS, 100 nM PMA, 2 μCi H-colesterolo per 24 ore. Un set di pozzetti contenenti cellule trasfettate è stato messo da parte per verificare l'efficienza della trasfezione mediante RT-PCR. I macrofagi carichi di colesterolo sono stati quindi incubati in presenza di Cpd G 5 uM, o veicolo (0,1 percento DMSO) in mezzo RPMI che rosso fenolo, 0,2 percento BSA) per altre 24 ore. L'efflusso di colesterolo è stato quindi misurato come descritto sopra.

RT-PCR. L'RNA è stato isolato utilizzando il kit RNEasy Plus Mini (Qiagen). La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando qScript cDNA SuperMix (Quantabio) secondo le istruzioni del produttore. La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando TaqMan Fast Universal PCR Master Mix e saggi di espressione genica Taqman (Tabella supplementare 7).

Macchia occidentale. I lisati o le frazioni cellulari sono stati incubati in tampone Laemmli a 55 gradi per 10 minuti in condizioni riducenti. Un totale di 30 ug di proteine ​​​​da lisati cellulari o un terzo del volume raccolto nelle preparazioni di frazioni cellulari è stato separato da SDS-PAGE in gel con gradiente percentuale 4-20 (Biorad) e le proteine ​​​​sono state quindi trasferite su membrane PVDF. Dopo il blocco con il 5% di latte TBS, le membrane sono state sondate con anticorpi primari durante la notte a 4 gradi. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: anticorpo murino anti-ABCA1(Abcam; 1:1000), anticorpo anti-GAPDH di coniglio (Milli-pore;1:10,000), anti-actina murino( CP01, Millipore 10,000), anti-MEK, anti-ERp72, anti-V5 e anti-Na più /K più ATPasi (segnalazione cellulare; tutto 1:100) e anti-OSBPL7 di coniglio (Sigma ; 1:1000). Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con anticorpi IgG-HRP anti-coniglio o anti-topo (Promega,1:10,00). I segnali sono stati rilevati dopo l'incubazione con il substrato Westernbright ECL HRP (Advansta) e i segnali di luminescenza sono stati catturati con la workstation di imaging gel Azure C600 (Azure Biosystems Inc, USA) o pellicole a raggi X.

Frazionamento cellulare. I podociti differenziati sono stati trattati con composti Cpd C （l μM）, Cpd A（5 μM） o Cpd G（10 μM） per 18 h, lavati e quindi raccolti in PBS ghiacciata. Le cellule sono state centrifugate a 1000 × g per 5 minuti, il supernatante è stato accuratamente rimosso e il pellet risospeso in tampone ipotonico (15 mM KCl, 1,5 mM MgClz, 10 mM HEPES e I mM DTT) integrato con una proteasi cocktail di inibitori (Roche). Le cellule sono state interrotte con un douncer di vetro ed è stato aggiunto saccarosio per ottenere una concentrazione finale di 227 mM. I lisati cellulari sono stati centrifugati a 1000×g per 30 minuti a 4 gradi. Il supernatante è stato quindi trasferito in una nuova provetta e centrifugato a 10.000 × g per 15 minuti a 4 gradi . Il pellet, contenente la frazione microsomiale è stato raccolto e il supernatante è stato trasferito in una nuova provetta e centrifugato a 100.000×g per 1 ora a 4 gradi . La frazione di membrana plasmatica pellettata è stata raccolta e il surnatante, contenente la frazione citosolica priva di organelli, è stato concentrato in colonne filtranti Vivaspin 500. Il western blot è stato eseguito utilizzando anticorpi per ABCAl e marcatori specifici per ciascuna frazione di membrana come descritto sopra. Nat/K più ATPasi è stato utilizzato per identificare la frazione della membrana plasmatica, ERp72 come marcatore per la frazione arricchita con microsomi e MEK come controllo per la frazione citosolica non membranosa.

ABC AT co-immunoprecipitazione. ABCA{{0}}Il costrutto di bandiera è stato gentilmente fornito dal Dr.Michael Fitzgerald, Università di Harvard. Il costrutto OSBPL7-V5 (pcDNA3.1-V{5}}ORP7) è stato acquistato da Addgene. I vettori di espressione dei mammiferi PCMV6-AN-GFP e pCMV6-AC-3DDK, di Origene, sono stati usati come controlli negativi. Le cellule HEK293 sono state co-trasfettate transitoriamente con una delle seguenti combinazioni di plasmidi:(1)ABCA1-Flag più OSBPL7-V5;(2)ABCA1-Flag più PCMV{{19 }}AN-GFP; oppure(3) OSBPL7-V5＋pCMV6-AC-3DDK utilizzando il reagente di trasfezione Fugene 6 (Promega) seguendo le istruzioni del produttore. 48 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state lisate con 1 ml di tampone di immunoprecipitazione (1% Triton X-100, 50 mM Tris-Cl pH 7,0,150 mM NaCI) integrato con un cocktail di inibitore della proteasi (Roche). I lisati sono stati eliminati mediante centrifugazione e quantità uguali di proteine ​​totali da ciascun supernatante sono state incubate per una notte a 4 gradi con 30 ul di gel di affinità M2 anti-Flag (Sigma Aldrich). I granuli sono stati pellettizzati mediante centrifugazione e lavati 5 volte con 1 ml di tampone di immunoprecipitazione. Le proteine ​​immunoprecipitate sono state eluite incubando le sfere con 50 ul di tampone campione 2x per 15 minuti a 56 gradi. La presenza di ABC A1 e OSBPL7-V5 nei lisati e negli eluati è stata verificata mediante western blot come descritto sopra.

Studi sugli animali. Gli animali sono stati alloggiati con cicli luce/buio di 12 ore/12 ore e a temperatura controllata (18-23 gradi ) e umidità (40-60 percento) in una struttura per animali priva di agenti patogeni della Divisione Risorse veterinarie dell'Università di Miami, Miller School of Medicine. Ai topi è stata fornita una dieta standard di cibo per roditori con il 18% di proteine ​​​​e acqua ad libitum. Il protocollo di studio è stato approvato dall'Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Miami, che è accreditato dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con tutte le normative etiche federali e statali, comprese le normative Animal Welfare Act (AWA) supervisionate dal Dipartimento dell'agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio (PHS) Policy) amministrato dal National Institutes of Health (NIH), Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW). I topi femmina Balb/c sono stati acquistati dai Jackson Laboratories per studi sulla nefropatia indotta da adriamicina. A 8 settimane di età, i topi hanno ricevuto una singola dose di Adriamicina (Sigma-Aldrich, 12 mg/Kg) o veicolo (0,9 percento NaCI) tramite iniezione nella vena della coda. I topi sono stati separati casualmente in sei gruppi sperimentali e, a partire dalle 24 ore dopo l'iniezione di ADR, trattati con un veicolo o con diverse dosi di composti al giorno tramite sonda gastrica per 28 giorni. Sono state utilizzate le seguenti dosi: Cpd C (agonista LXR) 10 mg/Kg; Cpd A 30mg/Kg; Cpd G 100mg/Kg. Tutti gli animali sono stati sacrificati 28 giorni dopo l'iniezione di ADR. I topi Col4a3 KO (ceppo Col4a3tmiDec 129X1/SvJ) sono stati acquistati da Jackson Labs. I topi sono stati separati casualmente in 2 gruppi. A partire da 4 settimane di età, i topi sono stati dosati mediante sonda gastrica una volta al giorno con un veicolo o Cpd G (100 mg/Kg) per 4 settimane seguite da sacrificio a 8 settimane di età. Un secondo studio è stato condotto su topi Col4a3 KO con trattamento iniziato a 6 settimane di età. Questo studio è stato condotto al fine di valutare se il trattamento con Cpd G di topi con insufficienza renale accertata potrebbe ritardare la malattia renale allo stadio terminale e quindi prolungare la sopravvivenza. Per il trattamento con ramipril, i topi Col4a3 KO hanno iniziato a ricevere ramipril all'età di 4 settimane. Ramipril è stato aggiunto all'acqua da bere ad una concentrazione che avrebbe portato ad una dose di 10 mg/Kg/giorno 8.

Analisi fenotipica dei topi. Sono stati raccolti campioni di urina spot settimanali. L'albumina urinaria è stata misurata mediante ELISA (Laboratori Bethy!) e la creatinina mediante un test colorimetrico (Stanbio). L'albuminuria è stata espressa come rapporto albumina/creatinina. I topi sono stati anestetizzati con ketamina (90 mg/Kg)/xilazina (10 mg/Kg), il sangue è stato raccolto in provette eparinizzate e gli animali sono stati quindi perfusi attraverso il ventricolo sinistro con una soluzione di NaCl allo 0,9%. Le cortecce renali sono state accuratamente asportate e separate in campioni che sono stati congelati a scatto, incorporati in OCT o fissati in formalina al 10% per le valutazioni successive.

Determinazione della deposizione lipidica in sezioni di corteccia renale. I campioni di corteccia renale incorporata nell'OCT sono stati criosezionati con uno spessore di 4 μm e colorati con olio. Soluzione di O-isopropanolo rosso (Electron Microscopy Science, PA) diluita 6:4 in acqua e quindi controcolorata con Hematoxylin Harris Hg Free (VWR, PA). Le sezioni sono state quindi valutate utilizzando un microscopio ottico (Olympus BX 41, Tokyo, Giappone).

Determinazione del contenuto di colesterolo e trigliceridi. I campioni di corteccia renale congelati a scatto sono stati omogeneizzati in tampone fosfato di potassio 2 mM, pH 7,(1{{10}} pul buffer/mg di tessuto） utilizzando un bicchiere di vetro su ghiaccio. 100 ul dell'omogenato sono stati accuratamente miscelati con 1 ml di esano: isopropanolo (3:2;vv) per volume di tessuto omogenato. Le fasi acquosa (pellet) e organica (supernet) sono state separate mediante centrifugazione a 12,000× g per 5 minuti I pellet (fase acquosa) sono stati essiccati e ricostituiti in urea 8 M, SDS 0,1 percento, NaOH 0,1 M e le proteine ​​totali sono state quantificate con il metodo BCA (Thermofisher).La fase organica è stata essiccata mediante esposizione all'azoto. I lipidi sono stati quindi ricostituiti in 100 ul isopropanol∶NP-40 (9:1;vv). Il contenuto di trigliceridi è stato misurato utilizzando un kit colorimetrico secondo le istruzioni del produttore (Cayman Chemical USA). Il contenuto di colesterolo totale e CE è stato analizzato utilizzando un metodo enzimatico fluorimetrico 59. Per la misurazione del colesterolo totale, gli estratti sono stati diluiti 1:100 in tampone di dosaggio (fosfato di potassio 100 mM e,50 mM NAC, 5 mM di acido colico, 0,1 percento Triton X-10, pH 7,4) contenente colesterolo ossidasi (1 U/ml), colesterolo esterasi (1 U/ml), perossidasi di rafano (1 U/ml), e rosso Aplex (75 μM). Le reazioni sono state incubate a 37 gradi per 30 minuti in una piastra a pozzetti nera opaca 96- (Greiner) e la fluorescenza è stata misurata in un lettore di micropiastre (Spectramax i3X, Molecular Devices) a 530 nm di eccitazione e 580 emissioni.

Per la determinazione della CE, 150 ul del tampone del test descritto sopra, integrato con catalasi epatica bovina (45 U/ml) e colesterolo ossidasi (1 U/ml), sono stati aggiunti a 25 ul di campione e incubati per una notte a 37 gradi per eliminare l'esaurimento colesterolo lasciando solo esteri del colesterolo. Quindi, sono stati aggiunti 75 ul di reagente per la rilevazione dell'estere del colesterolo (1 U/ml di colesterolo ossidasi, 4 U/ml di colesterolo esterasi, 24 U/ml di perossidasi di rafano, 300 μM Amplex Red). La reazione è stata incubata a 37 gradi per 30 minuti e il segnale di fluorescenza è stato misurato come sopra descritto Gli standard interni includevano campioni contenenti 1 mM di colesterolo e 5 uM di colesterolo oleato al fine di verificare la completezza della decomposizione enzimatica del colesterolo libero nonché la sensibilità e specificità del saggio.

Valutazione istologica. Sezioni di corteccia renale incluse in paraffina fissate in formalina di 4 um di spessore sono state colorate con acido periodico-Schiff (PAS). I vetrini sono stati analizzati da un patologo renale in un disegno in doppio cieco. La sclerosi glomerulare (globale e segmentaria), l'ipertrofia dei podociti e l'iperplasia dei podociti sono state espresse come percentuale di glomeruli riscontrata con queste anomalie. Le microcisti tubolari e l'infiammazione interstiziale sono state valutate su una scala 0-4 dove 0=0 percento ,05=1-10 percento ,1=11-25 percento ,2:26-50 percento ,3:{{ 12}} percento e 4=più del 75 percento di danni. L'espansione mesangiale è stata valutata in base all'analisi semiquantitativa (scala 0-5) o alla percentuale di glomeruli che mostrano espansione mesangiale (percentuale).

Microscopia ad immunofluorescenza. Per il rilevamento dell'espressione di ABC Al, sezioni di corteccia renale di paraffina da 4 um sono state deparaffinate e reidratate. Gli antigeni sono stati recuperati facendo bollire per 30 min in tampone citrato a pH 6.0(Target Retrieval Solution, Citrate pH 6, Sigma, USA). Le sezioni sono state permeabilizzate per 30 minuti con lo 0,1% di Triton X-100 in TBS. Le sezioni di tessuto sono state incubate con il 10% di siero di capra (cat #G9023, Millipore Sigma) e l'1% di BSA (cat#SP-5050-500, Vector, USA) in TBS-T per 1 ora a temperatura ambiente per bloccare eventuali non specifici legame. I campioni sono stati quindi incubati per una notte a 4 gradi con anticorpi Rat anti-ABCAL(Novus,1:200) e Rabbit anti-WI1 (Abcam,1:200) in una camera umidificata. Dopo un lungo lavaggio, i campioni sono stati quindi incubati per I h a temperatura ambiente con anticorpi secondari coniugati con fluorocromi (Invitrogen,1:500). Sono stati aggiunti alle sezioni supporti di montaggio antifade contenenti DAPI (Vectashield Plus) prima di essere analizzati

Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale FluoView FV1000 (Olympus) con un obiettivo a olio x63 su piani diversi utilizzando un modello della serie Z con una dimensione del passo di 0,18 um. Durante l'analisi, i singoli aerei sono stati deconvoluti e impilati per produrre un'immagine massima proiettata utilizzando il software di visualizzazione dell'influenza versione 4.3b (Olympus). Sono state acquisite almeno 5 immagini da 5 diversi campi per campione. La quantificazione dell'intensità media della fluorescenza glomerulare (MFI) ABCAl è stata eseguita utilizzando il software Fiji-ImageJ.

Per il rilevamento di OSBPL7,4 sezioni di corteccia renale congelate incorporate nell'OCT, sono state fissate con PFA-saccarosio (2 percento, 4 percento) in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente e permeabilizzate con Triton-PBS allo 0,3 percento per 15 min e bloccato con buffer di blocco (5 percento FBS in PBS) per 1 ora. Le sezioni di tessuto sono state quindi incubate con anticorpi anti-OSBPL7 di coniglio (Sigma, 1:50) e anti-sinaptopodina di capra (Santa Cruz, 1:800) in una camera umidificata per una notte a 4 gradi. Dopo un lungo lavaggio, i campioni sono stati quindi incubati con anticorpi secondari coniugati con fluorocromi e ricoperti con mezzi di montaggio come descritto sopra. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza Leica DMI 6000B.

analisi statistica. GraphPad Prism ver 6 o 7 è stato utilizzato per eseguire tutte le analisi statistiche. I gruppi sono stati confrontati utilizzando un test t a due code o un ANOVA unidirezionale seguito dal test di Dunnett o di Tukey. Il test F, Brown-Forsythe o Bartlett è stato utilizzato per determinare le varianze significative tra i gruppi, se P<0.05, then="" groups="" were="" compared="" using="" two-tailed="" mann-whitney,="" or="" kruskal-wallis="" followed="" by="" dunn's="" tests.="" the="" correlation="" between="" albuminuria="" and="" accumulation="" of="" cholesterol="" ester="" in="" kidney="" cortexes="" was="" assessed="" using="" the="" spearman="" coefficient="" test.="" p=""><0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" only="" data="" from="" independent="" experiments="" were="">

Tutti gli animali sono stati assegnati in modo casuale a gruppi di trattamento.