Astratto:È stato riportato che le radici di Vitis amurensis hanno il potenziale per lo sbiancamento della pelle attraverso la valutazione della melanogenesi e delle attività inibitorie della tirosinasi. In questo studio, le radici di V. amurensis sono state utilizzate per selezionare rapidamente gli ingredienti sbiancanti utilizzando LC-Q-TOF-MS accoppiato con il test inibitorio della tirosinasi e per ottimizzare il processo di estrazione da utilizzare come materiale funzionale sbiancante per la pelle mediante la metodologia della superficie di risposta. I risultati hanno mostrato che le radici di V. amurensis hanno mostrato effetti inibitori della tirosinasi da parte di due oligomeri di stilbene, ε-vinifera (1) e vitamina B (2), come previsto da LC-Q-TOF-MS accoppiato con saggio biologico. Le condizioni di estrazione ottimali (concentrazione di metanolo 66%, volume di solvente 140 mL e tempo di estrazione 100 min) per gli ingredienti sbiancanti per la pelle sono state stabilite con rese del 6,20% e l'attività inibitoria della tirosinasi è stata dell'87,27%. La relazione tra ciascun fattore e la sua risposta corrispondente è stata confermata dall'analisi di correlazione di Pearson. Il volume del solvente mostrava una chiara relazione lineare con le rese e la concentrazione di metanolo aveva una forte relazione lineare con l'attività inibitoria della tirosinasi per i composti 1 e 2, così come la loro combinazione. Nel complesso, è stato dimostrato che LC-Q-TOF-MS accoppiato con il saggio biologico ha il potenziale per trovare efficacemente nuovi costituenti attivi, oltre a componenti attivi noti; le vitamine possono essere proposte come un nuovo potenziale agente sbiancante naturale.

Secondo studi pertinenti,cistancheè un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale èCistanoside, che ha vari effetti comeantiossidante, antinfiammatorio, Epromozione della funzione immunitaria. Il meccanismo tra cistanche esbiancamento della pellerisiede nell'effetto antiossidante della cistancheglicosidi. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata datirosinasie la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contieneCistanoside, che è un antiossidante e può ridurre la generazione di radicali liberi nel corpo, inibendo così la produzione di melanina.

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Parole chiave:Vite amurensis; LC-Q-TOF-MS accoppiato con saggio inibitorio della tirosinasi; metodologia della superficie di risposta; Correlazione di Pearson

1. Introduzione

La melanina è responsabile del colore della pelle e dei capelli dei mammiferi e protegge la pelle dai raggi ultravioletti, ma l'eccessiva produzione di melanina e l'accumulo di melanina nella pelle causano disturbi cutanei da iperpigmentazione come lentiggini, melasma, macchie senili, efelidi e lentiggini senili. La tirosinasi, nota come enzima ossidasi contenente rame, ha un ruolo cruciale nella biosintesi della melanina. L'enzima ha catalizzato due reazioni di ossidazione consecutive: la prima fase, l'idrossilazione della L-tirosina a 3,4-diidrossi-L-fenilalanina (L-DOPA), e la seconda fase, l'ossidazione della L-DOPA a dopachinone. Il dopachinone è una sostanza altamente reattiva che può polimerizzare spontaneamente per generare melanina [1-3]. Pertanto, gli inibitori della tirosinasi possono essere utilizzati come trattamenti per i disturbi della pelle correlati all'iperpigmentazione e come agenti sbiancanti per la pelle.

La Vitis amurensis, vitigno selvatico, è diffuso principalmente in Asia (Corea, Cina e Giappone). I frutti completamente maturi vengono consumati crudi e contengono abbondanti sostanze nutritive come saccarosio, glucosio, proteine ​​e vitamine, quindi vengono utilizzati come materiale per vino, succhi, gelatine e marmellate. Inoltre, le sue foglie sono utilizzate in insalata [4]. Le sue radici e i suoi steli sono stati usati come medicina tradizionale per il trattamento del cancro, del dolore nevralgico e del dolore addominale [5,6]. Le sue radici sono costituite da stilbeni (un costituente principale), procianidine, flavonoidi, triterpenoidi e altri composti fenolici. Fino ad ora, le composizioni chimiche della radice sono state studiate in modo sufficientemente dettagliato. In particolare, sono stati segnalati vari oligomeri di stilbene, tra cui resveratrolo, amurensina A, vitamina A, (plus)-ε-vinifera, amurensine C-M, ampelopsin A, D e ampelopsin E [6]. L'estratto metanolico della radice mostra un effetto anti-melanogenico contro la melanogenesi indotta dall'ormone stimolante i melanociti nelle cellule B16F10 e nell'ossidazione della 3,4-diidrossifenilalanina (L-DOPA) attraverso la tirosinasi del fungo [7]. Inoltre, gli estratti di V. amurensis e i loro composti attivi mostrano effetti antiossidanti, antinfiammatori, neuroprotettivi e antitumorigeni [7-10].

LC-MS combinato con un saggio biologico può confermare contemporaneamente il profilo chimico e l'attività biologica dei componenti nei prodotti naturali senza la necessità di estrazione e isolamento. Pertanto, è stato recentemente utilizzato per identificare in modo efficiente e rapido i composti bioattivi nei prodotti naturali [11-13].

L'ottimizzazione è un processo che consente la massima efficienza di sistemi o prodotti sperimentali. Metodologia della superficie di risposta (RSM), analisi multivariata, progettazione di esperimenti utilizzando tecniche matematiche e statistiche basate su modelli empirici ed espressione della correlazione tra progettazione sperimentale e risultati come funzione polinomiale, sono alcune tecniche che forniscono condizioni di ottimizzazione ideali con la massima efficienza. RSM è un metodo di ottimizzazione accurato ed efficiente ampiamente utilizzato in vari campi, tra cui la lavorazione degli alimenti, la chimica, la biologia e l'agricoltura [14-16]. Negli ultimi decenni è aumentato l'interesse per prodotti farmaceutici, cosmetici e alimenti funzionali contenenti prodotti naturali; di conseguenza, è in corso una ricerca sia nel mondo accademico che nell'industria finalizzata allo sviluppo di tali prodotti [17,18]. Il primo passo in questi studi comporta l'estrazione del costituente bioattivo da prodotti naturali. In questo momento, poiché numerosi fattori come il tempo di estrazione, la temperatura, il rapporto liquido-solido e il volume del solvente hanno influito sui costituenti estratti, è necessaria un'ottimizzazione per estrarre al massimo i costituenti bioattivi.

A nostra conoscenza, i costituenti inibitori della tirosinasi e l'ottimizzazione degli estratti delle radici di V. amurensis sono stati raramente riportati [5,19]. Questo studio, quindi, mirava a ottenere rapidamente l'inibitore della tirosinasi dalle radici di V. amurensis utilizzando LC-Q-TOF-MS accoppiato con il test di inibizione della tirosinasi e ad ottimizzare le condizioni di estrazione per ampliare l'utilizzo delle radici di V. amurensis come agente sbiancante della pelle di RSM.

2. Risultati e discussione

2.1. LC-QTOF MS accoppiato con un test di inibizione della tirosinasi utilizzando l'estratto di radice di V. amurensis

L'80 percento dell'estratto di MeOH della radice di V. amurensis ha mostrato una significativa attività inibitoria della tirosinasi (80,7 ± 0,8 percento a 50 µg/mL, Tabella S1). Per identificare i composti inibitori della tirosinasi nella radice di V. amurensis senza isolamento, è stato condotto LC-QTOF-MS accoppiato con un test inibitorio della tirosinasi. Il profilo chimico dell'estratto di radice di V. amurensis è stato ottenuto nella prima esecuzione (Figura S1) e i composti bioattivi sono stati identificati utilizzando un'analisi inibitoria della tirosinasi delle frazioni raccolte ogni 30 s dalla seconda esecuzione (Figura 1). C'erano due picchi tra 19 e 22 min sul cromatogramma di massa previsto per avere una significativa attività inibitoria della tirosinasi e le loro strutture sono state identificate come stilbene dimero (1) e stilbene tetramero (2) utilizzando la profilazione chimica (Tabella 1).

2.2. Identificazione dei costituenti inibitori della tirosinasi della radice di V. amurensis

In primo luogo, dalla frazione EtOAc sono stati isolati due costituenti che dovrebbero avere attività inibitoria della tirosinasi e la loro bioattività è stata valutata. Le strutture dei composti isolati 1 e 2 sono state identificate come ε-vinifera (1) [20,21] e vitamina B (-vinifera, 2) [21-23], rispettivamente, utilizzando 1H-NMR, 13C-NMR e ESI-MS (Figura 2, Figure S2 e S3 e Tabella S2). Nel saggio di inibizione della tirosinasi, i valori di IC50 dei composti 1, 2 e dell'acido cogico erano rispettivamente di 3,51, 10,74 e 27,09 µM. Entrambi i composti hanno mostrato effetti inibitori della tirosinasi più elevati rispetto al controllo positivo, l'acido kojico che è il noto costituente sbiancante della pelle (Tabella 1 e Figura S4). In studi precedenti, è stato riportato che ε-vinifera (1) ha attività inibitoria della tirosinasi [23]; tuttavia, la vitamina B (2) è stata identificata per la prima volta nel nostro studio.

Nel complesso, i risultati, correlati ai dati previsti di LC-MS accoppiati con un test di inibizione della tirosinasi e vitamina B (2), mostrano il potenziale come nuovo inibitore della tirosinasi. Inoltre, sono stati condotti studi di docking molecolare per supportare il risultato della significativa attività inibitoria della tirosinasi dei due oligomeri di stilbene. Come mostrato nella Tabella 1, i composti 1 e 2 hanno mostrato un punteggio di docking più elevato rispetto al controllo positivo, acido cogico, coerente con i nostri dati sperimentali. Tuttavia, i risultati di docking dei composti erano contrari ai nostri risultati sperimentali. Le modalità di interazione dei composti 1 e 2 sono state descritte nella Figura 3. Il composto 1 ha formato 4 legami idrogeno, 2 interazioni idrofobiche e 1 interazione pi-lone pair e il composto 2 ha formato 11 legami idrogeno, 7 interazioni idrofobiche, 1 interazione di van der Waals e 3 interazioni pi-lone pair. Di conseguenza, è stato confermato che i composti possono essere inseriti nel sito attivo della proteina bersaglio e legarsi a residui di amminoacidi catalitici che possono inibire l'attività della tirosinasi. Inoltre, ε-vinifera (1) è segnalato come un inibitore competitivo che si lega allo stesso sito in cui la L-DOPA si lega alla tirosinasi [23]. È stato osservato che la vitamina B (2) si lega allo stesso sito della ε-vinifera (1), il che ha confermato che la vitamina B (2) è un nuovo inibitore competitivo.

2.3. Ottimizzazione dell'estrazione della radice di V. amurensis mediante RSM

Per utilizzare le radici di V. amurensis come materiale funzionale sbiancante per la pelle, le condizioni di estrazione ottimali sono state progettate dal design Box-Behnken (BBD) per massimizzare la resa di estrazione e l'attività inibitoria della tirosinasi. Gli effetti di risposte indipendenti come la resa di estrazione, l'attività inibitoria della tirosinasi, la quantità del composto 1, la quantità del composto 2 e la quantità della somma dei composti 1 e 2, sulle tre variabili indipendenti (tempo di estrazione, concentrazione di MeOH/acqua e volume di solvente), sono stati misurati (Tabella 2). L'intervallo di variabili è stato impostato come tempo di estrazione (40, 70 e 100 min), concentrazione di MeOH (40, 70 e 100 percento) e volume del solvente ( 35, 87,5 e 140 mL) sulla base di un esperimento preliminare a fattore singolo (dati non mostrati). I valori ottenuti dagli esperimenti progettati sono stati espressi come polinomi di correlazioni tra variabili utilizzando l'analisi di regressione (Tabelle S4-S13 e Figura S5). Come risultato dell'esecuzione dell'ottimizzazione individuale per ciascuna reazione (Tabella 3), la resa doveva rappresentare il 6,21% se estratta con 100.00 min, MeOH 64,78%, 140.{{42} } ml. L'attività inibitoria della tirosinasi (percentuale) è stata estratta con condizioni di 65,22 min, MeOH 100,00 percento, 140,00 mL e si prevedeva che mostrasse un valore del 90,37 percento . La quantità del composto 1 a 65,74 min, MeOH 100.{00 percento, 35,00 mL è stata prevista come 37,45 µg/mg, e la quantità del composto 2 a 70,00 min, MeOH 70,00 percento e 92,24 ml è stato previsto come 86,77 µg/mg. Inoltre, ci si aspettava che il contenuto totale dei composti 1 e 2 mostrasse un valore massimo di 108,10 µg/mg quando estratto in condizioni di 75,20 min, MeOH 100,00% e 35,00 mL. Gli esperimenti basati su condizioni ottimizzate hanno prodotto 6,19 ± 0,36 percento , attività inibitoria della tirosinasi 91,72 ± 3,48 percento , contenuto del composto 1 36,54 ± 1,78 µg/mg, contenuto del composto 2 85,74 ± 16,57 µg/mg e la somma dei composti 1 e {{85} }.10 ± 19,11 µg/mg e le risposte individuali per ogni variabile hanno mostrato una differenza del 5% o meno rispetto ai valori teoricamente previsti. L'ottimizzazione della risposta multipla è stata eseguita per massimizzare la resa di estrazione e l'attività inibitoria della tirosinasi (Tabella 3). Le condizioni ottimizzate erano le seguenti: tempo di estrazione, 100 min; concentrazione di MeOH, 66,38%; e volume del solvente, 140 mL. Usando queste condizioni, la resa è stata determinata essere 5,95 ± 1,13% e l'attività inibitoria della tirosinasi era 85,93 ± 1,57%; questi valori erano simili ai valori previsti, rispettivamente 6,20 e 87,25%. Inoltre, la correlazione tra ciascuna variabile e la risposta corrispondente è stata analizzata utilizzando la correlazione di Pearson (Tabella 4). La resa di estrazione ha mostrato una chiara relazione lineare tra il tempo di estrazione e la concentrazione di MeOH e una relazione lineare negativa con la quantità di composto 1. Inoltre, l'attività inibitoria della tirosinasi ha mostrato una forte relazione lineare tra la quantità di composto 2 e la quantità della somma dei composti 1 e 2 e una chiara relazione lineare con il composto 1. Pertanto, l'attività inibitoria della tirosinasi della radice di V. amurensis era proporzionale a entrambi i composti 1 e 2 ma mostrava una relazione lineare più forte con la quantità del composto 2 rispetto al composto 1.

3. Materiali e Metodi

3.1. Procedure sperimentali generali

La cromatografia liquida a media pressione (MPLC) è stata condotta utilizzando un Biotage Isolera (Biotage AB, Uppsala, Svezia). Un sistema è dotato di una pompa per cromatografia flash ad alte prestazioni (HPFC), un rilevatore a doppia lunghezza d'onda variabile e un collettore. Gli spettri NMR sono stati acquisiti utilizzando uno spettrometro Bruker SPECTROSPIN 300 MHz (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). Il metanolo-d4, un solvente NMR, è stato acquistato da Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Acetonitrile (ACN), acqua e metanolo (MeOH) di grado cromatografico sono stati acquistati da ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Repubblica di Corea). L-tirosina, tirosinasi dei funghi, acido cogico e acido formico sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA).

3.2. Materiale vegetale

La radice di V. amurensis è stata ottenuta da Gyeongbuk, Corea, e acquistata anche da Omniherb (Daegu, Repubblica di Corea). Sono stati identificati dal Dr. Prof. Ki Yong Lee, del College of Pharmacy della Korea University. Un esemplare di voucher (KUP-HD071) è stato depositato presso il Laboratorio di Farmacognosia, College of Pharmacy, Korea University.

3.3. Spettrometria di massa LC-Q-TOF

La LC è stata eseguita utilizzando una serie Agilent 126 0 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) comprendente una pompa binaria, un degasatore online, un campionatore automatico, un compartimento della colonna controllato termostaticamente e un rivelatore a serie di fotodiodi. La separazione cromatografica è stata eseguita utilizzando una colonna Shiseido CapCell PAK C18 (5 µm, 4,6 mm, ID × 150 nm). La fase mobile era costituita da acqua (solvente A) e ACN (solvente B), entrambi contenenti 0,1% di acido formico. Le condizioni del gradiente erano le seguenti: 0–5 min, 10 percento B, 5–30 min e aumento lineare B dal 10 al 90 percento . La velocità del collega è stata fissata a 0,6 ml/min; 5 μL e 20 μL dei campioni sono stati iniettati rispettivamente per l'analisi LC-Q-TOF-MS e LC-Q-TOF-MS accoppiata con il test di inibizione della tirosinasi. La spettrometria di massa è stata eseguita utilizzando uno spettrometro di massa Agilent 6530 Q-TOF (Agilent, Santa Clara, CA, USA) con un'interfaccia di ionizzazione elettrospray (ESI) in modalità negativa. I dati dell'intervallo di massa da m/z 50–1000 sono stati raccolti in modalità centroide. I parametri di massa erano i seguenti: tensione capillare, 4000 V; pressione del nebulizzatore, 40 psi; tensione di frammentazione, 175 V; tensione skimmer, 65 V; temperatura del gas di essiccazione, 325 ◦C; compagno tasso di gas essiccante, 12,0 L/min; energia di collisione 10, 20, 30 e 40 eV. La regolazione dei parametri di acquisizione e l'elaborazione dei dati sono state eseguite utilizzando l'acquisizione dati LC-MS/MS utilizzando Q-TOF serie 6530 (versione B.05.00) (software MassHunter Workstation, Agilent, Santa Clara, CA, USA).

3.4. LC-Q-TOF-MS accoppiato con un test di inibizione della tirosinasi

LC-Q-TOF-MS accoppiato con un test di inibizione della tirosinasi è stato condotto utilizzando il metodo stabilito nello studio precedente [24]. In breve, il test è proceduto in due corse. Nella prima esecuzione, il profilo chimico del campione è stato ottenuto utilizzando LC-Q-TOF-MS. Nella corsa successiva, l'eluato dopo essere passato attraverso il sistema LC nelle condizioni LC-Q-TOF dichiarate è stato raccolto in 96-pozzetti ogni 30 s. L'attività inibitoria della tirosinasi delle frazioni raccolte è stata valutata utilizzando un test di inibizione della tirosinasi.

3.5. Isolamento dei composti inibitori della tirosinasi dalla radice di V. amurensis

Per l'isolamento dei composti inibitori della tirosinasi identificati utilizzando LC-Q-TOF-MS accoppiato con il test di inibizione della tirosinasi, la radice di V. amurensis (3.01 kg) è stata estratta tre volte con l'80 percento MeOH per 60 min a temperatura ambiente mediante ultrasuoni. Il solvente estratto è stato filtrato e concentrato per ottenere un estratto grezzo (215,7 g), che è stato sospeso in acqua e ripartito sequenzialmente utilizzando n-esano, acetato di etile (EtOAc) e n-BuOH. La frazione EtOAc (25,85 g) è stata sottoposta a cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando n-esano: EtOAc in condizioni di gradiente (2 0: 1 → 0: 1) per ottenere sette frazioni (E1 – E7). La frazione E4 è stata separata usando MPLC e 100 g di SNAP KP-Sil, una cartuccia di gel di silice e diclorometano: MeOH in condizioni di gradiente (97:3 → 0:100) per ottenere sette sottofrazioni (da E4–1 a E4–7) . Il composto 2 (417,0 mg) è stato ottenuto da E4-5. La sottofrazione E4–4 è stata nuovamente cromatografata su MPLC utilizzando SNAP 25 g Ultra, una cartuccia di gel di silice e cloroformio:MeOH: H2O in condizioni di gradiente (50:4:1 → 15:4:1) per produrre sette frazioni ( da mi4–4–1 a mi4–4–7). Il composto 1 (396,0 mg) è stato ottenuto da E4-4-5, che è stato osservato come un singolo punto su una lastra di cromatografia su strato sottile (TLC).

3.6. Saggio di inibizione della tirosinasi

L'attività inibitoria della tirosinasi è stata valutata utilizzando un metodo precedentemente descritto con una leggera modifica [25]. I due microlitri di campione e 50 µL di 0.1 U/µL di tirosinasi di funghi sono stati trattati in 96-pozzetti e incubati a 37°C. Dopo 15 min, sono stati aggiunti 50 µL di 1 mM di L-tirosina e poi sono stati fatti reagire a 37 ◦C per 15 min. La quantità di dopacromo formato è stata misurata a 495 nm utilizzando un lettore di micropiastre Spectra Max 19{{20}} (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). L'attività inibitoria della tirosinasi è stata calcolata utilizzando la seguente equazione: inibizione della tirosinasi ( percentuale )=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, dove S è l'assorbanza del campione, della tirosinasi e L -tirosina; S0 è l'assorbanza del campione e della L-tirosina; C è l'assorbanza della tirosinasi e della L-tirosina e C0 è l'assorbanza della L-tirosina. L'acido cogico, un noto inibitore della tirosinasi, è stato utilizzato come controllo positivo. I valori IC50 sono stati calcolati utilizzando GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

3.7. Studi di docking molecolare

L'attracco molecolare è stato eseguito utilizzando il software SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd., St. Louis, MO, USA) con strutture cristalline di PPO3, una tirosinasi di Agaricus bisporus (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W). Tutte le molecole d'acqua della proteina bersaglio sono state rimosse e la preparazione del ligando è stata condotta mediante il protocollo di preparazione "sanitizzazione" in SYBYL-X 2.1.1. L'affinità proteina-ligando è stata calcolata dal campo di forza Tripos ed espressa come punteggio totale. La posa ancorata del ligando dal complesso proteina-ligando è stata visualizzata nel programma Discovery Studio 2017 R2 Client (Biovia Co., San Diego, CA, USA).

3.8. Disegno sperimentale e analisi statistica

Una condizione ottimizzata per l'estrazione di costituenti con la massima attività inibitoria della tirosinasi dalla radice di V. amurensis è stata stabilita utilizzando il BBD con tre variabili e tre livelli (MINITAB Release 14.12.0 Statistical Software). Sulla base dei risultati preliminari dell'esperimento a fattore singolo, sono state selezionate le variabili indipendenti tra cui tempo di estrazione (X1), concentrazione di MeOH e acqua (X2) e volume del liquido (X3) e un intervallo delle loro variabili (Tabella S3). Le variabili per RSM sono state codificate utilizzando tre livelli, −1, 0 e 1. Complessivamente, sono stati progettati 15 esperimenti di cui 3 replicati al centro del progetto (Tabella 2). Come risposte indipendenti, sono state misurate la resa (percentuale), l'attività inibitoria della tirosinasi (percentuale), la quantità di composto (1) (ug/mg) e la quantità di composto (2) (ug/mg). L'attività inibitoria della tirosinasi dell'estratto è stata valutata ad una concentrazione di 50 µg/mL. Ogni risposta è espressa utilizzando la seguente equazione polinomiale di secondo ordine:

dove R denota la risposta; 1, 2 e 3 sono i coefficienti lineari; 12, 23 e 13 sono i coefficienti di interazione tra tre variabili; e 11, 22 e 33 sono i coefficienti quadratici.
Inoltre, è stata eseguita l'analisi di correlazione di Pearson per determinare l'esistenza di una relazione lineare tra ciascuna variabile e risposta. Il coefficiente di correlazione di Pearson ha una forte relazione lineare tra {{0}}.7 e 1.0, una chiara relazione lineare tra 0.3 e 0.7, una relazione lineare debole tra {{10}}.1 e 0.3 e una relazione lineare assente o trascurabile tra 0.0 e 0.1. La correlazione positiva e negativa è espressa a seconda che il coefficiente di correlazione di Pearson sia positivo o negativo.

3.9. Analisi quantitativa dei composti inibitori della tirosinasi 1 e 2

La quantità di ciascun composto 1 e 2 negli estratti ottenuti utilizzando le 15 condizioni sperimentali progettate è stata misurata utilizzando le curve di calibrazione (Tabella 2). Le curve di calibrazione per i composti 1 e 2 sono state determinate utilizzando l'area sotto la curva del cromatogramma UV (330 nm acquisiti rispettivamente a concentrazioni di 0,1–1000 µg/mL e 7,81–1000 µg/mL). La LC è stata eseguita utilizzando un sistema LC Waters 2695 (Waters, Santa Clara, CA, USA) con le stesse condizioni del sistema LC dettagliato in Materiali e metodi, spettrometria di massa LC-Q-TOF.

4. Conclusioni

L'ε-viniferina (1) e la vitamina B (2) delle radici di V. amurensis sono state caratterizzate come costituenti sbiancanti della pelle utilizzando LC-Q-TOF-MS accoppiato con un test inibitorio della tirosinasi. In particolare, la vitamina B (2) è stata identificata per la prima volta come composto inibitore della tirosinasi in questo studio e la ε-vinifera (1) e la vitamina B (2) hanno mostrato effetti inibitori della tirosinasi più elevati rispetto al controllo positivo, l'acido cogico. Le condizioni di ottimizzazione con il massimo effetto inibitorio della tirosinasi e la resa delle radici di V. amurensis sono state stabilite utilizzando il tempo di estrazione (100 min), la concentrazione di MeOH (66,38%) e il volume del liquido (140 mL). Il risultato ha mostrato una buona corrispondenza tra valori sperimentali e previsti. Di conseguenza, LC-Q-TOF-MS accoppiato con saggio biologico ha dimostrato il potenziale per trovare efficacemente nuovi costituenti attivi, così come componenti attivi noti, vitamina B (2), che possono essere proposti come un nuovo potenziale agente sbiancante naturale.

Materiali supplementari: I seguenti sono disponibili online, Figura S1: cromatogramma MS in modalità di ionizzazione negativa (A); Cromatogramma UV a 280 nm (B) di estratti di radici di V. amurensis, Figura S2: spettri 1H e 13C-NMR del composto 1 (300 e 75 MHz, CD3OD), Figura S3: spettri 1H e 13C-NMR del composto 2 (300 e 75 MHz, CD3OD), Figura S4: Grafico sigmoidale e IC50 del controllo positivo, composti 1 e 2, Figura S5: Superficie di risposta e grafici di contorno che mostrano l'effetto dei parametri di estrazione (X1: tempo di estrazione, min; X2: Concentrazione di MeOH, percentuale; X3: volume del solvente, mL). (A) resa; (B) attività inibitoria della tirosinasi; (C) composto 1; (D) composto 2; (E) somma dei composti 1 e 2, Tabella S1. Attività inibitoria della tirosinasi degli estratti delle radici di V. amurensis, Tabella S2: dati NMR 1H- e 13C dei composti 1 e 2 in CD3OD (δ in ppm), Tabella S3: variabili e livelli indipendenti per la metodologia della superficie di risposta, Tabella S4: regressione stimata per la resa, Tabella S5: Analisi della varianza per la resa, Tabella S6: Coefficiente di regressione stimato per l'attività inibitoria della tirosinasi, Tabella S7: Analisi della varianza per l'attività inibitoria della tirosinasi, Tabella S8: Coefficiente di regressione stimato per il composto 1, Tabella S9: Analisi del varianza per il composto 1, Tabella S10: coefficiente di regressione stimato per il composto 2, Tabella S11. Analisi della varianza per il composto 2, Tabella S12: Coefficiente di regressione stimato per la somma dei composti 1 e 2, Tabella S13: Analisi della varianza per la somma dei composti 1 e 2.
Contributi dell'autore: Concettualizzazione, KYL; metodologia, K.-EO, HS e KYL; software, K.-EO e HS; convalida, SA; analisi formale, K.-EO e HS; indagine, K.-EO, HS, MKL e KYL; cura dei dati, K.-EO, HS, BP e KYL; scrittura— preparazione della bozza originale, K.-EO e HS; scrittura: revisione e modifica, HS, MKL, BP e KYL; supervisione, MKL, BP e KYL Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.
Finanziamento: Questa ricerca è stata supportata dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea finanziata dal governo coreano (NRF-2017R1A2B4003403 e NRF-2019R1A6A1A03031807) e da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (HF20C0038).
Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: I dati presentati in questo studio sono disponibili nel materiale supplementare.
Conflitto di interessi:Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Disponibilità del campione: Non disponibile

Riferimenti

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