3. Discussione

Sebbene lo ZER mostri una varietà di funzioni biologiche, comprese attività antinfiammatorie, antitumorali e antimicrobiche, le sue proprietà anti-melanogeniche non sono state riportate [12]. Nel presente studio, abbiamo dimostrato per la prima volta che l'estratto di Zingiber officinal (ZO) e il suo principio attivo, ZER, hanno un forte effetto inibitorio sulla melanogenesi indotta dall'ormone stimolante i melanociti (-MSH).

Secondo studi pertinenti, la cistanche è un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale ècistanoside, che ha vari effetti comeantiossidante, antinfiammatorio, Epromozione della funzione immunitaria. Il meccanismo tra cistanche e sbiancamento della pelle risiede nell'effetto antiossidante dei glicosidi cistanche. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata datirosinasie la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influisceproduzione di melanina.Cistanche contienecistanoside, che è un antiossidante e può ridurre la generazione di radicali liberi nel corpo, quindiinibendo la produzione di melanina.

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La melanogenesi anormalmente aumentata causata dall'irradiazione ultravioletta (UV), dalle citochine infiammatorie e dalla segnalazione ormonale, è strettamente associata a disturbi della pigmentazione, come cloasma e lentiggini [4]. Dopo l'esposizione ai raggi UV, i cheratinociti secernono -MSH, che stimola la biogenesi della melanina nei melanociti epidermici [1]. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che l'estratto di radice metanolica di Zingiber officinal (ZO) e ZER sopprime fortemente l'accumulo di melanina indotto da -MSH. Il confronto degli effetti inibitori dell'arbutina, che è una nota sostanza chimica anti-melanogenica, e dello ZER sull'accumulo di melanina ha mostrato che lo ZER a una concentrazione di 10 µM mostra un effetto anti-melanogenico di circa il 40% più forte dell'arbutina nelle cellule melanogeniche di topo B16F10 trattate con -MSH .

Diversi studi biochimici hanno dimostrato che l'olio essenziale dei rizomi di Zingiber zerumbet contiene una grande quantità di ZER, pari a circa il 13–70 percento del contenuto di ZER della pianta. Tuttavia, piccole quantità di ZER sono presenti anche nello Zingiber officinal [20]. È interessante notare che rapporti precedenti hanno dimostrato che lo Zingiber zerumbet coltivato nel sud dell'India contiene dal 76,3 all'84,8 percento di ZER. Tuttavia, un'azienda di selvicoltura in India ha dimostrato che l'1,81% di contenuto di ZER è stato trovato nel rizoma, lo 0,16% nella radice e lo 0,09% nella foglia di Zingiber zerumbet [12]. Pertanto, questi sfondi suggeriscono che le differenze nel contenuto di ZER di Zingiber zerumbet potrebbero non essere correlate a variazioni geografiche o ecologiche, ma invece sono dovute a differenze nel chemotipo ZER [12]. In tal caso, perché ZO ha attività anti-melanogenica? Si potrebbe suggerire la possibilità che altri componenti attivi di ZO, che sono diversi da ZER, possano sopprimere la melanogenesi. In effetti, un precedente rapporto ha dimostrato che l'olio essenziale del rizoma officinale di Zingiber contiene numerosi componenti bioattivi, come -pinene, valencene e zingiberene [21]. Inoltre, sono stati osservati anche effetti anti-melanogenici di -pinene e valencene in cellule di melanoma di topo B16F10 [22,23]. Inoltre, è stato osservato che l'effetto inibitorio della melanogenesi della scuola [6], la scuola principale nei rizomi officinali di Zingiber, è dovuto all'accelerazione della degradazione del MITF mediata da ERK1/2- [24]. Questi rapporti precedenti supportano il nostro risultato secondo cui più tipi di componenti attivi di ZO e ZER hanno attività anti-melanogenica.

Il fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF) è un fattore chiave per la melanogenesi facilitando la trascrizione di geni, come la tirosinasi, la proteina 1 correlata alla tirosinasi (TYRP1) e la proteina 2 correlata alla tirosinasi (TYRP2), che sono necessarie per la biosintesi della melanina e trasporto [2,25]. Dopo l'irradiazione UV, -MSH derivato dai cheratinociti attiva il MITF e regola l'espressione dei suoi geni bersaglio tramite l'asse di segnalazione della proteina chinasi A (PKA)-cAMP (CREB) [25]. Inoltre, diversi fattori di trascrizione, come SOX10 e LEF1, attivano l'attività trascrizionale del MITF [26]. SOX10 (regione di determinazione del sesso Y-box 10) può legarsi al promotore MITF tra −264 e −266 e aumentare la trascrizione MITF [27]. LEF1 (linfoide enhancer-binding factor 1) collabora anche trascrizionalmente con MITF come attivatore non legante il DNA per promuovere l'espressione del gene MITF sulla segnalazione Wnt (tipo senza ali) [28]. Le modifiche post-traduzionali del MITF, come la fosforilazione e l'acetilazione, possono regolare la sua stabilità e attività proteica [26]. In particolare, la fosforilazione del MITF a Ser73, dove è presente la sequenza PEST che promuove la degradazione, porta alla degradazione del MITF dipendente dal proteasoma in risposta all'irradiazione UV [17]. La degradazione del MITF dipendente dal proteasoma è anche causata dalla fosforilazione del MITF a Ser409 [18]. La fosforilazione sia di Ser73 che di Ser409 che promuove la degradazione del MITF dipende dall'attivazione della via ERK1/2 [17,18]. Nel presente studio, abbiamo scoperto che ZER sopprime l'espressione di MITF e dei suoi geni bersaglio, come tirosinasi, TYRP1 e TYRP2 su stimolazione -MSH, indipendentemente dalla via di segnalazione PKA-CREB (Figura 6). In effetti, i nostri risultati hanno mostrato che ZER, ma non arbutina e acido cogico, è sufficiente per ridurre i livelli di mRNA e di espressione proteica della tirosinasi indotta da -MSH (Figura 2). Questi risultati dimostrano che ZER sopprime la melanogenesi attraverso la down-regulation della trascrizione mediata da MITF dei geni melanogenici e la loro espressione proteica. La degradazione del MITF mediata dall'ubiquitina è in parte regolata dall'attivazione sostenuta delle chinasi extracellulari regolate dal segnale (ERK1/2) [6,7]. I nostri risultati hanno mostrato che l'estratto officinale di Zingiber (ZO) e ZER aumentano la fosforilazione di ERK1/2 e diminuiscono l'accumulo di melanina nelle cellule B16F10. Inoltre, l'inibitore selettivo della protein chinasi attivata dal mitogeno (MAPK), U0126, ha ripristinato efficacemente il contenuto di melanina, diminuito da ZER, suggerendo che la segnalazione ERK1/2 è associata all'effetto anti-melanogenico dell'estratto di Zingiber officinal (ZO) e zerumbone.

In precedenza è stata osservata una diminuzione della fosforilazione di ERK1/2 da parte di ZER nel carcinoma epatocellulare e nelle cellule macrofagiche U937 [29]. Inoltre, è stato dimostrato che l'estratto etanolico dei rizomi di Zingiber zerumbet sopprime la fosforilazione di ERK1/2 nelle retine diabetiche [30]. Al contrario, in questo studio, abbiamo scoperto che ZER aumenta la fosforilazione di ERK1/2, ma non MEK, in modo dose-dipendente (Figura 3A). Coerentemente con il nostro risultato, un rapporto precedente ha dimostrato che 6-gingerolo e 6-scuola, che sono i principali componenti attivi dello zenzero, attenuano la fosforilazione di ERK1/2 indotta dal fattore di crescita nervoso (NGF) nell'ippocampo di topo [31]. Inoltre, altre prove sperimentali hanno dimostrato che ZER e 6-shogaol accelerano la fosforilazione di ERK1/2 rispettivamente nei monociti THP-1 e nelle cellule di melanoma B16F10 di topo [24,32]. Inoltre, nelle cellule di melanoma murino B16BL6 che sono state trattate con isosakuranetin, un flavonoide 40 -O-metilato, sono state osservate una ridotta fosforilazione del MITF e una maggiore stabilità del MITF attraverso la soppressione di ERK1/2 che successivamente stimola la melanogenesi [33 ]. Pertanto, suggeriamo fortemente che l'attivazione di ERK1 / 2 indotta dall'estratto di ZER e ZO potrebbe essere la ragione dell'aumentata fosforilazione del MITF e della sua destabilizzazione, che porta alla soppressione della melanogenesi. Tuttavia, è necessaria un'indagine approfondita per affrontare queste controversie sugli estratti di Zingiber e sui loro componenti che fosforilano ERK1/2 in modo diverso in più tipi di cellule o tessuti. Poiché MEK è una delle principali chinasi a monte [34] che fosforila ERK1/2 sulla segnalazione della crescita oncogenica, si riteneva che ZER alterasse anche l'attività della chinasi a monte ERK1/2. Tuttavia, i nostri risultati mostrano che ZER non influenza la fosforilazione di MEK. Pertanto, ci sono due ipotesi per spiegare il meccanismo molecolare dell'azione ZER. (1) ZER interagisce direttamente e inibisce l'attività della chinasi di MEK tramite un meccanismo inibitorio competitivo o allosterico e (2) Esistono molecole di segnalazione sconosciute che direttamente o indirettamente vengono influenzate da ZER e agiscono come attivatori di ERK1/2. È interessante notare che precedenti rapporti hanno dimostrato che lo ZER causa stress ossidativo attraverso l'esaurimento del glutatione intracellulare (GSH) e l'induzione di specie reattive dell'ossigeno intracellulare (ROS) nelle cellule tumorali del colon-retto e del pancreas, rispettivamente [35,36]. Inoltre, è stato anche riportato che l'aumento dei ROS intracellulari modula la fosforilazione di ERK1/2 attraverso la soppressione della fosfatasi 3 dual-specifica (DUSP3) mediante l'ossidazione di Cys-124 [37]. Una possibile ipotesi potrebbe essere che l'aumento dello stress ossidativo e la soppressione di DUSP3 da parte di ZER potrebbero essere coinvolti nella fosforilazione di ERK1/2. Inoltre, Chen et al. hanno proposto che ZER attenui l'accumulo intracellulare di ossido nitrico (NO) sopprimendo le vie di segnalazione NF-κB e iNOS, che prevengono la cornea del topo dalla fotocheratite indotta da UVB [38]. L'ossido nitrico (NO) è un fattore stimolante la melanogenesi che viene rilasciato dai melanociti e dai cheratinociti dopo l'irradiazione UV e le citochine proinfiammatorie [39,40]. Questa letteratura suggerisce la possibilità che ZER attenui la melanogenesi indotta da -MSH mantenendo l'NO intracellulare. Pertanto, uno studio esteso per dimostrare il meccanismo molecolare attraverso il quale ZER attiva la via di segnalazione ERK1/2 può fornire una base scientifica per lo sviluppo di cosmetici sbiancanti per la pelle.

Lo ZER ha molteplici funzioni biologiche, come antinfiammatorio [41], antimicrobico [42], antiossidante [43] e antiallergico [44]. L'esposizione prolungata all'irradiazione ultravioletta A (UVA) provoca disturbi dermatologici correlati al fotoinvecchiamento, come rughe e cancro della pelle a causa dell'eccessivo accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) [2]. Un precedente rapporto ha dimostrato che ZER esercita la citoprotezione contro il danno cellulare indotto dall'irradiazione UVA nei cheratinociti della pelle aumentando l'espressione genica degli antiossidanti mediata dal fattore nucleare (derivato dall'eritroide 2)-like 2 (Nrf2) [1]. I nostri dati suggeriscono che lo ZER, in quanto componente attivo dell'estratto di ZO, può essere utilizzato per trattare disturbi dermatologici, come il cancro della pelle, le rughe e l'iperpigmentazione, che sono causati dall'irradiazione UV. Sebbene qui abbiamo mostrato l'effetto anti-melanogenico dell'estratto di ZER e ZO nel topo B16F10 e nelle cellule di melanoma umano G361, le loro attività anti-melanogenesi devono essere ulteriormente valutate nei melanociti primari umani prima di essere considerate nei cosmetici sbiancanti per la pelle.

4. Materiali e Metodi

4.1. Reagenti e Anticorpi

Anticorpi contro MITF (#12590), p-AKTS473 (#4060), p-CREB (#9398), p-ERK1/2 (#4370), ERK1/2 (#9102), p-MEK (#9154), MEK (#9122) e l'inibitore ERK1/2 U0126 sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-tirosinasi (sc-7833) e -tubulina (sc-9104) sono stati ottenuti da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Anti-TYRP2 (DCT, ab74073) è stato acquistato da Abcam (Cambridge, Regno Unito). Zerumbone (Z3902), arbutina (A4256), acido cogico (K3125), -MSH (M4135) e L-DOPA (333786) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Prima del trattamento è stata preparata una soluzione madre di ormone stimolante i melanociti in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). SCF umano ricombinante è stato ottenuto da sistemi di ricerca e sviluppo (Minneapolis, MN, USA) e la sua soluzione madre (10 µM) è stata preparata in PBS. Le soluzioni madre di zerumbone (20 mM), arbutina (1 M) e acido cogico (0,2 M) sono state preparate in dimetilsolfossido (DMSO). L'estratto officinale liofilizzato di Zingiber (035-061), isolato con il 99% di metanolo, è stato ottenuto dalla Korea Plant Extract Bank (KPEB) (Daejeon, Corea) e dal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) (Daejeon, Corea). Una soluzione madre di estratto officinale di Zingiber è stata preparata in DMSO prima del trattamento.

4.2. Saggio di coltura cellulare e vitalità cellulare

4.3. Immunoblotting e Immunoprecipitazione

L'immunoprecipitazione è stata eseguita per rilevare se il MITF endogeno è fosforilato a Ser73. 1 mg di lisato cellulare è stato incubato con 1 µg di anticorpo anti-fosfo-MITF (pSer73; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) per 16 ore a 4 °C, seguito da incubazione con 20 µL di proteina A/ Perle di G-agarosio (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) per 3 ore a 4 ◦C. Le proteine ​​​​precipitate sono state eluite nel tampone del campione SDS e quindi la proteina MITF fosforilata (Ser73) è stata misurata mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo anti-p-MITF (pSer73). È stato eseguito l'immunoblotting, come precedentemente descritto [4]. In breve, i campioni di proteine ​​totali sono stati preparati utilizzando un tampone di lisi, contenente l'1% di NP-40 (Nonidet P-40), 150 mM di NaCl, 50 mM di Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM di NaF e un cocktail di inibitori della proteasi. L'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) è stata utilizzata per separare le proteine ​​in ciascun campione in base al loro peso molecolare. Le proteine ​​​​separate sono state quindi trasferite su una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) (Millipore, Burlington, MA, USA). Le membrane con le proteine ​​trasferite sono state quindi incubate con anticorpi primari (1:1000) e anticorpi secondari (1:10.000) a 4 ◦C o temperatura ambiente. Per visualizzare le espressioni proteiche è stato utilizzato un kit ECL Prime chemiluminescente (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

4.4. Misurazione del contenuto di melanina intracellulare ed extracellulare 

Il contenuto di melanina intracellulare ed extracellulare è stato misurato e analizzato, come precedentemente descritto [3]. Le cellule B16F10 melanogeniche di topo sono state coltivate con DMEM privo di rosso fenolo. Le cellule sono state quindi pretrattate con -MSH (0,1 mM) per 1 ora per promuovere la stimolazione melanogenica e incubate con zerumbone per tre giorni. Dopo l'incubazione, il terreno di coltura è stato trasferito in provette fresche e le cellule in coltura sono state raccolte e sciolte in 1 N NaOH contenente il 10% di DMSO a 80 °C per 1 ora. Il contenuto di melanina del terreno di coltura e degli estratti cellulari è stato misurato a 475 nm (OD475) utilizzando un lettore di assorbanza. Il contenuto di melanina è stato quindi normalizzato alla concentrazione di proteine ​​cellulari.

4.5. RT-PCR quantitativa

La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita come descritto in precedenza [4]. In breve, per la sintesi del cDNA sono stati utilizzati un kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) e RNA totale (2 μg). SYBR Green PCR Master MIX (Dynebio, Seongnam, Corea) è stato utilizzato per la PCR quantitativa. La sequenza dei primer PCR 50 e 30 era la seguente: TCAAGTTTCCAGAGACGGGT e CATCATCAGCCTGGAATCAA per MITF; ATAGGTGCATTGGCTTCTGG e TCTTCACCATGCTTTTGTGG per la tirosinasi; CTCATCAAAGATGGCGTCTG e CTTCCTGAATGGGACCAATG per TYRP1.

4.6. Saggio di attività della tirosinasi cellulare

Le cellule B16F10 melanogeniche di topo sono state incubate con 0,1 mM di -MSH in assenza o presenza di zerumbone, arbutina, acido cogico ed estratto di Zingiber officinal (ZO), come indicato. Le cellule in coltura sono state quindi lavate e lisate utilizzando PBS freddo contenente l'1% di Triton X-100 e l'attività enzimatica della tirosinasi è stata misurata utilizzando la metodologia precedentemente descritta [4].

4.7. Analisi statistica

5. Conclusioni

I principali risultati di questo studio sono che l'estratto di Zingiber officinal (ZO) e il suo ingrediente attivo, zerumbone (ZER), (i) attenua l'accumulo di melanina dopo la stimolazione -MSH; e, (ii) diminuire l'espressione del fattore di trascrizione associato alla melanogenesi, MITF e dei suoi geni bersaglio attivando ERK1/2 indipendentemente dalla via di segnalazione PKA-CREB (Figura 6). Questi risultati, quindi, suggeriscono che l'estratto di Zingiber officinal (ZO) contenesse ZER, come ingrediente attivo, che sarebbe utile nello sviluppo sia di cosmetici dermatologici che di prodotti sbiancanti per la pelle.

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