I recettori chimerici dell'antigene espandono il repertorio delle macromolecole antigeniche per l'immunità cellulare

Astratto:

Le terapie con cellule T hanno apportato miglioramenti significativi nel trattamento del cancro nell'ultimo decennio. Una terapia cellulare che utilizza cellule T comporta l'uso di un recettore chimerico di riconoscimento dell'antigene MHC-indipendente, tipicamente indicato come recettore chimerico dell'antigene (CAR). Le molecole CAR, sebbene per lo più limitate al riconoscimento di antigeni sulla superficie delle cellule tumorali, possono anche essere utilizzate per sfruttare il diverso repertorio di macromolecole bersagliabili dagli anticorpi, che sono incorporate nel disegno CAR. Appoggiarsi a questa espansione delle macromolecole bersaglio migliorerà la diversità degli antigeni che le cellule T possono colpire e potrebbe migliorare la specificità del tumore della terapia con cellule T CAR. Questa recensione esplora i tipi di macromolecole bersagliabili dalle cellule T attraverso recettori specifici per l'antigene endogeni e sintetici.

La terapia cellulare CART è un metodo di trattamento del cancro. Il suo principio è estrarre le cellule T del paziente, trasformarle in cellule CAR-T dopo la modificazione genetica e quindi iniettarle nuovamente nel corpo del paziente per attaccare le cellule tumorali. Le cellule CAR-T hanno un'elevata specificità e una forte citotossicità e possono riconoscere e attaccare le cellule tumorali, ma il loro effetto terapeutico è influenzato dall'immunità.

Nella terapia cellulare CART, le cellule T sono cellule che attaccano le cellule tumorali, quindi l'immunità ha un impatto importante sul suo effetto terapeutico. L'immunità può influenzare la capacità del paziente di sintetizzare le cellule CAR-T, il tempo di sopravvivenza delle cellule CAR-T e la capacità di attaccare le cellule tumorali bersaglio, influenzando così direttamente l'efficacia della terapia cellulare CART. Se l'immunità del paziente è molto bassa, può indebolire l'effetto delle cellule CAR-T e persino far sì che le cellule CAR-T perdano la loro tossicità nei confronti delle cellule tumorali.

Pertanto, nel processo di terapia cellulare CART, è necessario prestare attenzione allo stato immunitario dei pazienti e migliorare la capacità di attacco e il tempo di sopravvivenza delle cellule CAR-T migliorando l'immunità dei pazienti per migliorare l'effetto terapeutico. Allo stesso tempo, è anche necessario prestare attenzione a possibili reazioni immunitarie ed eventi avversi durante il trattamento e affrontarli in tempo per garantire la sicurezza e l'efficacia del trattamento. Sembra che dobbiamo concentrarci sul miglioramento dell'immunità. Cistanche ha un effetto significativo sul miglioramento dell'immunità perché i polisaccaridi nella carne possono regolare la risposta immunitaria del sistema immunitario umano, migliorare la capacità di stress delle cellule immunitarie e migliorare l'effetto di sterilizzazione delle cellule immunitarie.

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Parole chiave:

CAR T-cellule; immunità; cancro.

1. Introduzione

I linfociti T (o cellule T) sono i principali effettori del sistema immunitario umano, responsabili di effetti che vanno dall'attivazione delle cellule B per la produzione di anticorpi all'attività citolitica diretta. La principale funzione delle cellule T si basa sulle interazioni tra il recettore delle cellule T (TCR) e un peptide affine all'interno di una molecola del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) su cellule infette/maligne o cellule professionali che presentano l'antigene [1].

Recentemente, le cellule T sono state in prima linea nei nuovi trattamenti contro il cancro, in particolare l'avvento delle immunoterapie cellulari ingegnerizzate, inclusa la terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) [2]. Un vantaggio delle cellule CAR T è la capacità di riconoscere gli antigeni espressi sulla superficie cellulare senza la necessità di presentazione dell'antigene da parte delle molecole MHC, riducendo la necessità di considerare i limiti dell'istocompatibilità e la variabilità della presentazione del peptide-MHC. Il targeting basato su CAR è generalmente diretto attraverso le caratteristiche di riconoscimento dell'antigene di un dominio di frammento variabile a catena singola (scFv) presentato sulla superficie delle cellule T CAR. Questo scFv consente alle cellule CAR-T di legarsi e mirare a qualsiasi macromolecola della superficie cellulare definita dal legame dell'anticorpo.

Per completare questo recettore, l'scFv è fuso molecolarmente a un dominio transmembrana che collega il dominio extracellulare che riconosce l'antigene alla segnalazione intracellulare e all'attivazione da parte del dominio di attivazione CD3ζ derivato dal complesso TCR. La prima generazione di cellule CAR T utilizzava solo il dominio CD3ζ. Tuttavia, le future generazioni di cellule CAR T si basano sulla segnalazione intercellulare utilizzando domini costimolatori, come CD28 o 4-1BB, per potenziare la stimolazione delle cellule CAR T. Le cellule CAR-T di seconda generazione incorporano un singolo dominio costimolatorio nella molecola CAR, mentre le cellule CAR-T di terza generazione utilizzano più domini costimolatori in tandem [3]. I recenti progressi tecnologici hanno portato alla generazione di cellule CAR-T di quarta generazione, soprannominate TRUCK (cellule T reindirizzate per l'uccisione avviata da citochine senza restrizioni antigene) [4].

Le cellule CAR-T di quarta generazione sono in grado di secernere costitutivamente o inducibilmente fattori pro-infiammatori, come le citochine, che possono promuovere la persistenza o la funzione. Le molecole CAR e ulteriori molecole effettrici sono state convenzionalmente introdotte nelle cellule T attraverso la trasduzione virale utilizzando lentivirus o retrovirus, la trasposizione utilizzando la Bella Addormentata o le trasposasi PiggyBac o la trasfezione transitoria attraverso la consegna dell'mRNA. Tuttavia, i recenti progressi che impiegano la ricombinazione diretta dall'omologia con CRISPR [5-7] e altri strumenti di modifica genetica consentono l'integrazione specifica del sito di nuovo materiale genetico [8]. Questo progresso ridurrà la variabilità da lotto a lotto dei prodotti fabbricati con cellule CAR T e potrebbe chiarire loci specifici o porti sicuri per l'integrazione che migliorano l'efficacia clinica.

Le cellule CAR-T sono in fase di sviluppo per colpire molte forme di cancro, con i migliori risultati clinici dimostrati finora contro i disturbi ematologici, come la leucemia a cellule B e il linfoma attraverso il targeting della molecola delle cellule B CD19 e il mieloma multiplo prendendo di mira l'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA). La Figura 1 mostra tre terapie con cellule CAR T in fase clinica e i loro antigeni bersaglio.

Questa recensione si concentra sui tipi di macromolecole bersagliabili dalle cellule T endogene e su come le cellule T CAR espandono questo repertorio di antigeni dell'immunità cellulare.

2. Peptidi

Le cellule T riconoscono brevi catene di amminoacidi, chiamate peptidi, attraverso l'impegno del TCR con complessi affini peptide-MHC. Il TCR è composto, in parte, da un eterodimero di catene - e - variabili e può legare i residui trovati all'interno delle molecole MHC così come il peptide. Questa interazione limita il riconoscimento antigenico da parte delle cellule T quasi esclusivamente agli aminoacidi presenti nel complesso MHC [9]. Esistono due tipi di MHC: classe I e classe II. Il riconoscimento TCR dei peptidi trovati all'interno delle molecole MHC di classe I richiede il co-recettore CD8 e induce l'attivazione delle cellule T CD8 plus, influenzando le risposte delle cellule T citotossiche. Le molecole MHC di classe II sono espresse dalle cellule presentanti l'antigene (APC) e richiedono il co-recettore CD4 per l'impegno del TCR, e queste interazioni portano tipicamente all'attivazione delle risposte delle cellule T helper.

Oltre agli eterodimeri TCR, il complesso TCR include anche le subunità , δ, ε e ζ di CD3, che inducono la trasduzione del segnale in seguito all'impegno di TCR e peptide affine-MHC [10]. Un TCR viene assemblato attraverso un ampio insieme di segmenti genici in un processo noto come ricombinazione V (variabile) D (diversità) J (unione) [11]. Il processo di ricombinazione comporta il taglio del DNA a doppio filamento, l'escissione del segmento genico e la ligazione dei restanti segmenti genici nelle sequenze codificanti dei TCR funzionanti. Questo processo può produrre più di 1015 possibili TCR con riconoscimento dell'antigene altamente variabile [12], che consente alle cellule T di riconoscere un repertorio immensamente ampio e diversificato di peptide-MHC.

Le molecole MHC di classe I sono composte da una catena pesante e da una 2-microglobulina. Tre geni polimorfici nell'uomo codificano le catene pesanti MHC di classe I di HLA-A, HLA-B e HLA-C, che porta a più di 200 varianti di HLA-A, più di 500 varianti di HLA-B e più di 100 varianti di Geni HLA-C [13]. Questi polimorfismi della catena pesante MHC sono responsabili della generazione di solchi di legame peptidico divergenti e raccolte uniche di peptidi presentati da MHC, il che complica il trasferimento adottivo di cellule T o specifici geni TCR da individuo a individuo (come trattamento universale del cancro, ad esempio ) a causa di istocompatibilità incompleta [14]. Altri fattori correlati all'MHC che possono limitare il riconoscimento da parte delle cellule T dei peptidi antigenici sono la sottoregolazione dell'MHC di classe I, la compromissione del meccanismo di presentazione dell'antigene e la presentazione rara o assente dell'MHC di classe I dei peptidi mutati. Nel carcinoma papillare della tiroide, ad esempio, è stato dimostrato che la sottoregolazione dell'MHC di classe I influenza una diminuzione del numero di linfociti infiltranti il ​​tumore (TIL) trovati nel tumore ed è associata a esiti clinici peggiori [15].

Una delle principali limitazioni del riconoscimento antigenico da parte delle molecole CAR è il requisito della superficie cellulare o della presentazione extracellulare. Pertanto, il numero di antigeni che possono essere presi di mira dalle CAR è ridotto di molti ordini di grandezza rispetto al numero di antigeni che le cellule T possono riconoscere attraverso l'impegno del TCR con le molecole peptide-MHC. Tuttavia, la generazione di "anticorpi simili al TCR", una classe di anticorpi in grado di riconoscere gli antigeni di istocompatibilità minori (mHAgs) con un'affinità 103-105 volte superiore al legame TCR naturale [16], può dotare le cellule CAR T della capacità riconoscere specifici antigeni legati all'MHC, compresi i bersagli intracellulari. Uno studio di Walseng et al. ha sviluppato un "TCR-CAR" contro frammenti peptidici di MART-1 (DMF5 scFv) e TGF R2 (Radium-1) [17]. Queste molecole TCR-CAR hanno reindirizzato le cellule T e le cellule natural killer, rappresentate dalla linea cellulare NK-92, verso l'epitopo bersaglio dei due geni. Le cellule CAR T e le cellule NK sono state in grado di eliminare le cellule che presentavano i peptidi MART-1 o TGFbR2 all'interno dei loro complessi MHC. I TCR-CAR sono stati anche generati per mirare selettivamente a un peptide composto dagli aminoacidi 235-243 del tumore di Wilm-1 (WT1), un antigene trovato sovraespresso nella leucemia, nel linfoma e nei tumori solidi quando presentato dall'MHC fenditura di HLA-A*2402 [18].

Forse la molecola CAR di maggior successo è la CAR anti-CD19, specialmente nel contesto delle cellule T ingegnerizzate con CAR (CART19). Il CD19 è una molecola di cellule B con restrizione del lignaggio che è espressa su cellule B sia sane che maligne. Già nel 2011, la ricerca ha dimostrato il successo di CART19 nei pazienti con tumori a cellule B. In uno studio clinico pilota, tre pazienti con leucemia linfocitica cronica resistente alla chemioterapia sono stati trattati con cellule CART19; due pazienti hanno raggiunto la remissione completa e un terzo paziente ha raggiunto la remissione parziale [19]. Contrariamente al riconoscimento del peptide-MHC, le cellule CART19 si legano e sono attivate dal CD19 espresso sulla superficie delle cellule B, indipendentemente dal riconoscimento dell'MHC, dall'impegno del corecettore e dal meccanismo di presentazione dell'antigene. CART19 ha dimostrato un successo notevole e riproducibile negli studi clinici per i pazienti con leucemia e linfoma a cellule B e quattro terapie approvate dalla FDA mirate alle cellule CAR T mirate al CD sono state finora approvate: (in ordine di prima approvazione) tisagenlecleucel, axicabtagene ciloleucel, brexucabtagene autoleucel e lisocabtagene maraleucel. Tutte e quattro le terapie CAR mirate al CD19- approvate utilizzano un scFv dall'anticorpo anti-CD19 FMC63. La violenza di Idecabtagene è un'altra terapia con cellule T CAR mirata al BCMA per il mieloma multiplo recidivato/refrattario che è stata anche approvata dalla FDA nel 2021.

Un'area in erba dello sviluppo delle cellule T CAR sta reindirizzando la specificità delle cellule T verso gli antigeni nell'ambiente extracellulare, in contrasto con il targeting degli antigeni di superficie cellulare. Le cellule CAR-T che bersagliano il TGF-solubile, una citochina immunosoppressiva espressa da molti tumori solidi, si sono espanse molte volte in risposta alla stimolazione del TGF-, mentre le cellule CAR-T non specifiche hanno mostrato una persistenza molto bassa a causa degli effetti inibitori della citochina soppressiva [20]. ]. Sebbene le cellule T anti-TGF-CAR non fossero citolitiche, questo approccio ha dimostrato che le CAR possono trasformare i fattori immunosoppressivi prodotti dai tumori in segnali immunostimolatori. Mentre questa terapia converte un fattore immunosoppressivo in uno stimolatore immunitario, potrebbero esserci alcune preoccupazioni circa i cambiamenti dello sviluppo nelle cellule T, poiché il TGF- promuove i cambiamenti dello sviluppo nella differenziazione delle cellule CD8 e T [21]. Sono necessari ulteriori studi e prove per determinare se ciò avrà effetti negativi sul sistema immunitario.

Un'altra classe unica di bersagli per le cellule CAR-T può esistere all'interno dei componenti strutturali della matrice extracellulare (ECM). Wagner et al. ha generato cellule CAR T che possono colpire il dominio extra B (EDB) della fibronectina, una variante di giunzione della fibronectina prodotta da molti tipi di tumori solidi [22]. Il targeting dell'ECM di più tumori solidi umani con cellule CAR T anti-fibronectina ha portato al controllo della crescita tumorale e all'aumento della sopravvivenza in diversi modelli di xenotrapianto derivati ​​dalla linea cellulare. Inoltre, il dominio EDB della fibronectina murina è stato preso di mira dalle cellule T CAR costruite con un anticorpo a dominio singolo (VHH) specifico per EIIB [23]. In questo modello, la crescita del melanoma B16 è stata rallentata rispetto alle cellule CAR T di controllo, che hanno migliorato l'infiltrazione delle cellule T e probabilmente hanno deviato una TME immunosoppressiva verso una TME infiammatoria.

3. Lipidi

Come descritto sopra, le molecole MHC di classe I e di classe II presentano peptidi sulla superficie delle cellule per il riconoscimento da parte dei TCR delle cellule T. Una terza molecola, CD1, è usata in modo simile dalle cellule. Tuttavia, mentre i complessi MHC presentano peptidi, CD1 presenta lipidi, inclusi, ma non limitati a, glicolipidi [24-26]. Questa differenza è dovuta all'idrofobicità del solco di legame del CD1, che consente la presentazione di elementi idrofili di antigeni alla proteina CD1 [27]. Gli esseri umani hanno cinque diverse isoforme CD1 che presentano i lipidi in modi diversi. Queste isoforme sono CD1a, CD1b, CD1c, CD1d e CD1e. I complessi CD1 presentano antigeni alle cellule NKT, che sono limitate al dominio CD1 e non sono in grado di riconoscere il peptide-MHC [28].

I complessi CD1 sono simili nella struttura ai complessi MHC con un dominio extracellulare a catena pesante che si lega a una 2microgobulina. Tuttavia, quando le proteine ​​​​CD1d del topo sono state cristallizzate, hanno mostrato un solco di legame più ampio creato con residui non polari in cui i lipidi potevano legarsi [27]. Un'altra grande differenza tra complessi MHC e complessi CD1 è la vasta gamma di molecole presentate. I complessi MHC, come affermato sopra, sono altamente polimorfici, il che consente di variare le strutture di presentazione limitata. I complessi CD1, tuttavia, possono legare un'ampia gamma di diverse molecole lipidiche perché questo processo non richiede il perfetto posizionamento delle molecole lipidiche, consentendo così ai complessi CD1 di legare più molecole con meno restrizioni [29].

I linfociti T CD1-ristretti contengono una combinazione di e δ TCR. Variano dalle cellule T ristrette MHC utilizzando meno geni V che danno origine a catene TCR riorganizzate insieme a disposizioni TCR invarianti [30]. Questo sottoinsieme di cellule è comunemente indicato come cellule T natural killer (cellule NKT) a causa dell'espressione unica di CD161, un marcatore che si trova tipicamente solo sulle cellule NK [31]. Le cellule NKT sono funzionalmente molto diverse a seconda del loro stadio di vita e sono tipicamente definite dal fatto che la cellula esprima o meno CD4, con cellule CD4 più NKT che mostrano una differenziazione inferiore rispetto alle cellule CD4-NKT [32]. La maturazione di queste cellule da CD4 plus a CD4− è contrassegnata da un aumento della secrezione di citochine TH1 rispetto alle citochine TH2. A causa di questo cambiamento, le cellule CD4- sono più citolitiche delle loro controparti CD4 plus.

Nel cancro, le cellule NKT1-ristrette al CD non hanno sempre un effetto positivo. Mentre il trattamento esogeno e l'attivazione delle cellule NKT CD1-ristrette da parte di -galactosylceramide ( -GalCer) hanno dimostrato che le cellule T CD1-ristrette possono avere un effetto antitumorale [33], queste cellule spesso non mostrano naturalmente attività citotossica contro i tumori solidi senza attivazione esogena. È noto che la produzione NKT di IL-13 agisce come immunosoppressore delle cellule T CD8 plus, che possono compromettere l'attività immunitaria antitumorale [34]. Tuttavia, altri studi hanno dimostrato che la produzione di IFN da parte delle cellule NKT circolanti è importante nella risposta antitumorale innata [35] e una maggiore frequenza di cellule NKT nel sangue o nei tumori può portare a esiti clinici favorevoli nei pazienti oncologici [36]. La natura apparentemente contraddittoria dell'attività delle cellule NKT potrebbe essere dovuta alle suddette differenze nei fenotipi delle cellule NKT.

Il campo delle cellule T CAR che prendono di mira i lipidi si è concentrato principalmente sul ganglioside GD2, che è altamente sovraespresso nel neuroblastoma e in altri tumori solidi [37]. Il vantaggio del GD2-targeting sulle CAR T-cellule è la loro capacità di attraversare la barriera emato-encefalica, che è un miglioramento rispetto ad altre forme di trattamento, come gli anticorpi monoclonali per GD2. Le prime cellule CAR-T GD2-specifiche sono state prodotte nel 2009 per colpire il melanoma cutaneo [38]. Un scFv derivato dall'anticorpo 14g2a mirato alla GD2-è stato incluso in una molecola CAR costimolata dai domini di segnalazione intracellulare CD28 e OX40. Le cellule CAR-T specifiche per GD2- sono state in grado di uccidere una linea di cellule staminali mesenchimali (MSC) GD2 plus senza l'eliminazione di una linea MSC GD2- isogenica, dimostrando specificità antigenica. Nel neuroblastoma, le cellule CAR T anti-GD2 hanno dimostrato di controllare efficacemente la crescita del tumore negli studi sui topi [39,40] e, più recentemente, negli studi clinici. Il primo studio clinico sui linfociti CAR T GD2-specifici ha valutato la sicurezza di un CAR di prima generazione, che contiene il dominio intracellulare di CD3ζ senza un dominio costimolatorio, in contrasto con i progetti CAR discussi sopra, in Epstein- Cellule T specifiche del virus di Barr [41]. La persistenza delle cellule CAR-T GD2-specifiche è stata osservata per più di sei settimane ed è stata osservata una correlazione tra la persistenza delle cellule CAR-T e la risposta clinica, comprese due remissioni complete del neuroblastoma. Oltre alle cellule T CAR GD2- specifiche, le CAR sono state sviluppate anche per colpire i gangliosidi O-acetil-GD2, Neu5Gc-GM3 e GD3, nonché i globosidi GloboH e SSEA4 [42].

Un altro approccio al targeting della struttura lipidica è il targeting del complesso CD1 stesso rispetto a un lipide specifico all'interno della molecola [43]. Questo lavoro viene svolto nella leucemia linfoblastica acuta a cellule T, un disturbo difficile da colpire con le cellule T CAR a causa dei marcatori condivisi sia sulle cellule CAR effettrici sia sulle cellule T maligne. La T-ALL corticale (coT-ALL) è caratterizzata dall'espressione superficiale di CD1a, un'isoforma CD1 presente solo nei tessuti normali durante lo sviluppo dei timociti corticali e nelle cellule di Langerhans. Queste cellule CAR T sono state in grado di legare in modo specifico coT-ALL senza alcun legame di cellule T non maligne. Le cellule CAR T CD1a sono state in grado di eliminare le linee cellulari T-ALL sia in vitro che in vivo negli studi preclinici. I timociti fetali sono stati conservati durante una cocoltura con le cellule T CAR CD1a, suggerendo che questa terapia CAR T potrebbe non rappresentare un rischio di ablazione timica.

4. Glicani

I glicani sono mono e polisaccaridi prodotti da complessi percorsi biosintetici che modificano post-traduzionalmente proteine, lipidi e acidi nucleici con il coinvolgimento di zuccheri nucleotidici come donatori, mentre mediano anche funzioni biologiche, come il ripiegamento proteico, lo stoccaggio di energia e il metabolismo, tra altre funzioni. Una classe di glicani, nota come polisaccaridi zwitterionici (ZPS), può attivare il sistema immunitario attraverso una presentazione di peptidi legati da molecole MHC di classe II [44]. Queste molecole possono essere riconosciute dalle cellule T CD4 plus, portando alla formazione di una risposta immunitaria della memoria. Gli ZPS hanno centri di carica positivi e negativi alternati all'interno delle unità ripetitive [45]. Queste strutture si formano spesso durante le infezioni batteriche, come la capsula di B. fragilis e la capsula polisaccaridica di S. pneumoniae di tipo 1. Oltre a questi, il ricercatore shave ha studiato uno ZPS noto come polisaccaride A (PSA), espresso da un batterio gram-negativo Bacteroides fragilis [46]. Questo batterio è simbiotico con il sistema immunitario e gli studi hanno dimostrato che i topi privi di germi che esprimono PSA su B. fragilis erano in grado di mantenere una buona quantità di cellule CD4 più T nella milza rispetto ai topi WT [47]. Uno studio di Cobb et al. [19] ha dimostrato che mentre tutti i tipi di polisaccaridi possono essere trasferiti nelle APC, come le cellule dendritiche, solo quelli che sono zwitterionici possono colocalizzare con MHC II sulla superficie delle APC.

Nonostante il consenso sul fatto che la maggior parte delle interazioni TCR e peptide-MHC siano indipendenti dai glicani, glicopeptidi specifici sono stati inclusi come bersagli dei vaccini. MUC1 è una mucina legata alla membrana che si trova su molti diversi tipi di tumori solidi e una glicoforma O troncata di MUC1, chiamata Tn-MUC1, è stata un bersaglio in diverse strategie di immunoterapia [48], incluso in un vaccino utilizzato nella MUC umana 1-che esprimono topi transgenici [49] così come nei macachi rhesus e nell'uomo [50]. Nei topi, è stato scoperto che Tn-MUC1 attiva le cellule T CD4 più specifiche del glicopeptide attraverso la presentazione dell'antigene su MHC II da parte di cellule dendritiche o cellule B, dimostrando che i glicoformi di un peptide presentato da MHC possono essere riconosciuti attraverso l'interazione TCR. Nell'uomo, le cellule T CD4 plus e CD8 plus specifiche per Tn-MUC1- sono state trovate in 5 su 7 pazienti vaccinati con cellule dendritiche cariche di Tn-MUC1-. Allo stesso modo, sono state osservate risposte delle cellule T specifiche per O-GlcNAc contro peptidi O-GlcNAc condivisi identificati attraverso l'immunoglicoproteomica delle leucemie. Questi peptidi sono stati presentati da molecole MHC di classe I e una linea di cellule T specifica per O-GlcNAc potrebbe uccidere le cellule autologhe pulsate con il peptide O-GlcNAc, ma non le cellule pulsate con il peptide non modificato. Presi insieme, questi studi indicano che le modificazioni post-traduzionali dei peptidi, in particolare le modificazioni legate all'O, possono rappresentare una nuova classe di neoantigeni per l'immunoterapia basata su TCR.

La glicosilazione alterata sulla membrana delle cellule maligne è una caratteristica comune del cancro [51]. Questo cambiamento nelle modifiche post-traduzionali aumenta il numero di antigeni tumore-specifici per il legame con le cellule T CAR. Il primo CAR a sfruttare queste differenze di glicosilazione è stato diretto contro la glicoproteina associata al tumore (TAG-72), un sialil-Tn O-glicano troncato situato sulla superficie cellulare delle O-glicoproteine ​​[52] noto per essere sovraespresso da adenocarcinomi epiteliali [53]. Progettate come CAR di prima generazione, le cellule CAR-T CC49 sono state in grado di colpire efficacemente le linee tumorali gastrointestinali che esprimono TAG-72. Il primo studio sull'uomo delle cellule T CAR TAG-72 ha portato a una diminuzione significativa sia dei livelli sierici di TAG-72 sia dei livelli sierici di CEA. Nonostante questi cambiamenti, non è stata raggiunta alcuna risposta clinica [54], probabilmente a causa della mancanza di proliferazione delle cellule T e del rigetto dovuto all'immunogenicità contro il CC49 scFv. Studi più recenti incentrati sul targeting del TAG-72 includono lo sviluppo di un CAR di seconda generazione che condivideva lo stesso CC49 scFv e aggiungeva un 4-1dominio di costimolazione BB per una migliore sopravvivenza delle cellule T. Le cellule CAR-T TAG-72 di seconda generazione hanno mostrato un'uccisione tumorale positiva nei modelli murini [55]. Un altro studio ha valutato un CAR mirato sia al TAG-72 sia al marcatore tumorale soppressivo dei macrofagi CD47 [56]. Questo studio ha dimostrato che le cellule CAR-T con la capacità di legare entrambi i marcatori erano in grado di eliminare le cellule bersaglio in vitro e potrebbero essere in grado di ridurre la possibilità di ricadute di perdita di antigene nei pazienti umani.

Un altro esempio di antigene tumorale differenzialmente glicosilato è la grande mucina proteica mucina 1 (MUC1), che è fortemente O-glicosilata e spesso esprime O-glicani troncati, come l'antigene Tn, nelle cellule tumorali. L'anticorpo monoclonale 5E5 può bersagliare selettivamente il Tn-glicoformio di MUC1 [48]. Utilizzando i domini variabili dell'anticorpo 5E5 come scFv, un CAR 4-1costimolato da BB di seconda generazione ha generato una robusta attività antitumorale in modelli di xenotrapianto derivati ​​da linee cellulari di leucemia a cellule T umana e carcinoma pancreatico metastatico. Nel 2019 è iniziato uno studio clinico di fase I che ha valutato le cellule CAR-T mirate a Tn-MUC1 in diverse indicazioni cliniche (NCT04025216).

Lewis Y (LeY) è un altro oligosaccaride clinicamente rilevante che rappresenta un bersaglio promettente per le cellule T CAR. Sebbene la funzione di LeY sia sconosciuta, è presente su diverse proteine ​​con un elevato numero di copie, inclusi alcuni antigeni associati al tumore [57]. Una CAR di seconda generazione con un dominio di costimolazione CD28 ha dimostrato l'efficacia preclinica prendendo di mira l'antigene LeY nei topi portatori di tumori ovarici sottocutanei OVCAR3 [58] ed è stato aperto uno studio clinico per determinare l'efficacia nei pazienti con leucemia mieloide acuta (AML). Un paziente ha raggiunto una CR transitoria e due pazienti hanno raggiunto una PR. Tuttavia, la malattia è progredita in tutti e cinque i pazienti e la migliore risposta di 23 mesi fino alla progressione è stata associata a una maggiore persistenza delle cellule T CAR. Un altro studio è stato avviato nel 2019 in Australia ed è in corso al momento di questa revisione.

Un altro progetto CAR che consente il targeting dei glicani utilizza proteine ​​o lectine naturali che legano i glicani come dominio specifico dell'antigene extracellulare. Uno studio di Meril et al. ha sviluppato CAR che incorporano gli esodomini di Siglec-7 e Siglec-9 umani per legare sialoglicani affini [59]. Le cellule CAR T basate su Siglec sono state in grado di mediare l'attività antitumorale contro linee cellulari derivate da istotipi di cancro diversi come la leucemia e il cancro ovarico in vitro, nonché un modello di xenotrapianto di melanoma derivato dal paziente nei topi NSG. Questo uso di recettori o ligandi umani come dominio di legame delle cellule CAR-T può ridurre l'immunogenicità delle terapie cellulari che esprimono proteine ​​chimeriche, come la reattività anti-topo umana osservata in alcuni studi clinici sulle cellule CAR-T a causa del riconoscimento di cellule murine- basato su scFvs.

5. Fosfo-Antigeni

I fosfo-antigeni di superficie possono anche essere riconosciuti dalle cellule T circolanti. Questo riconoscimento è limitato a un sottoinsieme molto specifico di cellule T definite dall'espressione di δ TCR, che esprimono specificamente Vδ2 e V 9 (cellule T V 9Vδ2). Queste cellule T riconoscono i fosfoantigeni presentati dalle molecole di butirrofilina 3A (BTN3A) [60] o butirrofilina 2A (BTN2A) [61].

Le molecole di butriofilina sono geni necessari per la stimolazione delle cellule T V9Vδ2 da parte dei fosfoantigeni e sono correlate alla famiglia di proteine ​​B7, che comprende molecole costimolatorie e co-inibitrici [62]. Esistono tre sottofamiglie di molecole di butirrofilina (BTN1, BTN2 e BTN3), con la maggior omologia esistente tra BTN2A e BTN3A. Le molecole BTN3A sono state controverse nel modo in cui presentano antigeni e stimolano le cellule T V 9Vδ2. BTN3A è una sottofamiglia composta da tre geni: BTN3A1, BTN3A2 e BTN3A3. Uno studio recente ha definito l'importanza di un dominio B30.2 intracellulare, che fa parte di BTN3A1. Questo dominio B30.2 è risultato essere il dominio stimolatorio per le cellule T V 9Vδ2 dopo che è stato aggiunto chimericamente a BTN3A3, una proteina tipicamente caratterizzata come non stimolante [63]. Dopo l'attecchimento del dominio B30.2 da BTN3A1 su BTN3A3, il dominio è stato in grado di stimolare le cellule T V 9Vδ2.

Le cellule T δ sono una popolazione più piccola di cellule T definite dalle loro differenze nel TCR che le separa dalle cellule T. Queste celle, opportunamente, sono costituite da TCR che contengono una catena e una catena δ rispetto alle tradizionali catene e. Le cellule T V 9Vδ2, quando attivate, possono esercitare una gamma di diverse funzioni effettrici, inclusa l'uccisione di cellule infette [64]. Questo sottoinsieme di cellule costituisce l'1-5% del totale delle cellule T circolanti. Tuttavia, durante le infezioni, la frequenza del sottogruppo aumenta a oltre il 50% [65]. Questo sottoinsieme di cellule esprime spesso CD45RO ad alta frequenza, portando a un fenotipo più simile alla memoria. Ciò porta a una risposta delle cellule T più simile a quella innata, rispetto a una risposta simile a un effettore acquisito. Mentre solo l'1-5 percento delle cellule T totali sono cellule T V 9Vδ2, oltre 1 cellula T di memoria totale su 40 sono cellule T V 9Vδ2 [66]. Questo fenotipo consente alle cellule T V 9Vδ2 di indirizzare un gran numero di fosfoantigeni invece di legarsi specificamente a uno solo. Dopo l'attivazione con il fosfoantigene, le cellule T V 9Vδ2 si differenziano preferenzialmente in un fenotipo Th1-simile, caratterizzato da un'elevata produzione di IFN e TGF [67]. Tuttavia, possono anche essere indotti nelle popolazioni Th2, Th17 e Treg in base al profilo delle citochine presentato loro. Ad esempio, la differenziazione Th2 avviene con la stimolazione IL-4 e la differenziazione Th17 avviene con la stimolazione con IL-1 , IL-23 e TGF [68].

È noto che le cellule T V 9Vδ2 hanno un effetto sia pro che anti-immunogenico sui tumori. In modelli in vitro e murini, sono citotossici contro molti diversi tipi di linee tumorali [69]. L'attività citotossica contro i tumori è caratterizzata dal rilascio di IFN e TNF e da un aumento della produzione di granzima e perforina [68]. Tuttavia, l'attività protumorale si trova anche con le cellule T V 9Vδ2. È noto che le cellule T V 9Vδ2 sopprimono la proliferazione delle cellule CD4 e T e producono citochine antinfiammatorie come IL-10, suggerendo che una popolazione di queste cellule abbia un fenotipo regolatorio o soppressivo [70].

Mentre alcune cellule T sono anche in grado di colpire i fosfoantigeni attraverso il TCR, la maggior parte della fosforilazione cellulare avviene a livello intracellulare, il che ha probabilmente limitato il perseguimento di questa classe di obiettivi per lo sviluppo di CAR. Il tema della fosforilazione sulla membrana cellulare è dibattuto. Tuttavia, gli studi hanno dimostrato che esiste la fosforilazione extracellulare da parte delle chinasi secrete [71]. Questa fosforilazione può portare a effetti biologici, come la fosforilazione del recettore tirosina chinasi EphB2, portando a interazioni tra EphB2 e i recettori N-metil-D-asparato (NMDAR), che a loro volta portano al dolore [72]. Alcuni tipi di cancro hanno anche mostrato un aumento della fosforilazione extracellulare. Un aumento importante della lattoproteina chinasi (ecto-PKA) è stato dimostrato nel siero di pazienti con carcinoma mammario, nonché aumenti di PKA, PKC e CK2 nei prostasomi nel carcinoma prostatico, che possono portare ad un aumento della fosforilazione extracellulare [73]. . Se queste modifiche sono comuni, i fosfati extracellulari dovrebbero essere studiati come una possibile nuova classe di bersagli per le cellule T CAR. Attualmente non esistono studi che valutino le CAR specifiche del fosfoantigene.

6. Potenziali bersagli per le cellule CAR-T: glicoRNA

Un recente articolo di Flynn et al. ha descritto l'RNA glicosilato presente sulla membrana di diversi tipi di cellule [74]. I glicoRNA vengono trasferiti alla membrana cellulare e possono contenere sialoglicani riconoscibili dai recettori Siglec-11 e Siglec-14 che legano l'acido sialico all'immunoglobulina di tipo lectina (Siglec). I siglec sono recettori immunitari che legano i sarcoglicani con ruoli nell'inibizione dell'attivazione immunitaria, simili al ruolo di PD1 nelle cellule T. Mentre l'identificazione del glicoRNA è recente, questa scoperta dovrebbe incoraggiare l'indagine se il glicoRNA è selettivamente o più abbondantemente espresso dalle cellule tumorali. Inoltre, le molecole CAR possono essere sviluppate per colpire l'RNA e il glicogeno della superficie cellulare, che è ancora un altro esempio dell'espansione di antigeni mirabili che le molecole CAR hanno aggiunto alla cassetta degli attrezzi dell'immunità cellulare.

Altri potenziali bersagli per le terapie con cellule CAR-T sono stati esaminati in passato [75,76].

7. Conclusioni

Il riconoscimento delle cellule T di diversi tipi di biomolecole continua a essere un aspetto importante della ricerca immunologica. Sebbene le cellule T presenti in natura possano riconoscere molti tipi di antigeni, il loro targeting è limitato alla presentazione dell'antigene su domini come MHC, CD1 e BTN. L'aggiunta di un recettore chimerico alle cellule T consente il targeting di antigeni legati alla membrana che in precedenza non erano bersagliabili dalle cellule T. Le cellule CAR-T hanno dimostrato di essere uno strumento efficace nella lotta contro il cancro, consentendo il targeting indipendente dall'MHC di molecole di superficie specifiche del tumore. Ulteriori ricerche continuano a migliorare i tipi di bersagli per le cellule T CAR e a migliorare i progetti CAR.

Contributi dell'autore:

JTK e ADPJ hanno concepito il concetto e scritto e curato la recensione. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento:

ADPJ è supportato da finanziamenti per la ricerca da parte del Department of Veterans Affairs (IK2 BX00483), Tmunity Therapeutics, Parker Institute for Cancer Immunotherapy, AACR-Lustgarten Foundation, V Foundation e Penn-Hopkins Ovarian Cancer SPORE DRP (NCI P50CA228991).

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale:

Non applicabile.

Dichiarazione di consenso informato:

Non applicabile.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati:

Non applicabile.

Conflitto di interessi:

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

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