L'estratto di Cistanche Deserticola aumenta la formazione ossea negli osteoblasti
Mar 05, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lia, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen Chi Chend, Yi-Chin Fonga,ee Chih-Hsin Tangf,c
Astratto
Obiettivi:Abbiamo studiato l'effetto diCistanche deserticola Ma. (CD) sulla formazione ossea da parte di osteoblasti in coltura.MetodiIl test di formazione di noduli mineralizzati è stato utilizzato per esaminare gli effetti in vitro della CD sulla formazione ossea. La fosfatasi alcalina (ALP), le proteine morfogenetiche ossee (BMP)-2 e l'espressione dell'mRNA dell'osteopontina (OPN) sono state analizzate mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale. Il meccanismo d'azione dell'estratto di CD è stato studiato utilizzando il Western blotting. L'effetto anti-osteoporosi in vivo dell'estratto di CD è stato valutato in topi ovariectomizzati.Risultati chiaveL'estratto di CD non ha avuto alcun effetto sulla proliferazione, migrazione o guarigione delle ferite degli osteoblasti in coltura, ma ha aumentato l'mRNA di ALP, BMP-2 e OPN e la mineralizzazione ossea. Gli inibitori della protein chinasi (MAPK) o del fattore nucleare (NF)-kB attivati dal mitogeno hanno ridotto la formazione ossea indotta dall'estratto di CD e l'espressione di ALP, BMP-2 e OPN. Tuttavia, l'estratto di CD non ha influenzato l'osteoclastogenesi. Inoltre, l'estratto di CD ha prevenuto la perdita ossea indotta dall'ovariectomia in vivo.ConclusioniCD può essere un nuovo agente di formazione ossea per il trattamento dell'osteoporosi.
introduzione
L'osso è un tessuto complesso composto da diversi tipi cellulari che subiscono un processo continuo di rinnovamento e riparazione chiamato "rimodellamento osseo". I due principali tipi cellulari responsabili del rimodellamento osseo sono gli osteoclasti, che riassorbono l'osso, e gli osteoblasti, che formano nuovo osso. Il rimodellamento osseo è regolato da diversi ormoni sistemici (es. ormone paratiroideo, 1, 25-idrossivitamina D3, ormoni sessuali e calcitonina) e fattori locali (es. ossido nitrico, prostaglandine, fattori di crescita e citochine).[1]
L'osteoporosi si verifica quando il riassorbimento e la formazione dell'osso non sono coordinati e l'eccessiva rottura dell'osso supera la costruzione dell'osso.[2] I trattamenti attuali per l'osteoporosi includono bisfosfonati, calcitonina ed estrogeni, che sono inibitori del riassorbimento osseo che mantengono la massa ossea inibendo l'attività degli osteoclasti.[3] Tuttavia, l'effetto di questi farmaci nell'aumentare o nel recuperare la massa ossea è relativamente piccolo, certamente non più del 2% all'anno.[3] Vi è, quindi, la necessità di agenti per la costruzione dell'osso, come il teriparatide, che stimolino la formazione di nuovo osso e correggano il cambiamento nella microarchitettura trabecolare che è caratteristico dell'osteoporosi conclamata.[4,5] Perché la formazione di nuovo osso è principalmente una funzione di gli osteoblasti, agenti che agiscono aumentando la proliferazione delle cellule della linea osteoblastica o inducendo la differenziazione degli osteoblasti possono aumentare la formazione ossea.[5,6]
Sebbene i meccanismi dell'osteoporosi rimangano poco chiari, sono probabilmente correlati alla ridotta disponibilità o agli effetti dei fattori di crescita ossea, come le proteine morfogenetiche ossee (BMP).[7] I BMP, che sono strutturalmente correlati alla superfamiglia del fattore di crescita trasformante-b, sono stati originariamente identificati dalla loro capacità di indurre la formazione di osso ectopico nei roditori.[8] I BMP svolgono un ruolo importante nella formazione ossea e nella differenziazione delle cellule ossee stimolando l'attività della fosfatasi alcalina (ALP) e la sintesi di proteoglicani, collagene e osteopontina (OPN).[9] Uno studio recente ha trovato un legame tra l'osteoporosi e specifici polimorfismi nei geni BMP-2, ALP e OPN, suggerendo che sono associati allo sviluppo dell'osteoporosi.[10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; abbreviato in CD) è un'erba nativa in Cina ed è ampiamente utilizzata nella medicina tradizionale come agente terapeutico grazie alle sue proprietà sedative, analgesiche e immunostimolanti.[11] Moderni studi farmacologici hanno dimostrato che gli estratti di CD possono stimolare l'immunità,[12] eliminare i radicali liberi[13] e aumentare l'attività della superossido dismutasi.[14] Gli agenti antinfiammatori e antiossidanti hanno il potenziale per trattare l'osteoporosi aumentando la formazione ossea e/o sopprimendo il riassorbimento osseo.[15,16] Tuttavia, l'effetto della CD sulla funzione delle cellule ossee non è stato ancora determinato. Qui, riportiamo che l'estratto di CD non ha influenzato la proliferazione, la migrazione o l'attività di guarigione delle ferite degli osteoblasti in coltura, ma ha aumentato l'espressione di ALP, BMP-2 e OPN e la mineralizzazione ossea. Inoltre, mostriamo che le vie di segnalazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) e del fattore nucleare (NF)-kB possono essere coinvolte nell'aumento mediato dal CD dell'espressione genica e della mineralizzazione ossea. Al contrario, l'estratto di CD non ha soppresso l'osteoclastogenesi in vitro. In particolare, il trattamento dei topi con estratto di CD ha impedito la perdita ossea indotta dall'ovariectomia in vivo. I nostri dati, quindi, suggeriscono che la CD può essere utilizzata per stimolare la formazione ossea per il trattamento dell'osteoporosi.
Cistanche desertiche
Materiali e metodi
Cistanche deserticola estratto e materiali
L'estratto del CD è stato acquistato dalla Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). L'estrazione e l'isolamento del CD sono stati seguiti come descritto in precedenza (sulla base di dati spettrali hanno identificato la composizione chimica inclusi beta-sitosterolo, daucosterolo, acido succinico, triacontanolo, acteoside, betaina e polisaccaride).[17] Anticorpi policlonali di coniglio specifici per le chinasi regolate dal segnale p-extracellulare (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminal chinasi (JNK), JNK, p-p65 e p65 sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, USA). Il kit ELISA per l'osteocalcina è stato acquistato da Biosource Technology (Nivelles, Belgio). I telopeptidi C-terminali del kit ELISA di collagene di tipo I sono stati ottenuti da Cross Laps (Herlev, Danimarca). Il mutante dominante negativo p38 è stato fornito dal Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). Il mutante dominante negativo JNK è stato fornito dal Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). Il mutante dominante negativo ERK2 è stato fornito dal Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Tutti gli altri reagenti sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich (St Louis, USA).
Coltura cellulare
La linea cellulare di osteoblasti murini MC3T3-E1 è stata acquistata dall'American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Le cellule sono state coltivate in 95 percento di aria, 5 percento di CO2 con a-MEM che è stato integrato con 20 mm di HEPES e 10 percento di siero fetale di vitello inattivato al calore, 2 mm di glutammina, penicillina (100 U/ml) e streptomicina (100 mg /ml).
Misurazione della formazione di noduli mineralizzati
La formazione di noduli mineralizzati è stata valutata come descritto.[18] In breve, gli osteoblasti sono stati coltivati in un terreno contenente vitamina C (50 mg/ml) e b-glicerofosfato (10 mm) per due settimane e il terreno è stato cambiato ogni tre giorni. Dopo incubazione con estratto di CD per 12 giorni, le cellule sono state lavate due volte con 20 mm di soluzione salina tamponata con Tris contenente
0.15 m NaCl (pH 7,4), fissato in etanolo ghiacciato al 75 percento (v/v) per 30 minuti ed essiccato all'aria. La deposizione di calcio è stata determinata utilizzando la colorazione rosso-S di alizarina. In breve, le cellule e la matrice fissate con etanolo sono state colorate per 1 ora con 40 mm di rosso alizarina-S (pH 4,2) e risciacquate abbondantemente con acqua. Il colorante legato è stato eluito con il 10 percento (p/v) di cloruro di cetilpiridinio e il rosso di alizarina-S nei campioni è stato quantificato misurando l'assorbanza a 550 nm e confrontato con una curva standard. Una mole di alizarina red-S lega selettivamente circa due moli di calcio.
Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale
L'RNA totale è stato estratto dagli osteoblasti utilizzando un kit TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando 2 mg di RNA totale e un primer oligo(dT).[19,20] La reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR) è stata eseguita utilizzando TaqMan® one-step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, STATI UNITI D'AMERICA). È stato aggiunto cDNA totale (100 ng per 25-ml di reazione) con primer specifici per sequenza e sonde Taqman®. Tutti i primer e le sonde del gene bersaglio sono stati acquistati in commercio, inclusa la b-actina come controllo interno (Applied Biosystems). I saggi qPCR sono stati eseguiti in triplicato su un sistema di rilevamento della sequenza StepOnePlus (Applied Biosystems). Le condizioni di ciclo erano 10-minima attivazione della polimerasi a 95 gradi seguita da 40 cicli di 95 gradi per 15 s e 60 gradi per 60 s. La soglia è stata impostata al di sopra dello sfondo di controllo non del modello e all'interno della fase lineare dell'amplificazione del gene bersaglio per calcolare il numero di ciclo in cui è stata rilevata la trascrizione (denotata CT).
Analisi Western blot
I lisati cellulari sono stati preparati come descritto in precedenza.[21,22] Le proteine sono state risolte mediante SDS-PAGE e trasferite su membrane di polivinil difluoruro di Immobilon (Millipore, Billerica, USA). Le macchie sono state bloccate con albumina di siero bovino al 4% per 1 ora a temperatura ambiente e quindi sondate con anticorpi antiumani di coniglio contro p-65 o p-p65 (1: 1000) per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi, le macchie sono state incubate con l'anticorpo secondario anti-coniglio d'asino coniugato con perossidasi (1: 1000) per 1 ora a temperatura ambiente. Le macchie sono state visualizzate mediante chemiluminescenza potenziata utilizzando la pellicola X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Osteoporosi indotta da ovariectomia
Per questo studio sono stati utilizzati topi ICR femmine, di quattro settimane, 22~28 g. I topi sono stati ovariectomizzati bilateralmente sotto anestesia con tricloroacetaldeide (100 mg/kg) e i topi di controllo sono stati operati in modo simulato (Sham) per il confronto. La densità minerale ossea e il contenuto minerale osseo sono stati misurati dopo somministrazione orale di varie concentrazioni di estratti di CD ogni due giorni per quattro settimane. La densità minerale ossea corporea totale e il contenuto minerale osseo sono stati determinati mediante un assorbiometro a raggi X a doppia energia (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) utilizzando una modalità per piccoli soggetti come descritto in precedenza.[18, 23] Tutti i protocolli rispettavano le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali della China Medical University.
analisi statistica
L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). I valori indicati sono media ± SEM. L'analisi statistica tra due campioni è stata eseguita utilizzando il test t di Student. I confronti statistici di più di due gruppi sono stati eseguiti utilizzando l'analisi della varianza a una via con il test posthoc di Bonfer-Roni. In tutti i casi, P < 0,05="" è="" stato="" considerato="">
Estratto di Cistanche deserticola
Risultati
L'estratto di Cistanche deserticola aumenta la mineralizzazione ossea da parte degli osteoblasti
L'aggiunta dell'estratto CD per 24 o 48 h non ha influenzato la proliferazione delle cellule MC3T3-E1 degli osteoblasti di topo in un test MTT (dati non mostrati). Poiché la differenziazione degli osteoblasti è un processo complesso che coinvolge la proliferazione e la migrazione cellulare, abbiamo anche testato la capacità migratoria delle cellule MC3T3-E1 dopo il trattamento con l'estratto di CD. Usando Transwell e saggi di guarigione delle ferite, abbiamo scoperto che l'estratto di CD non ha influenzato la migrazione degli osteoblasti (dati non mostrati). La formazione di noduli mineralizzati è uno dei marker della maturazione degli osteoblasti. La colorazione con rosso alizarina S ha mostrato che i noduli mineralizzati si sono formati quando gli osteoblasti sono stati messi in coltura per due settimane in un mezzo contenente vitamina C (50 mg/ml) e b-glicerofosfato (10 mm), e questo è stato aumentato in modo dipendente dalla concentrazione dall'aggiunta di CD (Figura 1a). Pertanto, l'estratto di CD ha indotto la formazione di noduli ossei da parte degli osteoblasti in coltura, ma non la loro proliferazione o migrazione. Abbiamo anche esaminato il ruolo dell'estratto di CD nell'osteoclastogenesi indotta da RANKL ma non abbiamo riscontrato alcun effetto (dati non mostrati).
L'estratto di Cistanche deserticola aumenta la fosfatasi alcalina, la proteina morfogenetica ossea{0}} e l'espressione dell'osteopontina negli osteoblasti in coltura
Gli osteoblasti differenziati mostrano un'elevata attività ALP, che si correla con alti livelli di espressione enzimatica.[18] Abbiamo scoperto che il trattamento con estratto di CD per 72 ore ha aumentato significativamente l'attività dell'ALP degli osteoblasti (Figura 1b). Dato il ruolo cruciale di BMP-2, ALP e OPN nella differenziazione degli osteoblasti, abbiamo testato se l'estratto di CD esercita il suo effetto sulla differenziazione degli osteoblasti regolando l'espressione di BMP-2, ALP e OPN. Il trattamento delle cellule con estratto di CD ha aumentato l'espressione di mRNA di ALP, BMP-2 e OPN in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 1c), dimostrando che l'estratto di CD ha indotto la differenziazione degli osteoblasti sovraregolando ALP, BMP-2 e l'espressione OPN.
L'estratto di Cistanche deserticola aumenta la formazione di noduli ossei attraverso la via della proteina chinasi attivata dal mitogeno
È stato riportato che MAPK svolge un ruolo importante nella formazione ossea[24,25], quindi abbiamo quindi esaminato se questa via di segnalazione è coinvolta nella mineralizzazione ossea indotta dall'estratto di CD. Il pretrattamento delle cellule con l'inibitore ERK U0126, l'inibitore p38 SB203580 o l'inibitore JNK SP600125 ha ridotto la mineralizzazione ossea aumentata dell'estratto di CD (Figure 2a, 3a e 4a). Inoltre, gli inibitori hanno anche bloccato l'espressione di ALP, BMP-2 e OPN indotta dall'estratto di CD (Figure 2b-4c). La trasfezione di cellule con mutante ERK2, p38 o JNK ha ridotto l'aumento dell'estratto di CD nell'espressione dell'mRNA di ALP, BMP-2 e OPN (Figure 2c, 3c e 4c). Successivamente, abbiamo esaminato direttamente l'attivazione di ERK, p38 e JNK dopo il trattamento con estratto di CD. L'incubazione di cellule con estratto di CD ha indotto la fosforilazione di ERK, p38 e JNK (Figure 2d, 3d e 4d). Pertanto, ERK, p38 e JNK mediano l'aumento della formazione ossea indotta dal trattamento CD degli osteoblasti.
L'estratto di Cistanche deserticola aumenta la formazione di noduli ossei attraverso la via del fattore nucleare-kB
Come accennato in precedenza, l'attivazione di NF-kB è necessaria per la formazione ossea. [26,27] Abbiamo quindi trattato gli osteoblasti con gli inibitori di NF-kB pirrolidina ditiocarbammato (PDTC) e N-tosil-L-fenilalanina clorometil chetone (TPCK) sono stati acquistati da Calbiochem (Darmstadt, Germania) per determinare se l'attivazione di NF-kB è coinvolta nella mineralizzazione ossea indotta dall'estratto di CD. La Figura 5a mostra che il pretrattamento degli osteoblasti con PDTC o TPCK ha inibito la formazione di noduli ossei indotta dall'estratto di CD e ha anche ridotto l'aumento dell'espressione di ALP, BMP-2 e OPN (Figure 5b e 5c). La fosforilazione della subunità NF-kB p65 è un indicatore dell'attivazione di NF-kB; [28] coerentemente con ciò, abbiamo scoperto che l'estratto di CD aumentava la fosforilazione di p65 negli osteoblasti (Figura 5d). Questi risultati hanno indicato che l'attivazione di NF-kB è importante per l'espressione di ALP, BMP-2 e OPN indotta da CD e per la formazione di noduli ossei.
Inibizione della perdita ossea da parte dell'estratto di Cistanche deserticola in topi ovariectomizzati
Per esaminare l'effetto dell'estratto di CD sulla perdita ossea, l'osteoporosi è stata indotta nei topi femmine mediante ovariectomia. Come previsto, i topi ovariectomizzati hanno mostrato una diminuzione della densità minerale ossea totale del corpo e del contenuto minerale osseo (Figura 6a e 6b). Il trattamento con estratto di CD per quattro settimane ha inibito la perdita di densità minerale ossea e contenuto minerale osseo in modo dose-dipendente (Figura 6a e 6b). Le concentrazioni ematiche di ALP possono riflettere l'attività osteoblastica.[29] Come mostrato nella Figura 6c, l'estratto di CD ha inibito la diminuzione dell'attività sierica dell'ALP indotta dall'ovariectomia. Inoltre, l'estratto di CD ha anche aumentato il livello di osteocalcina, un marker di formazione ossea, e ha ridotto il livello di telopeptidi C-terminali del collagene di tipo I, un marker di riassorbimento osseo (Figura 6d e 6e). Questi risultati supportano quindi la potenza e l'efficacia dell'estratto di CD nel prevenire la perdita ossea in vivo.
Discussione
Cistanche deserticheMa, un'erba nativa in Cina, è ampiamente utilizzata nella medicina tradizionale per vari trattamenti terapeutici grazie alla sua attività sedativa, analgesica e immunostimolante.[11-15] Qui, abbiamo dimostrato che l'estratto di CD ha indotto la mineralizzazione ossea negli osteoblasti in coltura, ma lo ha fatto non pregiudicano la loro migrazione o proliferazione cellulare. Inoltre, abbiamo scoperto che ALP, BMP-2 e OPN sono proteine bersaglio della segnalazione indotta dall'estratto di CD, che richiede l'attivazione di ERK, p38, JNK e NF-kB.
L'osso è un tessuto complesso composto da diversi tipi cellulari che subiscono continuamente un processo di rinnovamento e riparazione.[30] Quando il riassorbimento e la formazione dell'osso sono squilibrati, la disgregazione ossea prevale sulla formazione ossea e i risultati dell'osteoporosi.[30] Abbiamo usato topi ovariectomizzati per esaminare l'effetto anti-osteoporosi dell'estratto di CD. I topi ovariectomizzati avevano una ridotta densità minerale ossea corporea e contenuto minerale osseo, che è stato alleviato dal trattamento con estratto di CD. L'estratto di CD ha anche aumentato i livelli sierici del marcatore osteogenico ALP e dell'osteocalcina. Pertanto, il CD è un agente di formazione ossea che previene la perdita ossea causata dall'ovariectomia in vivo.
Sebbene i meccanismi dell'osteoporosi non siano del tutto chiari, sono probabilmente correlati alla ridotta disponibilità, o alla diminuzione degli effetti, dei fattori di crescita ossea, come ALP, BMP-2 e OPN. Questi tre fattori svolgono un ruolo importante nel processo di formazione e rimodellamento osseo,[31] ed è stato ben documentato che la stimolazione della differenziazione cellulare degli osteoblasti è caratterizzata principalmente da una maggiore espressione di ALP, BMP-2 e OPN.[32 ] In questo studio, abbiamo scoperto che l'estratto di CD aumenta l'espressione di ALP, BMP-2 e OPN e migliora la mineralizzazione ossea. Pertanto, l'estratto di CD media la formazione ossea in parte sovraregolando l'espressione di ALP, BMP-2 e OPN.
È stato riportato che p38 è coinvolto nella regolazione dell'espressione di ALP durante la differenziazione delle cellule osteoblastiche; [33] allo stesso modo, ERK1/2 è importante per la proliferazione e la differenziazione degli osteoblasti. [34,35] JNK è coinvolto nella formazione degli osteoclasti .[36] Abbiamo mostrato qui che l'estratto di CD ha indotto la fosforilazione di ERK, p38 e JNK e gli inibitori di questi enzimi hanno antagonizzato il potenziamento della mineralizzazione ossea mediato dall'estratto di CD, suggerendo che l'attivazione di ERK, p38 e JNK svolgono un ruolo obbligatorio nella formazione ossea indotta dall'estratto di CD da parte di osteoblasti. Inoltre, gli inibitori dell'enzima e i mutanti dominanti negativi di ERK, p38 e JNK hanno ridotto l'espressione di ALP, BMP-2 e OPN potenziata dall'estratto di CD. Questi dati suggeriscono che l'attivazione delle vie ERK, p38 e JNK è necessaria per l'aumento dell'espressione e della maturazione di ALP, BMP-2 e OPN causata dall'estratto di CD negli osteoblasti. È stato riportato che ERK aumenta la proliferazione e la differenziazione degli osteoblasti.[34,35] Tuttavia, non abbiamo rilevato un effetto dell'estratto di CD sulla proliferazione degli osteoblasti. Pertanto, altri percorsi potrebbero aver contrastato l'effetto ERK dopo la stimolazione dell'estratto di CD o essere necessari per la proliferazione. A questo proposito, abbiamo scoperto che gli inibitori di PI3K e Akt riducono anche la mineralizzazione ossea indotta dall'estratto di CD e l'espressione di mRNA di ALP, BMP-2 o OPN (dati non mostrati). Pertanto, questi percorsi possono essere necessari per la formazione ossea indotta dall'estratto di CD.
NF-kB ha dimostrato di controllare la funzione degli osteoblasti nell'osso.[37] I risultati di questo studio mostrano che l'attivazione di NF-kB contribuisce alla mineralizzazione ossea indotta dall'estratto di CD e all'espressione di ALP, BMP-2 e OPN negli osteoblasti in coltura e che gli inibitori della via di segnalazione NF-kB-dipendente (PDTC e TPCK ) ha inibito la mineralizzazione ossea indotta dall'estratto di CD e l'espressione di ALP, BMP-2 e OPN. p65 è fosforilato in Ser536 da una varietà di chinasi in diverse vie di segnalazione, il che migliora il potenziale di transattivazione di p65.[38] I risultati di questo studio hanno mostrato che l'estratto di CD aumenta la fosforilazione di p65. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che l'attivazione di NF-kB è necessaria per la formazione ossea indotta dall'estratto di CD negli osteoblasti in coltura. Abbiamo anche scoperto che gli inibitori di ERK, p38 e JNK hanno invertito l'attività della luciferasi NF-kB indotta dall'estratto di CD (dati non mostrati), coerentemente con questi enzimi che sono mediatori a monte dell'attivazione di NF-kB indotta dall'estratto di CD. Pertanto, l'estratto di CD induce la formazione ossea attraverso le vie ERK/p38/JNK/ e NF-kB.
Conclusioni
Questo studio ha dimostrato che l'estratto di CD induce la differenziazione e la maturazione degli osteoblasti ma non la proliferazione o la migrazione. L'estratto di CD ha anche aumentato l'espressione di ALP, BMP-2 e OPN e la mineralizzazione ossea. Abbiamo dimostrato che i percorsi ERK, p38, JNK e NF-kB sono coinvolti nella formazione ossea mediata dall'estratto di CD e nell'espressione di ALP, BMP-2 e OPN. Inoltre, l'estratto di CD ha impedito la perdita ossea in vivo indotta dall'ovariectomia. Pertanto, il CD può essere utile nello stimolare la formazione ossea nel trattamento delle malattie osteoporotiche.
