Cistanche Deserticola Il polisaccaride attenua l'osteoclastogenesi e il riassorbimento osseo inibendo la segnalazione di RANKL e la produzione di specie di ossigeno reattivo

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Dezhi Song et al

L'osteoporosi è una malattia metabolica caratterizzata da osteopenia e deterioramento della microstruttura ossea. Gli osteoclasti sono le cellule effettrici primarie che degradano la matrice ossea e la loro funzione anormale porta allo sviluppo dell'osteoporosi. L'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) durante il metabolismo cellulare promuove la proliferazione e la differenziazione degli osteoclasti, svolgendo quindi un ruolo importante nell'osteoporosi.Cistanchedeserticopolisaccaride(CDP) possiede attività antitumorale, antinfiammatoria e antiossidante. Tuttavia, l'impatto della CDP sugli osteoclasti non è chiaro. In questo studio, sono state utilizzate la colorazione della fosfatasi acida tartrato-resistente, l'immunofluorescenza, la reazione a catena della trascrizione-polimerasi inversa e l'analisi western blot per dimostrare che la CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)inibisce l'osteoclastogenesi e il riassorbimento dell'idrossiapatite. Inoltre CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)ha anche inibito l'espressione dei geni marcatori degli osteoclasti inclusi Ctsk, Mmp9 e Acp5 e non ha avuto alcun effetto sull'attivatore del recettore dell'espressione del fattore nucleare κB (RANK). Le analisi meccanicistiche hanno rivelato che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)aumenta l'espressione di enzimi antiossidanti per attenuare la produzione di ROS mediata da RANKL negli osteoclasti e inibisce il fattore nucleare delle cellule T attivate e l'attivazione della protein chinasi attivata dal mitogeno. Questi risultati suggeriscono che il CDP potrebbe rappresentare un farmaco candidato per il trattamento dell'osteoporosi causata da un'eccessiva attività degli osteoclasti.

PAROLE CHIAVEriassorbimento osseo,Cistanchedeserticopolisaccaridi, MAPK, osteoclasti, specie reattive dell'ossigeno

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1|INTRODUZIONE

L'equilibrio tra la formazione ossea, mediata dagli osteoblasti, e il riassorbimento osseo, mediato dagli osteoclasti, gioca un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi metabolica dell'osso (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Quando il riassorbimento osseo supera la formazione ossea, si verifica l'osteoporosi, caratterizzata da una ridotta massa ossea e da danni microstrutturali ossei (Ikeda, 2008). L'osteoporosi è una malattia comune negli anziani e nelle donne in postmenopausa e la sua patogenesi non è stata completamente chiarita (Cooper & Melton, 1992). La carenza di estrogeni è una delle principali cause di osteoporosi (Manolagas, O'Brien e Almeida, 2013). Inoltre, le specie reattive dell'ossigeno (ROS) possono essere indotte dall'attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare κB (RANKL) e sono associate alla formazione di osteoclasti (Yip et al., 2005), e quindi possono contribuire allo sviluppo dell'osteoporosi (Manolagas, 2010). Alcuni studi hanno scoperto che la carenza di antiossidanti Nrf2 aumenta i livelli di ROS e promuove la differenziazione degli osteoclasti indotta da RANKL (Hyeon, Lee, Yang e Jeong, 2013). Pertanto, la riduzione della produzione di ROS durante la differenziazione degli osteoclasti dovrebbe essere valutata come strategia terapeutica per il trattamento dell'osteoporosi.

Gli osteoclasti derivano dal lignaggio ematopoietico dei monociti o dei macrofagi e sono le uniche cellule multinucleate che svolgono il riassorbimento osseo (Teitelbaum, 2000). Pertanto, la ricerca che coinvolge la formazione di osteoclasti è di grande importanza nello sviluppo di trattamenti efficaci per le malattie del metabolismo osseo (Lorenzo, 2017). Il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e RANKL, prodotti da osteoblasti e cellule T attivate, sono importanti citochine che regolano l'osteoclastogenesi (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL induce l'espressione del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFATc1), che è un fattore di trascrizione critico attivo durante la formazione degli osteoclasti (Ishida et al., 2002). NFATc1 attivato promuove l'espressione di geni marcatori degli osteoclasti come la fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAcP) e la catepsina K (CTSK) che regolano l'osteoclastogenesi e la funzione degli osteoclasti (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticopolisaccaride(CDP) è isolato dagli steli carnosi diCistanchee possiede regolazione immunitaria, antitumorale, antietà e altri effetti farmacologici (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo e Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)ha avuto un effetto inibitorio sulla produzione di ossido nitrico (NO) indotta da lipopolisaccaridi nelle cellule microgliali di topo (cellule BV-2; Nan et al., 2013). Inoltre, un estratto ricco di feniletanoidi (ECD) diCistanchemigliorato la capacità di nuoto dei topi diminuendo il danno muscolare, ritardando l'accumulo di acido lattico e migliorando l'accumulo di energia (Cai et al., 2010). Tuttavia, gli effetti della CDP sulla funzione e sull'attività degli osteoclasti rimangono sconosciuti.

In questo studio, abbiamo dimostrato che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)inibisce la differenziazione degli osteoclasti indotta da RANKL e il riassorbimento osseo. Il meccanismo alla base era che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)migliora l'espressione di enzimi antiossidanti per attenuare la produzione di ROS e quindi sopprime le cascate di segnalazione di NFAT attivato da RANKL e protein chinasi attivate da mitogeni (MAPK). Questi risultati suggeriscono che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)potrebbe essere usato per trattare l'osteoporosi causata da un eccessivo riassorbimento osseo osteoclastico.

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2|MATERIALI E METODI

2.1|Materiali

CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)(purezza > 98 percento) è stato acquistato da Solarbio (Pechino, Cina) e preparato a una concentrazione di stock di 1 mM in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Gli anticorpi sono specifici per c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforilato (p)-ERK, p-p38, p-JNK e -actina sono stati ottenuti da Santa Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Gli anticorpi contro la V-ATPasi d2 sono stati prodotti come descritto in precedenza (H. Feng et al., 2009). Il 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5- (3-carbossimetossifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS) e il sistema di analisi della luciferasi sono stati ottenuti da Promega (Sydney, Australia) . L'M-CSF ricombinante è stato acquistato da R&D Systems (Minneapolis, MN). La proteina ricombinante GST-rRANKL è stata espressa e purificata come descritto in precedenza (Xu et al., 2000).

2.2|Coltura cellulare

Le cellule RAW264.7 (cellule macrofagiche di topo) sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e coltivate in terreno essenziale minimo modificato (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australia) integrato con il 10% di siero bovino fetale, 2 mM di L-glutammina, 100 U/ml di penicillina e 100 ug/ml di streptomicina (terreno completo). I monociti derivati ​​dal midollo osseo (BMM) sono stati isolati da topi C57BL/6J di 6 settimane, che sono stati sottoposti a eutanasia secondo le procedure approvate dall'Animal Ethics Committee dell'Università dell'Australia occidentale (RA/3/100/1244). Le ossa lunghe sono state sezionate prive di tessuti molli e il midollo osseo è stato lavato dal femore e dalla tibia, che è stato quindi coltivato in un mezzo completo in presenza di M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Saggio di osteoclastogenesi

Le BMM sono state piastrate in piastre di coltura da 96 pozzetti a una densità di 6 × 103 cellule per pozzetto e trattate con un mezzo completo contenente M-CSF (50 ng/ml) e GST-rRANKL (100 ng/ml), in presenza o assenza di concentrazioni variabili di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tre nuclei) sono stati identificati come osteoclasti.

2.4|Saggi di citotossicità

I BMM sono stati seminati in piastre da 96 pozzetti a 6 × 103 cellule per pozzetto e lasciati per una notte ad aderire. Il giorno seguente, le cellule sono state incubate con concentrazioni variabili di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride). Dopo altre 48 ore, la soluzione MTS (20 µl/pozzetto) è stata aggiunta e incubata con cellule per 2 ore. L'assorbanza a 490 nm è stata determinata con un lettore di micropiastre (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Colorazione immunofluorescente

I BMM sono stati seminati a una densità di 6 × 103 cellule per pozzetto in presenza di M-CSF (50 ng/ml) durante la notte. Le cellule sono state quindi stimolate con M-CSF e GST-rRANKL (100 ng/ml) fino alla formazione di osteoclasti maturi. Gli osteoclasti sono stati quindi trattati con concentrazioni variabili di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)per 48 ore prima di fissare con paraformaldeide al 4%, permeabilizzare con 0.1% Triton X-100-PBS e bloccare con albumina di siero bovino al 3% in PBS. Le cellule preparate sono state incubate con falloidina coniugata con rodamina per 45 minuti al buio per la colorazione per F-actina. Le cellule sono state quindi lavate con PBS, i nuclei colorati di contrasto con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e montati con coprioggetti per la microscopia confocale.

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2.6|Saggio di riassorbimento dell'idrossiapatite

Per misurare l'attività degli osteoclasti, le BMM (1 × 105 cellule per pozzetto) coltivate su piastre rivestite di collagene a sei pozzetti (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) sono state stimolate con GST-rRANKL (100 ng/ml) e M-CSF (50 ng/ ml) fino a quando non sono stati generati osteoclasti maturi (Zhou et al., 2016). Le cellule sono state quindi staccate delicatamente dalla piastra utilizzando una soluzione di dissociazione cellulare (Sigma-Aldrich) e un numero uguale di osteoclasti maturi è stato seminato su singoli pozzetti in piastre da 96 pozzetti rivestite di idrossiapatite (Corning Osteoassay, Corning, NY). Gli osteoclasti maturi sono stati incubati in un terreno contenente GST-rRANKL e M-CSF con o senza CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)alle concentrazioni indicate. Dopo 48 ore, metà dei pozzetti sono stati colorati immunoistochimicamente per l'attività di TRAcP, come descritto sopra, per valutare il numero di cellule multinucleate per pozzetto. I restanti pozzetti sono stati sbiancati per 10 minuti per rimuovere le cellule e consentire la misurazione delle aree riassorbite. Le aree riassorbite sono state fotografate al microscopio ottico standard ed è stato utilizzato il software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) per quantificare l'area percentuale della superficie dell'idrossiapatite riassorbita dagli osteoclasti.

2.7|Saggi da reporter della luciferasi

Per studiare l'attivazione trascrizionale di NFATc1, le cellule RAW264.7 sono state trasfettate stabilmente con un costrutto reporter della luciferasi sensibile a NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Le cellule trasfettate sono state coltivate in piastre da 48 pozzetti a una densità di 1,5 × 105 cellule per pozzetto e pretrattate con varie concentrazioni di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)per 1 ora Dopo il pretrattamento, le cellule sono state stimolate con GST-rRANKL (100 ng/ml) per 24 ore e l'attività della luciferasi è stata misurata utilizzando il sistema di analisi reporter della luciferasi secondo il protocollo del produttore (Promega).

2.8|Analisi quantitativa della reazione a catena della trascrizione-polimerasi inversa (RT-PCR).

L'RNA totale è stato isolato dalle cellule utilizzando il reagente Trizol secondo il protocollo del produttore (Thermo Fisher Scientific). Il DNA complementare è stato sintetizzato utilizzando la trascrittasi inversa del virus della leucemia murina Moloney con 1 ug di RNA templato e primer oligo-dT. L'amplificazione della reazione a catena della polimerasi di sequenze specifiche è stata eseguita utilizzando il seguente programma: 94 gradi per 5 minuti, seguiti da 30 cicli di 94 gradi per 40 s, 60 gradi per 40 s e 72 gradi per 40 s e una fase di estensione finale di 5 minuti a 72 gradi. Le informazioni dettagliate sui primer specifici sono mostrate nella Tabella 1. I livelli relativi di RNA messaggero sono stati calcolati mediante normalizzazione dell'espressione del gene housekeeping Hmbs.

2.9|Analisi Western blot

Le BMM sono state coltivate in terreno completo con M-CSF in piastre a sei pozzetti e stimolate con GST-rRANKL (100 ng/ml) per i tempi indicati. Le cellule sono state lisate in tampone di lisi di radioimmunoprecipitazione e le proteine ​​​​sono state risolte mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide e trasferite su membrane di poli (fluoruro di vinilidene) (GE Healthcare, Silverwater, Australia). Le membrane sono state bloccate in latte scremato al 5% per 1 ora e quindi analizzate con vari anticorpi primari specifici con agitazione delicata durante la notte a 4 gradi. Le membrane sono state lavate e successivamente incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano. La reattività dell'anticorpo è stata quindi rilevata con un reagente a chemiluminescenza potenziata (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) e visualizzata con un Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Rilevamento ROS intracellulare

I livelli di ROS intracellulari sono stati rilevati utilizzando un kit di test di rilevamento di ROS cellulare di 2′,7′-diclorofluoresceina diacetato (Abcam, Melbourne, Australia). Le BMM (5 × 103 cellule per pozzetto) sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti e trattate con RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) e CDP per 72 ore. I livelli intracellulari di ROS sono stati misurati utilizzando 2',7'-diclorofluoresceina diacetato, che si ossida in DCF fluorescente in presenza di ROS. Le cellule sono state lavate nel tampone di Hank e incubate al buio per 30 minuti con 10 µM di DCFH-DA. Le immagini sono state ottenute utilizzando la microscopia confocale.

2.11|analisi statistiche

Tutti i dati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti eseguiti in triplicato se non diversamente indicato. I dati sono espressi come media ± DS. L'analisi unidirezionale della varianza seguita dai test post hoc di Student–Newman–Keuls è stata utilizzata per determinare la significatività delle differenze tra i risultati, con p <{0}}.05 considerato="">

3|RISULTATI

3.1|CDP inibisce l'osteoclastogenesi indotta da RANKL e la fusione degli osteoclasti

Per determinare se CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)può sopprimere la formazione di osteoclasti indotta da RANKL, abbiamo prima eseguito un test di osteoclastogenesi utilizzando BMM murini (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). I BMM sono stati trattati con RANKL e M-CSF per 5 giorni con concentrazioni crescenti di CDP. CDP ha ridotto il numero di cellule multinucleate TRAcP positive quando la concentrazione di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)raggiunto 5 µM o superiore (Figura 1a, b). Per valutare CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)tossicità e confermare che questi risultati non riflettevano la morte o il numero delle cellule, abbiamo eseguito un test MTS. I BMM sono stati trattati con RANKL e M-CSF per 48 ore con dosaggi variabili di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride). CDP non ha avuto alcun effetto sulla proliferazione del BMM alla concentrazione di 15 µM o inferiore (Figura 1c).

Per testare gli effetti della CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)sulla fusione degli osteoclasti, gli osteoclasti sono stati indotti con il trattamento RANKL e M-CSF, con o senza dosi variabili di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride). Gli osteoclasti sono stati colorati con rodamina-falloidina e DAPI per valutare il numero di nuclei per osteoclasto (Figura 2a). Sia il numero di osteoclasti che il numero medio di nuclei per osteoclasto sono diminuiti dopo la CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)trattamento (5–10 µM; Figura 2b, c). Pertanto, CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)ha avuto effetti inibitori sull'osteoclastogenesi indotta da RANKL e sulla fusione degli osteoclasti in modo dose-dipendente.

3.2|CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)attenua l'attività di riassorbimento dell'idrossiapatite osteoclastica indotta da RANKL

È stato eseguito un test di riassorbimento dell'idrossiapatite per rilevare l'effetto della CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)sulla funzione degli osteoclasti (Figura 3a). Dopo un'incubazione di 24 ore, il numero di osteoclasti per pozzetto non è cambiato mentre l'area di riassorbimento dell'idrossiapatite è stata significativamente ridotta dal trattamento con 5 e 10 µM di CDP rispetto ai gruppi di controllo (Figura 3b, c). Questi risultati dimostrano che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)ha forti effetti inibitori sia sulla formazione di osteoclasti che sull'attività di riassorbimento degli osteoclasti senza alcun effetto citotossico.

3.3|CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)inibisce l'espressione del gene marcatore degli osteoclasti

Per studiare ulteriormente gli effetti inibitori della CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)sull'osteoclastogenesi e sul riassorbimento osseo osteoclastico, i BMM sono stati trattati con RANKL e M-CSF per 5 giorni con concentrazioni variabili di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride). La RT-PCR è stata quindi eseguita per rilevare l'espressione dei geni marcatori degli osteoclasti. L'espressione di Nfatc1, un fattore di trascrizione cruciale durante l'osteoclastogenesi, è stata inibita da CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)in modo dose-dipendente (Figura 4a). Inoltre CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)(5 e 10 µM) hanno sottoregolato l'espressione dei geni correlati al riassorbimento osseo, inclusi Mmp9, Ctsk e Acp5 (Figura 4b-d).

3.4|CDP sopprime l'attività di NFATc1 e l'espressione proteica a valle

Per esaminare l'effetto di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)sull'attività NFATc1 indotta da RANKL, è stato eseguito un test reporter della luciferasi. Trattamento con CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride), a concentrazioni di 5 µM e superiori, inibiva significativamente l'attività NFATc1 indotta da RANKL (Figura 5a). Inoltre, l'analisi western blot ha mostrato che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)espressione proteica significativamente soppressa di NFATc1 e c-Fos nei BMM trattati con RANKL e M-CSF per 3 e 5 giorni (Figura 5b). Inoltre, l'espressione delle proteine ​​​​correlate alla funzione degli osteoclasti, come V-ATPase-d2 e CTSK, è stata sottoregolata in presenza di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)rispetto ai gruppi di controllo. Tuttavia, CDP non ha avuto alcun effetto sull'espressione RANK (Figura 5b).

3.5|CDP promuove l'espressione di enzimi antiossidanti per eliminare la produzione di ROS durante l'osteoclastogenesi indotta da RANKL

Per esplorare il meccanismo alla base dell'inibizione dell'osteoclastogenesi CDP-dipendente, i BMM sono stati trattati con RANKL (100 ng/ml) e M-CSF (50 ng/ml) insieme a PBS o CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)per 72 ore Abbiamo esaminato l'effetto della CDP sulla produzione intracellulare di ROS stimolata da RANKL. I livelli di ROS intracellulari sono stati aumentati dal trattamento RANKL, che è stato attenuato da CDP (5 e 10 µM; Figura 6a). Sia il numero di cellule ROS positive che l'intensità della colorazione ROS sono state ridotte dal trattamento con CDP in modo dose-dipendente (Figura 6b, c). L'analisi Western blot ha mostrato che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)promosso l'espressione di tioredossina (TRX1) e glutatione reduttasi (GSR) mentre sopprime l'espressione dell'ossido nitrico sintasi inducibile (NOS2) nei BMM che sono stati trattati con RANKL e M-CSF per 3 giorni (Figura 6d).

Per esplorare ulteriormente se CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)soppresso la differenziazione degli osteoclasti riducendo la produzione di ROS, abbiamo quindi trattato i BMM con perossido (10 µM) per imitare l'alto stato di ROS nelle cellule. I BMM sono stati indotti da RANKL e M-CSF per 3 giorni e i risultati dell'analisi western blot e della RT-PCR hanno mostrato che il perossido promuoveva l'espressione di NFATc1 e c-Fos rispetto ai gruppi di controllo. Coerentemente con i risultati della Figura 5, l'espressione di NFATc1 e c-Fos è stata soppressa da CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)mentre il perossido ha salvato l'effetto inibitorio del CDP (Figura 6e, f). Questi dati indicavano che CDP reprimeva l'espressione di NFATc1 e c-Fos scavenging della produzione di ROS.

3.6|CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)reprime le vie MAPK durante l'osteoclastogenesi indotta da RANKL

Successivamente, abbiamo studiato l'effetto di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)trattamento sull'espressione di TRAF6 mediata da RANKL e sull'attivazione della via MAPK. Dopo l'incubazione in terreno privo di siero per 2 ore, le BMM sono state stimolate con RANKL, con o senza CDP, per 60 minuti. La stimolazione con CDP (10 µM) non ha avuto alcun effetto sull'espressione di TRAF6 e ha attenuato la fosforilazione di JNK2 ed ERK1/2 a 10 e 20 minuti (Figura 7). Inoltre, la fosforilazione di p38 è stata significativamente inibita dal CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)trattamento di 60 min rispetto ai gruppi di controllo (Figura 7). Questi dati rivelano che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)sopprime le vie di segnalazione MAPK indotte da RANKL, coerentemente con il suo effetto inibitorio sulla formazione e sull'attività degli osteoclasti.

4|DISCUSSIONE

Cistanche, noto come "ginseng del deserto", ha attirato molta attenzione di recente per la sua capacità di modulare l'immunità e agire in modo protettivo durante l'invecchiamento e lo stress ossidativo (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). È stato dimostrato che i glicosidi sostituiti con fenilpropanoidi, i principali componenti attivi di Cistanche, inibiscono l'attività di NO nei macrofagi (Ahn, Chae, Chin e Kim, 2017). Inoltre, unCistancheestratto ha ridotto lo stress ossidativo nel miocardio riperfuso a seguito di ischemia e ha svolto un ruolo significativo nell'inibizione delle vie apoptotiche che portano alla cardioprotezione (Yu, Li e Cao, 2016). Come componente importante di Cistanche, CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)ha diverse funzioni farmacologiche. Il nostro studio attuale ha scoperto che il CDP ha represso la differenziazione e l'attivazione degli osteoclasti attivati ​​da RANKL attenuando la produzione di ROS e l'attivazione di NFAT e MAPK.

In quanto fosfatasi acida, TRAcP esiste in una varietà di cellule ed è abbondante negli osteoclasti e nei macrofagi alveolari (Snipes, Lam, Dodd, Gray e Cohen, 1986). TRAcP è un enzima caratteristico degli osteoclasti e la sua espressione è strettamente correlata alla funzione degli osteoclasti, considerata un indicatore dell'attività degli osteoclasti e del riassorbimento osseo (Minkin, 1982). Nel nostro studio, CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)ha inibito il numero di cellule TRAcP-positive, indicando che l'osteoclastogenesi indotta da RANKL era bloccata da CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride). La degradazione della matrice ossea da parte degli osteoclasti dipende dalla catepsina K (CTSK) e dalle MMP (Gruber, 2015). Qui, CDP ha significativamente sottoregolato l'espressione dei geni funzionali degli osteoclasti come Mmp9, Ctsk e Acp5.

La differenziazione e la funzione degli osteoclasti sono regolate da molteplici vie di segnalazione (Boyle, Simonet e Lacey, 2003). Dopo essersi legato a RANK, RANKL recluta la proteina adattatrice TRAF6 per attivare l'espressione di NFATc1, che è un importante fattore di trascrizione per la formazione di osteoclasti, che colpisce l'espressione genica specifica degli osteoclasti, inclusi TRAcP e CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). In questo studio, abbiamo scoperto che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)non ha avuto alcun effetto sull'espressione di RANK e TRAF6 negli osteoclasti. Tuttavia, CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)inibito l'attivazione di NFATc1 indotta da RANKL durante l'osteoclastogenesi dei BMM. Inoltre, è stato dimostrato che i ROS, prodotti dai mitocondri nel processo di rilascio degli elettroni, promuovono la proliferazione e la differenziazione degli osteoclasti e regolano la degradazione della matrice ossea (Ha et al., 2004). Uno studio recente ha scoperto che RANKL ha indotto l'importazione nucleare di Bach1 e ha attenuato la produzione di enzimi antiossidanti mediati da Nrf2, aumentando così l'espressione di ROS intracellulare e l'osteoclastogenesi nei topi (Kanzaki et al., 2017). Inoltre, l'aumento della generazione intracellulare di ROS da parte dell'omocisteina ha migliorato la formazione e l'attività degli osteoclasti (Koh et al., 2006). Il nostro studio ha scoperto che il CDP ha ridotto l'accumulo di ROS negli osteoclasti inibendo l'espressione di NOS2 e promuovendo l'espressione di enzimi antiossidanti, come TRX1 e glutatione reduttasi. Quando abbiamo trattato i BMM con perossido per migliorare l'accumulo di ROS intracellulare, i risultati che un aumento di ROS potrebbe migliorare l'espressione di NFATc1 hanno rivelato che ROS era a monte di NFATc1. Abbiamo anche scoperto che il perossido ha salvato l'effetto inibitorio del CDP sull'espressione di NFATc1. Quindi, i nostri dati suggeriscono che CDP sopprime l'accumulo di ROS per inibire l'espressione di NFATc1, quindi per reprimere la formazione e la funzione degli osteoclasti.

ERK, JNK e p38 appartengono alla famiglia MAPK, che è anche coinvolta nella regolazione della differenziazione degli osteoclasti (Seger & Krebs, 1995). RANKL attiva la via MAPK aumentando la fosforilazione di ERK, JNK e p38 (Mizukami et al., 2002). Abbiamo dimostrato che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)ha represso la fosforilazione mediata da RANKL di proteine ​​chiave nella via MAPK, contribuendo così all'effetto inibitorio della CDP sull'espressione dei geni marcatori degli osteoclasti. A nostra conoscenza, questo è il primo studio che mostra gli effetti inibitori della CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)sulla produzione di ROS, NFAT e attivazione di MAPK, che rappresentano nuovi meccanismi d'azione della CDP in vitro.

In sintesi, abbiamo dimostrato che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)attenua l'osteoclastogenesi e il riassorbimento dell'idrossiapatite e l'espressione dei geni marcatori degli osteoclasti inclusi Ctsk, Mmp9 e Acp5. CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)è stato in grado di sopprimere la produzione di ROS mediata da RANKL, nonché l'attivazione di NFAT e MAPK (Figura 8). Collettivamente, i nostri risultati suggeriscono che CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)può rappresentare un farmaco candidato per il trattamento di patologie legate agli osteoclasti accompagnate da sovrapproduzione di ROS.

FIGURA 8 Schema schematico di CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)funzione nella differenziazione degli osteoclasti. CDP(Cistanchedeserticopolisaccaride)sopprime la produzione di ROS indotta da RANKL, così come l'attivazione di NFATc1 e MAPK, inibendo quindi l'osteoclastogenesi. CDP,Cistanchedeserticopolisaccaride; MAPK, protein chinasi attivata dai mitogeni; NFATc1, fattore nucleare dei linfociti T attivati; RANKL, attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare κB; ROS, specie reattive dell'ossigeno [La figura a colori può essere visualizzata su wileyonlinelibrary.com]

RINGRAZIAMENTI

Questo studio è stato supportato dalla Nature Science Foundation of China (81572164), dal National Key Technology Research and Development Program of China (2017YFC1103300), dalla Natural Science Foundation of the Guangxi Province (2016GXNSFAA380295) e dal University Science and Technology Research Project of Guangxi Provincia (KY2015YB054). È anche supportato in parte dal Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, The University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards e il Consiglio australiano per la ricerca medica e sanitaria (NHMRC, n. 1107828 e 1027932).

CONFLITTO DI INTERESSI

Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse

Da: 'Cistanchedeserticopolisaccarideattenua l'osteoclastogenesi e il riassorbimento osseo inibendo la segnalazione RANKL e la produzione di specie reattive dell'ossigeno di Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684