Cistanches Herba riduce l'aumento di peso nei topi obesi indotti da una dieta ricca di grassi, forse attraverso il disaccoppiamento mitocondriale

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan, Kam Ming Ko

* Divisione di Scienze della Vita, Università di Scienza e Tecnologia di Hong Kong, Hong Kong, Cina.

Astratto:

Una frazione semi-purificata isolata daCistanceErba(HCF1), è stato precedentemente trovato per indurre il disaccoppiamento mitocondriale nelle cellule H9c2 e nei cuori di ratto. Pertanto, abbiamo ipotizzato che l'HCF1 avrebbe prodotto un effetto di perdita di peso contro l'obesità indotta da una dieta ricca di grassi (HFD). Per verificare questa ipotesi, è stato stabilito un modello murino di obesità indotta da HFD e sono stati esaminati gli effetti di HCF1 su topi alimentati con dieta normale (ND) e alimentati con HFD. Nello studio, il trattamento a lungo termine con HCF1 ha prodotto un effetto di riduzione del peso contro l'obesità indotta da HFD nei topi maschi e femmine. La perdita di peso indotta da HCF1-è stata associata a una migliore sensibilità all'insulina negli animali alimentati con HFD. Per comprendere il meccanismo d'azione alla base dell'effetto di riduzione del peso offerto da HCF1, sono stati esaminati i suoi effetti sul disaccoppiamento mitocondriale. È stato inoltre condotto uno studio comparativo con la colestiramina (CT), un sequestrante degli acidi biliari. I risultati hanno dimostrato che la perdita di peso indotta da HCF1-è stata probabilmente mediata dall'aumento del consumo di energia, probabilmente attraverso l'induzione del disaccoppiamento mitocondriale nel muscolo scheletrico del topo. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono il potenziale utilizzo di HCF1 per prevenire l'obesità e le conseguenze sulla salute associate come il diabete, le malattie cardiovascolari e la sindrome metabolica.

Parole chiave: Cstanches Herba, Controllo del peso,Disaccoppiamento mitocondriale,Proteina disaccoppiamento mitocondriale 3

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introduzione

L'obesità è caratterizzata dall'anormale accumulo di grasso nel tessuto adiposo e in altri organi che produce effetti negativi sulla salute. I risultati attuali hanno indicato che lo stile di vita sedentario e i cambiamenti nella composizione alimentare nelle società benestanti hanno causato un'epidemia di obesità, con il concomitante aumento dell'incidenza di varie malattie croniche legate all'obesità non trasmissibili come la sindrome metabolica (Shi et al., 2012) . Il National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) condotto nel 2007 ha mostrato che la prevalenza globale dell'obesità era superiore al 30% e si prevedeva che aumentasse di un ulteriore 33% nei prossimi due decenni (Finkelstein et al., 2012). L'insorgenza dell'obesità si sposterà anche nelle popolazioni giovani, come si evince dalle tendenze in sovrappeso e obesità nei bambini e negli adolescenti (McTigue, Garrett e Popkin, 2002). Questi risultati prevedono il potenziale onere per l'assistenza medica per l'obesità e le conseguenze sulla salute associate, implicando una necessità immediata di controllare le dimensioni della popolazione obesa.

La gestione dell'obesità richiede un intervento a lungo termine e un approccio multidisciplinare. Data l'epidemia di obesità, la ricerca di possibili interventi non terapeutici e/o terapeutici è stata un'area di ricerca intensiva. La strategia si concentra principalmente sulla creazione del bilancio energetico aumentando la spesa energetica o riducendo l'assunzione di energia. Tra i vari approcci che includono un sostituto della dieta, l'esercizio fisico, l'inibizione dell'assorbimento intestinale e l'attivazione del sistema nervoso simpatico, l'induzione del disaccoppiamento mitocondriale, mediante l'uso di disaccoppianti chimici o mediante l'induzione di proteine ​​disaccoppianti mitocondriali (Cerqueira, Laurindo e Kowaltowski, 2011; Clapham et al., 2000), si è dimostrato un mezzo efficace per la perdita di peso (Clapham et al., 2000; Diehl & Hoek, 1999; Harper, Dickinson, & Brand, 2001; Li et al., 2000). Il disaccoppiamento mitocondriale si riferisce a un processo che causa il disaccoppiamento tra i processi di trasporto degli elettroni che producono energia e la fosforilazione dell'ADP nel mitocondrio. Offrendo un percorso alternativo di conduttanza protonica, il disaccoppiamento mitocondriale provoca la dissipazione del gradiente protonico e un più rapido consumo di ossigeno (Brand et al., 2005). Nella condizione di disaccoppiamento, la diminuzione della sintesi di ATP è associata a una riduzione del potenziale della membrana mitocondriale, con l'energia potenziale immagazzinata nel gradiente protonico che viene dissipata sotto forma di calore. Questo futile ciclo di trasporto di protoni consuma un'elevata percentuale di energia metabolica in vari tessuti, specialmente nel muscolo scheletrico che consuma circa il 20% dell'energia totale generata nel metabolismo (Chan, Wei, Chigurupati e Tu, 2010; Korshunov, Skulachev e Starkoc , 1997). La modulazione della fuoriuscita di protoni mitocondriali aumenta il metabolismo basale, che contribuisce a una parte significativa del dispendio energetico giornaliero, con conseguente innalzamento nell'uso di molecole di combustibile (come gli acidi grassi) e quindi causa perdita di peso (Ricquier & Bouillaud, 2000 ).

Cistanches Herba, una pianta intera essiccata di Cistanche deserticola YC Ma, è un'erba tonica "rinvigorente per lo Yang" nella medicina tradizionale cinese. L'erba è stata anche usata come alimento salutare per il trattamento della carenza renale per centinaia di anni in Cina. I nostri recenti risultati hanno mostrato che una frazione semipurificata di Cistanches Herba (HCF1) ha indotto il disaccoppiamento mitocondriale nelle cellule H9c2 e nei cuori di ratto (Wong & Ko, 2013). È stato inoltre dimostrato che il trattamento a lungo termine con HCF1 (a dosi giornaliere di 1,14 e 11,4 mg/kg; 14 giorni consecutivi) ha prodotto un effetto disaccoppiante sui mitocondri isolati da rene e fegato nei ratti, come indirettamente evidenziato dalla riduzione dei livelli di ATP in questi tessuti (dati non pubblicati). Dato che l'induzione del disaccoppiamento mitocondriale è un mezzo efficace per la perdita di peso (Clapham et al., 2000; Diehl & Hoek, 1999; Harper et al., 2001; Li et al., 2000), abbiamo ipotizzato che anche HCF1 produrrebbe disaccoppiamento mitocondriale nel muscolo scheletrico, con conseguente riduzione del peso. Per verificare l'ipotesi, è stato stabilito un modello murino di obesità indotta da dieta ricca di grassi (HFD) e sono stati studiati gli effetti dell'HCF1 su topi alimentati con dieta normale (ND) e HFD. Inoltre, è stato condotto uno studio comparativo tra gli effetti di HCF1 e una colestiramina sequestrante degli acidi biliari (CT) (Chen et al., 2010; Yamato et al., 2012) per caratterizzare l'effetto di riduzione del peso offerto da HCF1.

stelo di cistanche

2. Materiali e metodi

2.1. Estrazione di erbe

Cistanches Herba, la pianta intera essiccata di Cistanches deserticola YC Ma (Orobanchaceae), è stata acquistata da un commerciante di erbe locale (Lee Hoong Kee). L'erba è stata autenticata dal fornitore e un esemplare di voucher (HKUST00301) è stato depositato presso la Divisione di Scienze della Vita, l'Università di Scienza e Tecnologia di Hong Kong (HKUST). L'estratto di etanolo Cistanches Herba è stato ottenuto mediante estrazione con etanolo di materiale vegetale macinato riscaldando a riflusso a 78 gradi per 2 ore, come descritto in precedenza (Leung & Ko, 2008), con una resa del 14% (p/p). L'estratto è stato ulteriormente frazionato mediante cromatografia su gel di silice (Wong & Ko, 2013). È stato ottenuto HCF1, con una resa di estrazione dell'1,14 percento. L'estratto è stato essiccato evaporando il solvente a pressione ridotta a 50 gradi e l'estratto essiccato è stato conservato a -20 gradi fino all'uso.

2.2. Sostanze chimiche

Il reagente per il dosaggio Bio-Rad è stato acquistato da Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA). LabAssay™ Trigliceridi (290-63701), LabAssay™ Colesterolo (294-65801) e kit per il test del colesterolo HDL E (431-52501) sono stati acquistati da Wako (Osaka, Giappone). L'anticorpo anti UCP3 (E-18) (catalogo n. sc-31387) ​​è stato acquistato da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Tutti gli altri prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma (St. Louis, MO, USA).

2.3. Cura degli animali

I topi ICR (8 settimane; 30–35 g per i maschi e 25–30 g per le femmine) sono stati mantenuti in un ciclo buio/luce di 12-h in una stanza con aria/umidità controllata a circa 22 gradi e hanno permesso cibo e acqua ad libitum nelle strutture per la cura degli animali e delle piante (APCF) a HKUST. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Research Practice Committee (HKUST) (Approvazione protocollo animale n. 2013049; data approvata: 25 settembre 2013; durata dell'esperimento: 3 anni).

prolungamento della vita delle cistance

2.4. Protocollo di trattamento

Per esaminare l'effetto dell'HCF1 sull'obesità indotta da HFD, i topi ICR maschi o femmine sono stati assegnati in modo casuale a otto gruppi, con 10-15 topi in ciascuno: (1) controllo della dieta normale (ND, 13% di energia derivata dal grasso); (2) ND più basse dosi di HCF1 (HCF1 L) (a una dose giornaliera di 1,5 mg/kg); (3) ND più dose media di HCF1 (HCF1 M) (a una dose giornaliera di 15 mg/kg); (4) ND più alte dosi di HCF1 (HCF1 H) (a una dose giornaliera di 45 mg/kg); (5) controllo HFD (60% di energia derivata dal grasso; acquistato da Research Diet Inc., prodotto n. D12492); (6) HFD più HCF1 L; (7) HFD più HCF1 M; e (8) HFD più HCF1 H. Poiché nei ratti e nell'uomo sono state riportate differenze di genere nella reattività alla dieta indotta da variazioni del peso corporeo e interventi di riduzione del peso (Rodriguez & Palou, 2004; Rodriguez, Quevedo-Coli, Roca e Palou, 2001), eravamo interessati a studiare gli effetti di HCF1 su topi maschi e femmine. Le dosi di HCF1 sono state derivate dalle sue dosi efficaci per indurre cuori di ratto disaccoppianti mitocondriali (Wong & Ko, 2013). Nei gruppi di co-trattamento HCF1, i topi sono stati somministrati per via intragastrica con HCF1, 5 giorni alla settimana per 8 settimane (cioè, 40 dosi). I topi di controllo hanno ricevuto solo il veicolo (olio d'oliva). Il peso corporeo e il consumo di cibo dei topi sono stati monitorati settimanalmente nel corso dell'esperimento. Le variazioni del peso corporeo sono state quantificate calcolando l'area sotto la curva (AUC) del grafico che traccia la percentuale del peso corporeo iniziale rispetto al tempo (settimana 1–8) ed espresse in unità arbitrarie. Campioni di sangue sono stati prelevati 24 ore dopo l'ultima somministrazione di HCF1 da topi anestetizzati con fenobarbital a digiuno durante la notte mediante puntura cardiaca. I topi sono stati quindi sacrificati per lussazione cervicale. Campioni di muscolo gastrocnemio sono stati asportati per ulteriori analisi biochimiche. I cuscinetti adiposi (grasso gonadico, retroperitoneale e mesenterico) sono stati sezionati e pesati. Il rapporto tra il peso di un particolare cuscinetto adiposo e il peso corporeo è stato stimato ed espresso come indice del cuscinetto adiposo. Per esaminare l'effetto della TC sui topi maschi obesi alimentati con HFD, i topi maschi sono stati somministrati per via intragastrica con CT (sospesi in acqua) a una dose giornaliera di 300 mg/kg.

2.5. Preparazioni campione

Sono stati ottenuti campioni di plasma, omogenati muscolari scheletrici (frazione priva di nucleo) e mitocondri muscolari scheletrici come descritto in precedenza (Leong et al., 2013).

2.6. Analisi biochimiche

2.6.1. Contenuto plasmatico di glucosio e lipidi

I livelli di glucosio plasmatico sono stati misurati mediante un kit di analisi del glucosio (esochinasi) (Sigma, St. Louis, MO, USA). La quantità di glucosio è stata valutata mediante l'aggiunta di una miscela di reazione contenente 1,5 mM NAD, 1.0 mM ATP, 1.0 unità/mL di esochinasi e 1.0 unità/ ml glucosio{8}}fosfato deidrogenasi. Le variazioni di assorbanza a 340 nm sono state monitorate spettrofotometricamente da Victor V3 Multi-Label Counter (Perkin Elmer, Santa Clara, CA, USA).

I livelli di trigliceridi plasmatici (TG), colesterolo totale (TC) e colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL) sono stati misurati utilizzando kit di test: TG: LabAssayTM Trigliceride, TC: LabAssayTM Cholesterol; HDL-C: kit per il test del colesterolo HDL E. I contenuti di TG, TC e HDL sono stati valutati aggiungendo i reagenti cromogeni forniti dai kit di analisi corrispondenti. Sono state monitorate le variazioni di assorbanza a 600 nm (Siddiqua, Hamid, Ar-Rashid, Akther e Choudhuri, 2010). Il livello di colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL) è stato stimato dalla formula di Friedewald:

LDL= TC-( HDL più TG/5 )

2.6.2. Attività della fosfofruttochinasi (PFK) nel muscolo scheletrico

L'attività della PFK è stata valutata miscelando una miscela di reazione contenente 1 mM di fruttosio-6-fosfato, 1 mM di ATP, 0.5 mM NADH, 2 mU/mL di aldolasi, 2 mU/mL di triosefosfato isomerasi, 2 mU /mL di glicerofosfato deidrogenasi nel tampone del saggio (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 5 mM (NH4)2SO4, pH 7,4) con la frazione priva di nucleo (50 ug di proteine/mL) del muscolo scheletrico in un volume finale di 200 ml. L'ossidazione del NADH è stata quindi misurata monitorando le variazioni di assorbanza a 340 nm (Coelho, Costa e Sola-Penna, 2007).

2.6.3. Attività della citrato sintasi (CS).

È stata preparata una miscela di reazione per misurare l'attività CS miscelando {{0}}.1 M di tampone Tris (pH 8.0), 0.058 mM di acetile -CoA e 0,1 mM 5,5'-ditiobis-(2- acido nitrobenzoico) (DTNB). La reazione è stata avviata mediante l'aggiunta di ossalacetato (concentrazione finale: 0,5 mM). L'assorbanza a 412 nm è stata registrata ogni 30 s a 30 gradi per 3 minuti (Carter, Rennie, Hamilton e Tarnopolsky, 2001; Holloway, Bonen e Spriet, 2009).

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2.6.4. -attività dell'idrossiacil-coenzima A deidrogenasi (-HAD).

L'attività -HAD è stata misurata mescolando la miscela di reazione contenente 100 μM di acetoacetil-CoA e 100 μM -NADH in tampone di dosaggio (tampone di fosfato di potassio 100 mM con acido etilendiamminotetraacetico 2 mM (EDTA), pH 7,3). Le variazioni di assorbanza a 340 nm sono state monitorate a 30 gradi per 2 minuti (Holloway et al., 2006).

2.6.5. Attività della carnitina palmitoiltransferasi (CPT).

La valutazione dell'attività CPT si basava sulla produzione catalizzata da CPT di CoA-SH da palmityl-CoA. La reazione è stata avviata aggiungendo L-carnitina (concentrazione finale 6 μM) alla miscela di reazione (Tris 16 mM, EDTA 2,5 mM, DTNB 2 mM e palmitoil-CoA 50 μM, pH 8,0). L'assorbanza a 412 nm è stata monitorata a 30 gradi per 180 s. Per la stima dell'attività enzimatica è stato utilizzato il coefficiente di estinzione millimolare di 13,6 mM-1 cm-1 per 5'-tio-2-nitrobenzoato (prodotto finale). Un'unità di attività CPT è definita come la quantità di enzima che catalizza il rilascio di 1 nmol CoA-SH in 1 minuto (Karlic, Lohninger, Koeck e Lohninger, 2002).

2.6.6. Respirazione mitocondriale

Le frequenze respiratorie nei mitocondri isolati dal muscolo scheletrico del topo sono state determinate come descritto da Wong e Ko (2013). In breve, la respirazione mitocondriale è stata misurata polarograficamente mediante un elettrodo di tipo Clark (Hansatech Instruments, Norfolk) a 30 gradi . La frazione mitocondriale (1 mg di proteina/ml) è stata incubata nel tampone di respirazione (30 mM KCl, 6 mM MgCl2, 75 mM saccarosio, 1 mM EDTA, 20 mM KH2PO4, pH 7,0). È stata aggiunta una soluzione di substrato contenente 15 mM di piruvato di sodio e 5 mM di malato di sodio. Dopo l'equilibrio, la respirazione dello stato 3 è stata avviata mediante l'aggiunta di ADP (concentrazione finale 0,6 mM). Quando tutto l'ADP aggiunto è stato esaurito per la generazione di ATP, è stata aggiunta oligomicina per indurre la respirazione dello stato 4. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR) è stato stimato calcolando il rapporto tra le frequenze respiratorie dello stato 3 e dello stato 4 (Jiang et al., 2009).

2.6.7. Espressione UCP3

Il livello di UCP3 è stato stimato mediante analisi Western blot utilizzando un anticorpo anti-UCP3 (E-18) dopo l'analisi SDS-PAGE della frazione mitocondriale, utilizzando un gel separatore di acrilammide al 10%. Sono state caricate frazioni mitocondriali isolate dal muscolo scheletrico del topo (100 g) e la citocromo c ossidasi (COX) è stata utilizzata come marker di riferimento. Le bande proteiche immunocolorate sono state analizzate mediante densitometria (Quantiscan, Biosoft, Cam bridge, GB, UK) e le quantità (unità arbitrarie) di UCP3 sono state normalizzate con riferimento al livello di COX (unità arbitrarie) nel campione.

2.7. Analisi delle proteine

La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando un kit di analisi proteica Bio-Rad. La concentrazione proteica è stata determinata da una curva di calibrazione utilizzando come standard l'albumina sierica bovina (BSA).

2.8. analisi statistica

Tutti i dati sono stati espressi come media ± errore standard della media (SEM) se non diversamente specificato. I dati sono stati analizzati mediante l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA unidirezionale) e la differenza tra i gruppi è stata rilevata dal test dell'intervallo di Tukey quando p <>

Cistanche erba

3. Risultati

3.1. Effetti di HCF1 sul peso corporeo nei topi alimentati con ND e HFD

L'alimentazione dietetica ND ha causato un leggero aumento del peso corporeo (rispettivamente del 13 percento e del 10 percento) nei topi maschi e femmine durante il corso dell'esperimento della 8- settimana (Fig. 1a). L'HFD ha accelerato l'aumento del peso corporeo, con l'entità della stimolazione rispettivamente del 269% e del 320% nei topi maschi e femmine, rispetto ai rispettivi animali ND (Fig. 1a). Le variazioni del peso corporeo nel corso dell'esperimento della 8-settimana sono state quantificate ed espresse in unità arbitrarie. Il trattamento con HCF1 ha completamente soppresso l'aumento di peso corporeo nei topi maschi alimentati con ND (Fig. 1b). Il trattamento con HCF1 ha anche soppresso in modo dose-dipendente l'aumento di peso corporeo nei topi alimentati con HFD, con il grado di inibizione rispettivamente del 100% e del 61% a 45 mg/kg sia nei topi maschi che in quelli femmine (Fig. 1b). Non è stato osservato alcun cambiamento significativo nel consumo di cibo durante l'alimentazione HFD e/o i co-trattamenti con HCF1 rispetto ai topi alimentati con ND non trattati (dati non mostrati).

Fig. 1 – Effetti dell'HCF1 sulle variazioni del peso corporeo nei topi alimentati con ND e HFD. Il peso corporeo è stato monitorato settimanalmente nel corso dell'esperimento 8-settimana. (a) L'andamento temporale delle variazioni del peso corporeo è stato analizzato mediante un'ANOVA a disegno misto e la differenza tra i gruppi è stata rilevata dal test della gamma Tukey. I dati sono stati espressi in percentuale di controllo rispetto al rispettivo peso corporeo iniziale. (b) Le variazioni del peso corporeo sono state quantificate come descritto in Materiali e metodi. I dati sono stati espressi in percentuale di controllo rispetto al controllo ND [valore AUC del controllo (unità arbitraria): maschio=777.6 ± 10.4; femmina {{10}}.0 ± 8,0]. I valori forniti sono medie ± SEM, con n=15. * Significativamente diverso dal controllo ND; # Significativamente diverso dal controllo HFD (p <>

3.2. Effetti di HCF1 sugli indici del cuscinetto adiposo nei topi alimentati con ND e HFD

Sono stati anche esaminati gli effetti dell'HCF1 sull'accumulo di grasso. L'HFD ha indotto aumenti significativi degli indici di grasso sottocutaneo e viscerale nei topi maschi (rispettivamente del 346% e del 325%) e femmine (rispettivamente del 248% e del 257%) (Fig. 2). Sebbene il trattamento con HCF1 non abbia prodotto alcun effetto sul grasso sottocutaneo e viscerale nei topi alimentati con ND, la capacità di HCF1 di inibire l'aumento di peso corporeo indotto da HFD era associata alla diminuzione della massa grassa corporea, come indicato da riduzioni di entrambi grasso sottocutaneo e viscerale nei maschi alimentati con HFD (del 42% e del 49%, rispettivamente, a 45 mg/kg) e nel grasso viscerale nei topi femmine alimentati con HFD (del 53%, a 45 mg/kg) (Fig. 2) .

Fig. 2 – Effetti dell'HCF1 sugli indici del cuscinetto adiposo in topi alimentati con ND e HFD. La massa di grasso sottocutaneo e grasso viscerale è stata misurata come descritto in Materiali e metodi. I dati sono stati espressi in percentuale di controllo rispetto al controllo ND. I valori forniti sono medie ± SEM, con n=15. * Significativamente diverso dal controllo ND; # Significativamente diverso dal controllo HFD (p <>

3.3. Effetti di HCF1 sul contenuto di glucosio plasmatico e lipidico nei topi alimentati con ND e HFD

Il trattamento con HCF1 non ha alterato il contenuto plasmatico di glucosio e lipidi nei topi maschi e femmine alimentati con ND (Fig. 3). L'alimentazione HFD ha causato un aumento significativo del livello di glucosio plasmatico (rispettivamente del 39 percento e del 29 percento) nei topi maschi e femmine rispetto al rispettivo controllo ND (Fig. 3a). HCF1 H ha invertito l'aumento del livello di glucosio plasmatico indotto da HFD (rispettivamente del 41 e 64 percento) nei topi maschi e femmine (Fig. 3a). L'HFD ha anche elevato significativamente i livelli plasmatici di TG (rispettivamente del 38 e del 53 percento) nei topi maschi e femmine, rispetto al rispettivo controllo ND (Fig. 3b). HCF1 L e HCF1 M hanno inibito significativamente l'aumento indotto da HFD dei livelli plasmatici di TG nei topi maschi alimentati con HFD (rispettivamente di 135 e 192) e femmine (rispettivamente del 103 e 146 percento) (Fig. 3b). HCF1 H ha causato un aumento significativo del livello plasmatico di TG (del 21%) nei topi femmine alimentati con HFD rispetto al controllo HFD non trattato (Fig. 3b). Oltre al TG plasmatico, sono stati osservati anche aumenti significativi dei livelli plasmatici di TC dopo l'alimentazione HFD, con l'entità degli aumenti rispettivamente del 73% e del 100%, nei topi maschi e femmine (Fig. 3c). Gli aumenti dei livelli plasmatici di TC sono stati associati a un calo significativo del rapporto HDL/LDL plasmatico sia nei topi maschi (del 29%) che nelle femmine (del 49%) alimentati con HFD (Fig. 3d). HCF1 M e HCF1 H hanno ridotto l'aumento indotto da HFD del livello plasmatico di TC nei topi maschi alimentati con HFD, con un aumento concomitante del rapporto plasmatico HDL/LDL (rispettivamente del 255% e 212% ), rispetto all'HFD non trattato controllo (Fig. 3c e 3d). HCF1 L e HCF1 M hanno soppresso l'aumento del livello di TC plasmatico indotto da HFD (rispettivamente del 22% e 32% ) nei topi femmine, senza che si osservasse alcun cambiamento nel rapporto plasmatico HDL/LDL (Fig. 3c e 3d).

Fig. 3 – Effetti dell'HCF1 sul contenuto plasmatico di glucosio e lipidi in topi alimentati con ND e HFD. I livelli di glucosio plasmatico, TG e TC sono stati misurati come descritto in Materiali e metodi. I dati sono stati espressi in percentuale di controllo rispetto al controllo ND [livello di glucosio plasmatico di controllo (mg/dL): maschio=91.1 ± 3,3, femmina=86.0 ± 2,3; livello plasmatico di controllo dei TG (mg/dl): maschio=52.0 ± 1,7, femmina=95,8 ± 4,1; livello di TC plasmatico di controllo (mg/dl): maschio {{20}},8 ± 4,3, femmina=118,6 ± 5,4]. I valori forniti sono medie ± SEM, con n=15. * Significativamente diverso dal controllo ND; # Significativamente diverso dal controllo HFD (p <>

3.4. Effetti di HCF1 sul contenuto lipidico epatico nei topi alimentati con ND e HFD

Il trattamento con HCF1 non ha modificato il livello epatico di TG e TC nei topi alimentati con ND (Fig. 4). Il consumo di HFD ha aumentato significativamente i livelli di TG epatici (rispettivamente del 108% e del 135%) nei topi maschi e femmine, rispetto al rispettivo controllo ND (Fig. 4a). HCF1 H, da un lato, ha soppresso l'aumento indotto dall'HFD del livello di TG epatico (del 54%) nei topi maschi, rispetto al controllo HFD non trattato (Fig. 4a). D'altra parte, HCF1 H ha ulteriormente aumentato il livello di TG epatico (del 14%) nei topi femmine alimentati con HFD, rispetto al rispettivo controllo HFD non trattato (Fig. 4a). L'HFD ha anche causato aumenti significativi dei livelli di TC epatico (rispettivamente del 48% e del 26%) nei topi maschi e femmine (Fig. 4b). Mentre HCF1 L e HCF1 H hanno soppresso significativamente l'aumento indotto da HFD (rispettivamente del 42 e 44 percento) nei livelli di TC epatico nei topi maschi alimentati con HFD, solo HCF1 H potrebbe produrre un effetto simile sui topi femmine alimentati con HFD, con il il grado di inibizione è del 62 percento (Fig. 4b).

Fig. 4 – Effetti di HCF1 sul contenuto lipidico epatico in topi alimentati con ND e HFD. I livelli epatici di TG e TC sono stati misurati come descritto in Materiali e metodi. I dati sono stati espressi in percentuale di controllo rispetto al controllo ND [livello di TG epatico di controllo ( g/mg proteina): maschio=31,7 ± 1,6, femmina=38,5 ± 1,7; controllare il livello di TC epatico ( g/mg di proteina): maschio=12,8 ± 0,4, femmina=17,9 ± 1,2]. I valori forniti sono medie ± SEM, con n {{20}}. * Significativamente diverso dal controllo ND; # Significativamente diverso dal controllo HFD (p <>

3.5. Effetti di HCF1 sulle attività degli enzimi metabolici nel muscolo scheletrico isolato da topi alimentati con ND e HFD

Il trattamento con HCF1 ha stimolato l'attività PFK nel muscolo scheletrico di topi maschi o femmine alimentati con ND, con l'effetto sui topi maschi più prominente (aumento del 55% vs 20% a 45 mg / kg) (Fig. 5a). Il consumo di HFD ha causato significative soppressione dell'attività PFK (rispettivamente del 16% e del 17%) nei topi maschi e femmine (Fig. 5a). HCF1 H ha invertito le soppressioni indotte da HFD dell'attività PFK (rispettivamente del 153% e del 100%) nei topi maschi e femmine alimentati con HFD (Fig. 5a). Sia il trattamento HFD che quello HCF1 non hanno prodotto effetti rilevabili sull'attività CS nel muscolo scheletrico di topi maschi o femmine rispetto al rispettivo controllo ND non trattato (Fig. 5b). HCF1 non ha prodotto alcun effetto sull'attività -HAD del muscolo scheletrico di topi maschi o femmine alimentati con ND (Fig. 5c). L'alimentazione HFD ha stimolato l'attività -HAD (rispettivamente del 47 e del 21 percento) nei topi maschi e femmine rispetto al controllo ND non trattato (Fig. 5c). HCF1, a tutte le dosi testate, ha inibito significativamente la stimolazione indotta da HFD nell'attività -HAD nei topi maschi, con un grado di inibizione del 62%, rispetto al controllo HFD non trattato (Fig. 5c). Il trattamento con HCF1 non ha prodotto alterazioni significative nell'attività -HAD nei topi femmine alimentati con ND e HFD (Fig. 5c). Mentre HCF1 H ha causato una diminuzione significativa dell'attività CPT (del 16%) del muscolo scheletrico nei topi maschi alimentati con ND (Fig. 5d), HCF1 L e HCF1 M hanno aumentato significativamente l'attività CPT del 24% e del 22% nei topi alimentati con ND topi femmine rispetto al controllo ND (Fig. 5d). L'alimentazione HFD ha anche aumentato l'attività CPT (rispettivamente del 13 percento e del 18 percento) nei topi maschi e femmine. HCF1 ha invertito l'aumento dell'attività CPT indotto dall'HFD, con un grado di soppressione del 72% nei topi maschi (a tutte le dosi testate) e del 100% nei topi femmine (HCF1 L) (Fig. 5d).

Fig. 5 – Effetti dell'HCF1 sull'attività enzimatica metabolica nel muscolo scheletrico isolato da topi alimentati con ND e HFD. Le attività del muscolo scheletrico PFK, CS, -HAD e CPT sono state misurate come descritto in Materiali e metodi. I dati sono stati espressi in percentuale di controllo rispetto al controllo ND [attività PFK di controllo (mU/mg proteina): maschio=19.5 ± 1,1, femmina=14.1 ± 0.7 ; controllare l'attività CS (proteina mU/mg): maschio=30,6 ± 1,3, femmina=36,8 ± 3,6; controllo -attività HAD (mU/mg proteina): maschio=13.5 ± 0.6, femmina=16.8 ± 0.6; controllare l'attività CPT (proteina mU/mg): maschio {{30}}.0 ± 0.3, femmina=3.0 ± { {39}}.1]. I valori forniti sono medie ± SEM, con n=15. * Significativamente diverso dal controllo ND; # Significativamente diverso dal controllo HFD (p <>

3.6. Effetti di HCF1 sull'RCR mitocondriale nel muscolo scheletrico del topo

L'HFD non ha prodotto alcun effetto rilevabile sull'RCR mitocondriale nel muscolo scheletrico del topo (Fig. 6). Disaccoppiamento mitocondriale indotto dal trattamento con HCF1 nel muscolo scheletrico del topo, come evidenziato da riduzioni significative dell'RCR mitocondriale sia nei soggetti alimentati con ND (61-69% nei maschi; 66% nelle femmine) che con HFD (73-78% nei maschi; 67 –70 percento nei topi femmine), rispetto ai rispettivi animali non trattati (Fig. 6).

Fig. 6 – Effetti dell'HCF1 sull'RCR mitocondriale nel muscolo scheletrico di topi maschi e femmine alimentati con ND e HFD. L'RCR mitocondriale è stato misurato come descritto in Materiali e metodi. I dati sono stati espressi in percentuale di controllo rispetto al controllo ND. I valori forniti sono medie ± SEM, con n=15. * Significativamente diverso dal controllo ND; # Significativamente diverso dal controllo HFD (p <>

3.7. Effetti di HCF1 sull'espressione di UCP3 nei mitocondri isolati dal muscolo scheletrico del topo

Sono stati anche esaminati gli effetti di HCF1 sull'espressione di UCP3 per esplorare il possibile coinvolgimento del disaccoppiamento mitocondriale nella perdita di peso indotta da HCF1-. Una 2- settimana di trattamento con HCF1 H ha aumentato significativamente il livello di UCP3 nei mitocondri isolati dal muscolo scheletrico del topo nei topi maschi, con l'entità della stimolazione del 67% rispetto al controllo non trattato (Fig. 7).

Fig. 7 – Effetti di HCF1 sull'espressione di UCP3 nei mitocondri isolati dal muscolo scheletrico del topo. I topi maschi sono stati somministrati per via intragastrica con HCF1 H per 14 giorni consecutivi. I mitocondri sono stati isolati come descritto in Materiali e metodi e l'espressione di UCP3 è stata misurata mediante analisi Western blot. I dati sono stati quantificati ed espressi in percentuale di controllo rispetto al controllo non trattato. I valori forniti sono medie ± SEM, con n=4. * Significativamente diverso dal controllo non trattato.

3.8. Confronti tra HCF1 e CT sui loro effetti sui topi alimentati con ND e HFD

Per comprendere meglio il meccanismo alla base dell'effetto di riduzione del peso offerto da HCF1, sono stati studiati anche gli effetti della CT, un sequestrante degli acidi biliari, sui topi maschi alimentati con ND e HFD. Sia CT che HCF1 hanno inibito completamente l'aumento di peso indotto da ND durante il corso della 8-settimana dell'esperimento. Entrambi i trattamenti hanno anche prodotto effetti soppressivi sull'aumento indotto da HFD del peso corporeo, dell'indice di grasso viscerale, della glicemia/TG/TC e del livello epatico di TG/TC, con l'effetto della TC più evidente (Tabella 1). A differenza dell'HCF1, che ha aumentato il rapporto plasmatico HDL/LDL solo nei topi alimentati con HFD, la TC ha aumentato significativamente il rapporto plasmatico HDL/LDL sia nei topi alimentati con ND che in quelli alimentati con HFD (rispettivamente del 58% e del 17% ), rispetto a il rispettivo controllo ND non trattato (Tabella 1). Inoltre, mentre l'HCF1 ha aumentato l'attività PFK nel muscolo scheletrico di entrambi i topi maschi alimentati con ND (54%) e HFD (14%) rispetto al controllo ND non trattato, la TC non ha prodotto alcun effetto rilevabile nei topi alimentati con ND e potrebbe solo ripristinare la diminuzione indotta da HFD nell'attività PFK al valore di controllo dei topi alimentati con ND (Tabella 1). Entrambi i trattamenti CT e HCF1 hanno invertito gli aumenti indotti da HFD nelle attività -HAD (rispettivamente del 61% e del 60%) e CPT (rispettivamente del 122% e del 72%) nei topi maschi (Tabella 1). Mentre HCF1 ha indotto il disaccoppiamento mitocondriale, come evidenziato da significative diminuzioni del valore RCR mitocondriale nei topi maschi alimentati con ND e HFD, la TC non ha prodotto alcun effetto rilevabile sul disaccoppiamento mitocondriale (Tabella 1).

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Da: "Cistanches Herba riduce l'aumento di peso nei topi obesi indotti da una dieta ricca di grassi, probabilmente attraverso il disaccoppiamento mitocondriale" diHoi Shan Wong et al.

---giornale degli alimenti funzionali 10 (2014) 292–304