I polisaccaridi di Cistanche Deserticola alleviano il declino cognitivo nei topi modello di invecchiamento ripristinando l'asse microbiota-cervello intestinale

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao 1,*, Bing Li 1,*, Hong Liu 1, Yajuan Tian 2, Chao Gu 1, Xiaoli Du 1, Ren Bu 1, Jie Gao 1, Yang Liu 1, Gang Li 1

ASTRATTO

Prove recenti suggeriscono che alterazioni dell'asse microbiota intestinale-cervello possono guidare il deterioramento cognitivo con l'invecchiamento. Nel presente studio, abbiamo osservato che la somministrazione prolungata di D-galattosio ai topi ha indotto declino cognitivo, disbiosi microbica intestinale, infiammazione periferica e stress ossidativo. In questo modello di declino cognitivo legato all'età,Cistanche deserticola polisaccaridi(CDPS) ha migliorato la funzione cognitiva nei topi trattati con D-galattosio ripristinando l'omeostasi microbica intestinale, riducendo così lo stress ossidativo e l'infiammazione periferica. Gli effetti benefici del CDPS in questi topi modello di invecchiamento sono stati aboliti attraverso l'ablazione del microbiota intestinale con antibiotici o l'immunosoppressione con ciclofosfamide. Il profilo metabolomico del siero ha mostrato che i livelli di creatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, acido urico e prolina erano tutti alterati nei topi modello di invecchiamento, ma sono stati ripristinati da CDPS. Questi risultati hanno dimostrato che CDPS migliora la funzione cognitiva in un modello di invecchiamento indotto da D-galattosio nei topi ripristinando l'omeostasi dell'asse microbiota intestinale-cervello, che allevia uno squilibrio aminoacidico, infiammazione periferica e stress ossidativo. CDPS mostra quindi il potenziale terapeutico per i pazienti con disturbi della memoria e dell'apprendimento, in particolare quelli legati alla disbiosi microbica intestinale.

Cistanche desertichepolisaccaridi

INTRODUZIONE

La somministrazione prolungata di D-galattosio (D-gal) e sali di berillio induce l'invecchiamento in modelli animali sperimentali e colture cellulari primarie in vitro e viene utilizzata per identificare i meccanismi alla base del naturale processo di invecchiamento [1–4]. Studi precedenti mostrano che il declino cognitivo nei topi modello di invecchiamento indotto dal D-galattosio è correlato alla riduzione dei livelli di proteine ​​del fattore di crescita nervoso (NGF) e all'aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nel cervello, che causano entrambi la degenerazione dei neuroni dell'ippocampo e riducono neurogenesi [3, 4]. Studi recenti hanno anche dimostrato che la composizione e il numero del microbiota intestinale umano cambiano significativamente durante il processo di invecchiamento [5].

Cistanche deserticheè un'erba che cresce principalmente nella regione desertica nord-occidentale della Cina e viene utilizzata nella medicina tradizionale cinese. È comunemente noto come "ginseng del deserto". Gli estratti di Cistanche deserticola contengono diversi composti farmacologicamente attivi, inclusi glicosidi feniletanoidi, iridoidi, lignosio, oligosaccaridi, polisaccaridi e aminoacidi; questi composti sono associati a proprietà antinfiammatorie, antiossidanti, anti-senescenti, neuroprotettive e immunomodulatorie [6, 7]. Ad esempio, i polisaccaridi estratti dalla Cistanche deserticola sono stati usati nella medicina tradizionale cinese per curare il cancro del colon-retto [8]. Un'ampia gamma di polisaccaridi debolmente tossici con bioattività utili è stata isolata da diversi organismi, come il polisaccaride Chuanqiong, il polisaccaride Ganoderma lucidum e il polisaccaride Lycium barbarum [9-11]. CDA-

0.05 è un galattoglucano isolato da Cistanche deserticola che promuove la crescita di numerosi batteri intestinali benefici, tra cui diverse specie di Bacteroides e Lactobacillus [12].

I meccanismi alla base del normale processo di invecchiamento sono anche implicati in diverse malattie umane come disturbi neurodegenerativi, aterosclerosi coronarica, diabete di tipo 2 (T2DM) e ipertensione [13, 14]. Studi recenti hanno dimostrato che i cambiamenti nella flora intestinale svolgono un ruolo significativo nell'invecchiamento umano [15]. Diversi studi hanno dimostrato che la somministrazione prolungata di D-galattosio in topi e ratti sperimentali imita il normale processo di invecchiamento ed è un modello utile per studiare i fenotipi legati all'invecchiamento come il declino cognitivo [16]. Inoltre, i topi modello di invecchiamento indotto da D-galattosio mostrano cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale [17]. Pertanto, abbiamo ipotizzato che i cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale possano causare un declino cognitivo nei topi modello di invecchiamento indotto dal D-galattosio e abbiamo studiato se i Cistanche deserticola polysaccharides (CDPS) possono alleviare il declino cognitivo ripristinando la disbiosi del microbiota intestinale.

Cistanche desertiche

RISULTATI

I topi modello di invecchiamento indotto da D-galattosio dimostrano declino cognitivo e disbiosi microbica intestinale

Abbiamo analizzato le prestazioni comportamentali dei topi wild-type (WT) e di quelli trattati con 150 mg di D-gal per Kg di peso corporeo per 2 mesi (modello o Mod) utilizzando nuovi test di riconoscimento di oggetti e Morris water maze (MWM). I valori dell'indice preferenziale nel nuovo test di riconoscimento degli oggetti sono stati significativamente ridotti nei topi del gruppo Mod rispetto ai topi del gruppo WT (Figura 1A, 1B). I risultati del test MWM hanno mostrato che il tempo di latenza di fuga dopo il sesto giorno era significativamente aumentato nel gruppo Mod rispetto al gruppo WT (Figura 1C, 1D). Inoltre, gli attraversamenti della piattaforma target e i tempi di nuoto all'interno del quadrante target sono stati significativamente ridotti nel gruppo Mod rispetto al gruppo WT (Figura 1E, 1F). Questi risultati hanno dimostrato un calo significativo delle capacità di apprendimento e memoria dei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal.

Abbiamo quindi analizzato le differenze nell'abbondanza e nella composizione dei phyla, dei generi e delle specie microbiche intestinali nei campioni fecali dei gruppi di topi Mod e WT utilizzando i dati di sequenziamento dell'RNA ribosomiale (rRNA) 16S da campioni fecali. La flora intestinale predominante nei topi del gruppo WT e Mod era Firmicutes e Bacteroides. Tuttavia, l'abbondanza di Bacteroides è stata significativamente ridotta e l'abbondanza di Firmicutes è stata notevolmente aumentata nel gruppo Mod rispetto al gruppo WT (Figura 2A). Successivamente, abbiamo eseguito l'analisi discriminante lineare (LDA) per determinare i punteggi della dimensione dell'effetto LDA (LEfSe) seguiti dai test di Kruskal-Wallis e Wilcoxon per valutare l'abbondanza relativa di diversi taxa nei topi del gruppo WT e Mod. I risultati LDA sono mostrati nella Figura 2B. Inoltre, abbiamo costruito cladogrammi che mostrano l'arricchimento differenziale di vari generi e specie appartenenti ai Bacteriodes e Firmicutes phyla nei gruppi WT e modello (Figura 2C). Nel complesso, i nostri risultati hanno dimostrato capacità cognitive compromesse e disbiosi microbica intestinale nei topi modello di invecchiamento indotto da D-galattosio.

Il trattamento con CDPS migliora le capacità cognitive nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal

Abbiamo analizzato se il trattamento con CDPS allevia il declino cognitivo nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal. Durante

2 mesi di somministrazione, il peso corporeo è stato misurato a giorni alterni. I pesi corporei del modello e dei gruppi di topi CDPS erano simili (Figura 3A). Condurre esperimenti comportamentali dopo l'ultima dose. Il riconoscimento di nuovi oggetti e i risultati del test del labirinto d'acqua di Morris hanno mostrato che la memoria a breve termine era significativamente più alta nei gruppi di topi CDPS rispetto al gruppo modello di topi; la memoria a lungo termine nel gruppo di topi CDPS era più alta ma statisticamente insignificante rispetto al gruppo modello di topi (Figura 3B, 3C). Ciò ha suggerito che il trattamento con CDPS ha abrogato la perdita della memoria di riconoscimento degli oggetti a breve termine nei topi trattati con D-gal.

L'apprendimento spaziale e la memoria di questi topi sono stati valutati dal test del labirinto d'acqua Morris e i risultati hanno mostrato che i tempi di latenza di fuga del gruppo di topi CDPS erano paragonabili al gruppo di topi WT e significativamente più brevi rispetto ai topi del gruppo Mod (Figura 3D ). Inoltre, i tempi di latenza di fuga erano significativamente inferiori al sesto giorno dopo l'amministrazione del CDPS rispetto al gruppo modello (Figura 3E). Il tempo di nuoto all'interno del quadrante target era significativamente più alto nei gruppi CH e CM rispetto al gruppo modello. Il gruppo CL è superiore al gruppo modello ma non ha significatività statistica (Figura 3F). Inoltre, il numero di attraversamenti di piattaforme era significativamente più alto nei gruppi CM e CL rispetto al gruppo modello. Tuttavia, il gruppo CH è superiore al gruppo modello e non ha significatività statistica (Figura 3G). Questi risultati hanno dimostrato che il trattamento con CDPS ha migliorato l'apprendimento spaziale e la memoria nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal.

Il trattamento con CDPS ripristina l'omeostasi della composizione del microbiota intestinale nei topi modello che invecchiano con D-galattosio

Monosaccaridi e polisaccaridi sono i nutrienti essenziali necessari per la crescita dei batteri [18-21]. È stato anche riferito che il CDPS regola la composizione del microbiota intestinale [22]. Pertanto, abbiamo analizzato se i trattamenti CDPS hanno alleviato la disbiosi microbica intestinale nei topi del gruppo modello valutando i dati di sequenziamento dell'rRNA 16S di campioni di feci dai gruppi di topi WT, modello e CDPS.

Innanzitutto, abbiamo calcolato gli indici di diversità alfa per valutare la ricchezza complessiva del microbiota fecale e la differenza strutturale tra questi gruppi. Abbiamo analizzato gli indici di diversità alfa (-diversità) come specie osservate, valori degli indici Shannon, Chao 1, ACE e Simpson per determinare i cambiamenti nella composizione di varie specie batteriche nei campioni di feci di diversi gruppi murini. Gli indici -diversity (specie osservate, indici Shannon, Chao 1, ACE e Simpson) erano più alti nei gruppi di topi WT e CDPS rispetto al gruppo modello, ma la significatività statistica è stata osservata solo per i valori dell'indice Chao 1 tra il CM gruppo e gruppo Mod. Ha indicato che la somministrazione con CDPS aumenta la ricchezza del microbioma (Figura 4A-4E). Successivamente, abbiamo analizzato gli indici di diversità per identificare le differenze nelle specie microbiche intestinali tra i gruppi di topi WT, modello e CDPS utilizzando lo Scaling multidimensionale non metrico (NMDS), l'analisi delle coordinate principali (PCoA) e l'analisi dei componenti principali ( PCA). La PCA ha mostrato variazioni nella composizione microbica intestinale dei topi del gruppo modello durante il processo di invecchiamento, inclusa la riduzione delle dimensioni e il mantenimento di modelli e tendenze (Figura 4F). Le differenze nel microbiota fecale tra i gruppi WT, modello e CDPS sono state identificate in base alla PCoA delle distanze UniFrac non ponderate per i geni 16S rRNA (Figura 4G). L'analisi del clustering ha mostrato differenze significative in NMDS tra il gruppo modello e i gruppi WT e CDPS (Figura 4H).

Abbiamo valutato i primi 10 phyla del microbiota intestinale e abbiamo scoperto che l'abbondanza dei Bacteroides phyla era significativamente più alta nel gruppo CH, CM e CL rispetto al gruppo modello (Figura 4I). Ciò ha suggerito che CDPS ripristinasse l'omeostasi del microbiota intestinale nei topi trattati con D-gal. I cladogrammi hanno mostrato un arricchimento differenziale di vari generi e specie appartenenti a Bacteriodes e Firmicutes phyla nei gruppi WT, modello e CDPS (Figura 4J). Come mostrato nelle mappe di calore, i trattamenti CDPS hanno ridotto le abbondanze relative di Termoplasmati, Bacilli, Actinobacteria non identificati, Fusobacteriia ed Elusimicrobi non identificati e hanno aumentato le abbondanze relative di Metanobatteri, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, non identificati{5}}Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae , Erisipelotrichia e{6}}Cianobatteri non identificati rispetto al gruppo modello (Figura 4K). Questi risultati hanno dimostrato che il trattamento con CDPS ha ripristinato significativamente l'omeostasi del microbiota intestinale nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal.

Il trattamento con CDPS allevia la neurodegenerazione nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal riducendo lo stress ossidativo

Successivamente abbiamo analizzato gli effetti della CDPS sull'infiammazione analizzando i livelli sierici delle citochine proinfiammatorie (IL-2 e TNF-) e delle citochine antinfiammatorie (IL-4 e IL{5}} ) in diversi gruppi di topi. I livelli sierici di IL-2 e TNF- erano significativamente più bassi e i livelli sierici di IL-4 e IL{9}} erano significativamente più alti nel gruppo CH, CM e CL rispetto al modello gruppo. È dimostrato che CDPS ha effetti antinfiammatori (Figura 5A-5D).

Lo stress ossidativo è causato dall'aumento della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) ed è uno dei principali fattori che promuovono l'invecchiamento [23]. Pertanto, abbiamo analizzato gli effetti del CDPS sullo stress ossidativo nel modello murino di invecchiamento indotto da D-gal valutando i livelli sierici dell'enzima antiossidante, SOD e del prodotto di perossidazione lipidica, malondialdeide (MDA). I livelli sierici di MDA erano significativamente più alti e i livelli sierici di SOD erano significativamente ridotti nel gruppo Mod rispetto al gruppo WT, ma il trattamento con CDPS ha invertito questi effetti (Figura 5E, 5F). Questi risultati hanno dimostrato che lo stress ossidativo era elevato nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal, ma era ridotto dal trattamento con CDPS.

Inoltre, abbiamo valutato i livelli di stress ossidativo nei tessuti cerebrali analizzando i livelli del prodotto proteico ossidato avanzato (AOPP), della perossidazione lipidica diretta (LPO) e dell'MDA, nonché le attività di enzimi antiossidanti come la glutatione perossidasi (GSH-Px ) e la superossido dismutasi (SOD) negli omogenati del tessuto cerebrale. Il cervello dei topi del gruppo Mod ha mostrato attività significativamente ridotte di SOD e GSH-PX e livelli significativamente aumentati di AOPP, LPO e MDA rispetto al gruppo WT, ma questi effetti sono stati invertiti nel gruppo CH, CM e CL (Figura 6A– 6E).

Inoltre, abbiamo eseguito la colorazione istologica della sezione cerebrale con colorazioni H&E e Nissl per valutare gli effetti protettivi del CDPS sul cervello dei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal. I topi del gruppo Mod hanno mostrato una significativa riduzione del numero e del volume neuronale, aumento del divario tra i neuroni, disposizione irregolare dei neuroni e picnosi nucleare nella regione dell'ippocampo CA1 rispetto al gruppo WT, ma questi cambiamenti patologici sono stati significativamente ridotti dai trattamenti CDPS ( figura 6F). Questi risultati hanno dimostrato che i trattamenti con CDPS hanno ridotto significativamente lo stress ossidativo e la patologia cerebrale nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal.

Il trattamento con CDPS riduce l'infiammazione periferica e lo stress ossidativo mantenendo l'omeostasi microbica intestinale nei topi modello indotti da D-gal

Successivamente, abbiamo analizzato se i cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale fossero associati a un aumento dell'infiammazione periferica e dello stress ossidativo durante l'invecchiamento. A tal fine, abbiamo utilizzato un cocktail a triplo antibiotico (gruppo ABX) o ciclofosfamide (gruppo Cy; vedere anche Materiali e metodi) per ablare il microbiota intestinale o indurre l'immunosoppressione nei topi modello di invecchiamento trattati con CDPS. Il trattamento antibiotico ha abrogato gli effetti benefici del trattamento CDPS nei topi modello di invecchiamento. Abbiamo osservato alterazioni dell'apprendimento e della memoria (Figura 7A) e alterazioni nella composizione del microbiota intestinale (Figura 7B, 7C) nei topi del gruppo ABX rispetto al gruppo trattato con CDPS. I risultati di cui sopra indicano che anche la somministrazione di CDPS non può aumentare l'apprendimento e la capacità di memoria dei topi dopo aver modificato la flora intestinale. Inoltre, abbiamo osservato un aumento dei livelli di citochine pro-infiammatorie nel cervello e nel siero dei topi del gruppo ABX rispetto al gruppo CDPS (Figura 7D-7N). I risultati del gruppo ABX e del gruppo CY hanno mostrato che dopo la distruzione della flora intestinale e della funzione immunitaria, anche la somministrazione di CDPS non poteva migliorare l'apprendimento e la capacità di memoria dei topi. Questi risultati hanno suggerito che il trattamento con CDPS ha ridotto l'infiammazione periferica, lo stress ossidativo e il declino cognitivo nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal, prevenendo la disbiosi intestinale.

Abbiamo quindi utilizzato il farmaco immunosoppressore, la ciclofosfamide [24] per determinare il ruolo dell'infiammazione negli effetti benefici della CDPS. I topi CDPS trattati con ciclofosfamide (gruppo Cy) hanno mostrato capacità di apprendimento e memoria ridotte, alterazioni nella composizione del microbiota intestinale e livelli aberranti di citochine pro e antinfiammatorie nel cervello e nel siero rispetto ai topi wild-type e del gruppo CDPS. Tuttavia, non vi è alcun significato rispetto al modello e al gruppo ABX. (Figura 7A–7N). Questi dati dimostrano che le alterazioni nella composizione del microbiota intestinale aumentano l'infiammazione periferica nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal.

CDPS previene l'invecchiamento indotto da D-gal regolando il metabolismo degli aminoacidi

Il sistema immunitario dell'ospite è influenzato dai metaboliti generati dal microbiota intestinale [25]. I metaboliti fecali rappresentano una lettura funzionale del metabolismo microbico intestinale e della composizione microbica intestinale [26]. Inoltre, i metaboliti del microbiota intestinale entrano nella circolazione sanguigna e influiscono sul metabolismo e sulla salute dell'ospite [26, 27]. Un totale di 1058 metaboliti sono stati identificati in campioni di siero di topi fWT, Mod e CDPS. Quindi, abbiamo analizzato questi metaboliti utilizzando BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e Human Metabolome Database (HMDB) e abbiamo scoperto che 65 metaboliti erano espressi in modo differenziale nel gruppo Mod rispetto al gruppo WT. Inoltre, abbiamo scoperto che i livelli di 8 metaboliti (creatinina, valina, L-(-)-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, acido urico, prolina e fenilalanina) differivano significativamente tra i gruppi WT, Mod e CDPS . L'analisi dell'arricchimento del percorso di questi 8 metaboliti utilizzando MetaboAnalyst [28, 29] ha mostrato che questi metaboliti erano correlati al metabolismo di arginina, istidina, arginina, prolina e purina (Figura 8A, 8B). 7 diversi metaboliti del gruppo MOD e del gruppo CDPS nel gruppo WT.

Abbiamo quindi analizzato se i cambiamenti nel metabolismo degli aminoacidi fossero correlati ad alterazioni nella composizione del microbiota intestinale. Abbiamo osservato che 7 diversi metaboliti dei gruppi WT, Mod e CDPS (creatinina, valina, L-(-)-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, acido urico e prolina) erano significativamente ridotti in ABX, Cy, e gruppi Mod rispetto ai gruppi WT e CDPS. Inoltre, non vi è alcun significato tra i gruppi ABX e Cy (Figura 8C). Infine, al fine di esplorare, esiste una correlazione tra il metabolismo differenziale e altre malattie legate all'invecchiamento. Abbiamo analizzato la correlazione tra questi sette metaboliti espressi in modo differenziale e le malattie umane utilizzando il database MetaboAnalyst e abbiamo scoperto che questi metaboliti erano associati al morbo di Alzheimer (p=0.00173; Figura 8D, 8E). Nel complesso, questi dati hanno suggerito che CDPS protegge dall'invecchiamento indotto da D-gal regolando il metabolismo degli aminoacidi.

DISCUSSIONE

Un progressivo declino della funzione cognitiva è una caratteristica dell'invecchiamento. Studi precedenti hanno mostrato che il trattamento con CDPS ha migliorato significativamente l'apprendimento e la memoria nei topi modello di invecchiamento [30-33]. In questo studio, abbiamo dimostrato che il trattamento con CDPS ha migliorato la funzione cognitiva inibendo l'infiammazione periferica e lo stress ossidativo attraverso il ripristino dell'omeostasi microbica intestinale nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal (Figura 9). I ratti Sprague-Dawley alimentati con polisaccaridi Cistanche hanno mostrato una maggiore crescita di batteri intestinali benefici e una maggiore diversità microbica intestinale [34]. CDA-0.05, un polisaccaride neutro di Cistanche, ha migliorato la crescita dei lattobacilli probiotici [22]. Questi dati hanno suggerito che i polisaccaridi Cistanche migliorassero l'omeostasi dei batteri intestinali.

In questo studio, abbiamo dimostrato che CDPS ha effetti antinfiammatori e migliora la capacità cognitiva dei topi modello di invecchiamento modulando l'abbondanza di generi batterici intestinali come Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria. Pertanto, i CDP possono essere terapeuticamente utili per le malattie legate all'invecchiamento rimodellando la composizione del microbiota intestinale [35, 36]. Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato che i livelli di citochine infiammatorie nel siero e nel colon sono associati all'abbondanza relativa di generi batterici come Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria [37, 38]. Inoltre, la composizione microbica intestinale regola la funzione cerebrale modulando i livelli circolanti di diverse citochine [39-43]. I nostri risultati hanno mostrato che il trattamento con CDPS ha ridotto l'abbondanza relativa di Termoplasmati, Bacilli, Actinobacteria non identificati, Fusobacteriia ed Elusimicrobia non identificato e aumentato l'abbondanza relativa di Metanobatteri, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae non identificati, Erisipelotrichia e{9}}cianobatteri non identificati.

I metaboliti microbici intestinali vengono rilasciati nel flusso sanguigno e regolano la salute e il metabolismo dell'ospite [26, 27]. I metaboliti microbici intestinali possono essere stimati valutando la composizione dei metaboliti fecali, che cambia con le alterazioni nella composizione dei microbi intestinali [44]. Studi recenti hanno dimostrato che i livelli plasmatici di citrullina, prolina, arginina, asparagina, fenilalanina e treonina sono associati a malattie neurodegenerative tra cui il morbo di Alzheimer [45, 46]. Il nostro studio ha mostrato che i livelli sierici di creatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, acido urico e prolina erano associati all'invecchiamento indotto da D-gal nei topi.

Le braccia innate e adattive del sistema immunitario svolgono un ruolo significativo nel mantenimento dell'omeostasi microbico ospite nella superficie luminale intestinale [47]. Il microbiota intestinale svolge anche un ruolo significativo nella regolazione del sistema nervoso centrale (SNC) e dell'immunità rilasciando citochine e metaboliti nel flusso sanguigno [48, 49]. Le citochine pro-infiammatorie svolgono un ruolo chiave in diverse malattie neurodegenerative [50-52]. Ad esempio, la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e il glaucoma sono associati all'accumulo extracellulare di amiloide (A ) e alla deposizione intracellulare di tau iperfosforilata (p-tau) e ferro nelle cellule gangliari retiniche (RGC) [44]. Inoltre, l'infiammazione gioca un ruolo significativo nella patogenesi associata al glaucoma [53]. La disabilità visiva è un sintomo precoce della malattia di Alzheimer (AD) e si manifesta prima dell'inizio del declino cognitivo [54]. Il nostro studio ha dimostrato che il CDPS protegge dal declino cognitivo e dall'infiammazione periferica mantenendo l'omeostasi del microbiota intestinale.

Ci sono diverse limitazioni a questo studio. In primo luogo, la relazione tra il metabolismo degli aminoacidi e la composizione del microbiota intestinale non è ben nota. In secondo luogo, la composizione e la struttura molecolare del CDPS non sono note. Pertanto, sono necessari studi futuri per esplorare ulteriormente il ruolo normativo del CDPS nell'alleviare l'AD attraverso l'asse di segnalazione del microbiota intestinale-cervello.

In conclusione, il nostro studio ha dimostrato che il CDPS ha migliorato l'abilità cognitiva nei topi modello di invecchiamento indotto da D-gal ripristinando l'omeostasi del microbiota intestinale, ripristinando così lo squilibrio degli aminoacidi, l'infiammazione periferica e lo stress ossidativo. Questi risultati suggeriscono che il CDPS è un potenziale terapeutico per i pazienti con disturbi dell'apprendimento e della memoria, in particolare quelli associati alla disbiosi intestinale.

MATERIALI E METODI

Preparazione di CDPS

Circa 1.0 Kg di Cistanche deserticola pulita sono stati essiccati all'aria in forno a 40 gradi C e polverizzati in polvere grezza. La polvere è stata estratta in etanolo caldo per 3 ore. Il residuo è stato filtrato attraverso una garza per rimuovere il filtrato e quindi diluito con acqua (8X) e fatto rifluire in sequenza per 2 ore, 1,5 ore e 1 ora a 90 gradi C. Ad ogni momento, la soluzione è stata centrifugata per separare il surnatante e combinato con il filtrato bruno-rosso. Quindi, il filtrato è stato concentrato a pressione ridotta, raffreddato a temperatura ambiente, aggiunto lentamente al 95 percento di etanolo (3X) e lasciato riposare a 4 gradi C per 24 ore. Quindi, la soluzione è stata centrifugata a 6000 giri/min per 20 minuti a 4°C. Il precipitato è stato raccolto dopo aver ripetuto tre volte l'estrazione dell'acqua e la precipitazione dell'alcol. Il precipitato è stato ricostituito in acqua, deproteinizzato, dializzato e liofilizzato per ottenere il polisaccaride Cistanche deserticola grezzo (CDP). Il contenuto di polisaccaridi era superiore al 90 percento come valutato mediante spettrofotometria ultravioletta.

Raggruppamento e trattamenti degli animali

Topi Kunming maschi di otto settimane (licenza SCXK n.2019-0010) sono stati acquistati da SPF Biotechnology Co. Ltd (Pechino, Cina), alloggiati in una stanza con luce e temperatura controllata e nutriti con cibo e acqua. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università medica della Mongolia interna. Gli esperimenti sono stati condotti secondo la Guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

Dopo 1 settimana di adattamento al nuovo ambiente, 120 topi sono stati divisi nei seguenti 7 gruppi: (1) wild-type control (WT); gruppo di modelli (150 mg/Kg/giorno D-gal; Mod); (3) CH: D-gal più 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal più 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal più 25 mg/kg CDPS; (6) Gruppo ABX: antibiotici più D-gal più 50 mg/Kg CDPS; (7) Gruppo Cy: ciclofosfamide più D-gal più 50 mg/kg CDPS.

I topi del modello, dei gruppi ABX, Cy e CDPS hanno ricevuto iniezioni sottocutanee di soluzione salina disciolta

150 mg/kg D-gal al giorno per 2 mesi. Il gruppo WT è stato iniettato per via sottocutanea con uguale volume di soluzione salina per 2 mesi. I topi del gruppo CDPS sono stati inoltre somministrati giornalmente con iniezioni intragastriche contenenti 1{{10}}0 mg/kg, 50 mg/Kg o 25 mg/Kg di CDPS per 2 mesi . I topi del gruppo ABX hanno ricevuto acqua potabile con 0,1 mg/mL di ampicillina e 0,5 mg/mL di streptomicina per 2 mesi oltre alle iniezioni di D-gal e CDPS. Prima di somministrare D-gal, i topi hanno ricevuto iniezioni contenenti 0,1 mg/mL di ampicillina, 0,5 mg/mL di streptomicina e 0,1 mg/mL di colistina per 7 giorni nel gruppo ABX. I topi del gruppo Cy hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali di 20 mg/Kg di ciclofosfamide a giorni alterni (qod) per 2 mesi oltre alle iniezioni giornaliere di D-gal e CDPS.

Nuovo test di riconoscimento di oggetti

Condurre esperimenti comportamentali dopo l'ultima dose. Il test di riconoscimento degli oggetti prevedeva fasi di familiarizzazione, formazione e test. Durante la fase di familiarizzazione, i topi sono stati abituati in una camera di prova vuota per 10 minuti per due giorni. Quindi, il terzo giorno (giorno di allenamento), due oggetti della stessa dimensione, forma e colore (A1 e A2) sono stati posti alle estremità opposte della camera. A ogni topo sono stati quindi concessi 10 minuti per esplorare i due oggetti simili. Dopo 1-ora (il terzo giorno) e 24-ora (il quarto giorno) intervalli tra l'allenamento e il test, uno degli oggetti simili (A1 o A2) è stato sostituito con una B o C oggetto diverso per dimensioni, colore e forma il giorno del test. Durante la fase di test, ciascun mouse è stato testato per 5 minuti ed è stato calcolato l'indice preferenziale per determinare la memoria del riconoscimento di un nuovo oggetto (B o C) utilizzando la seguente formula: Indice preferenziale=Tempo sull'oggetto B o C/( Tempo sull'oggetto B o C più Tempo sull'oggetto A)×100 percento.

Test del labirinto d'acqua di Morris

Il test del labirinto d'acqua Morris è stato eseguito in una piscina rotonda con una profondità di 45 cm e un diametro di 90 cm. Il protocollo descritto da Ruediger S, et al. (2011) [55] e Wood RA, et al. (2018) [56] è stato impiegato qui. La profondità dell'acqua nella piscina era di 30 cm e la temperatura dell'acqua era di 20 ± 1 grado C. La piattaforma aveva un diametro di 6 cm e 1 cm sott'acqua. Il tempo per la formazione e il test era di 60 s ciascuno. Per la formazione, abbiamo condotto quattro prove di 60 s ciascuna con una piattaforma nascosta ogni giorno per cinque giorni continui. Se la piattaforma non è stata scoperta dai topi in 60 s, sono stati guidati sulla piattaforma e posizionati sulla piattaforma per 5 s. Durante la fase di test, sono stati registrati e analizzati la latenza per raggiungere la piattaforma nascosta nelle sessioni di addestramento e di prova della sonda, il numero di attraversamenti sulla posizione della piattaforma rimossa e il tempo trascorso nel quadrante di destinazione (piattaforma).

Saggi ELISA

I livelli sierici di citochine pro-infiammatorie come IL-2(), IL-4, IL-10 e TNF- sono stati analizzati per ciascun gruppo di topi utilizzando kit ELISA acquistati da Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, Cina) secondo le istruzioni del produttore. L'attività di un enzima antiossidante, la superossido dismutasi (SOD), e i livelli del prodotto di perossidazione lipidica, la malondialdeide (MDA), nel siero di ciascun gruppo di topi sono stati analizzati mediante kit di analisi acquistati dal Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina) . I livelli di prodotti proteici di ossidazione avanzata (AOPP) nei campioni di ippocampo murino sono stati stimati utilizzando il kit ELISA di Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, Cina) secondo le istruzioni del produttore.

Stima dello stress ossidativo nei cervelli murini

Abbiamo omogeneizzato 10 0 mg di tessuto dell'ippocampo con 0,9 ml di soluzione salina raffreddata con ghiaccio e l'omogeneizzato è stato centrifugato a 12000 rpm per 30 minuti a 4 gradi C. Il contenuto proteico nel surnatante è stato analizzato utilizzando il kit BCA Protein Assay ( Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina). I livelli di perossidazione lipidica (LPO) e malondialdeide (MDA) e le attività di GSH-Px e SOD nei campioni di ippocampo sono stati analizzati mediante colorimetria utilizzando kit del Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanchino, Cina) secondo le istruzioni del produttore.

Composizione del microbiota intestinale

Campioni fecali sono stati raccolti da tutti i topi e immediatamente conservati a -80 grado C. La regione V3 più V4 del gene 16S rRNA è stata sequenziata utilizzando Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Pechino, Cina) e analizzata utilizzando il Piattaforma aperta QIIME per determinare i profili del microbiota intestinale.

Analisi LC/MS dei metaboliti sierici

I campioni di siero sono stati incubati per 10 minuti con metanolo prerefrigerato in un rapporto di 1: 3 per precipitare le proteine. I campioni sono stati centrifugati a 12000 giri/min per 15 minuti a 4 gradi C. I surnatanti sono stati analizzati mediante cromatografia liquida a risoluzione rapida Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 e spettro di massa QExactive. Le condizioni cromatografiche sono mostrate nella Tabella 1. Gli analiti sono stati separati in una colonna cromatografica XBridge BEH Amide (2,1 × 100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA) utilizzando lo 0,1 percento di acido formico e acetonitrile come fasi mobili A e B, rispettivamente. La portata è stata fissata a 0,4 ml/min, il volume di iniezione è stato di 5 µl e la temperatura della colonna è stata fissata a 25 gradi C (Tabella 1). I segnali dello spettro di massa sono stati ottenuti utilizzando le modalità di scansione di ioni positivi e negativi. La tensione dello spray ionico e altri parametri MS specifici sono mostrati nella Tabella 2.

analisi statistica

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 e pag< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">

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