Cistanche Tubulosa induce l'apoptosi mediata da specie di ossigeno reattivo delle cellule di cancro del colon umano primario e metastatico

ASTRATTO

Il cancro del colon è il terzo tumore più comune al mondo. Le terapie convenzionali hanno mostrato un'efficacia moderata con gravi effetti avversi, pertanto vi è un urgente bisogno di alternative più sicure. In questo studio, Cistanche tubulosa, il nome locale Thanoon, è stata considerata una potenziale strategia fitoterapica a causa del suo noto alto potenziale terapeutico nella medicina tradizionale e dell'ampia abbondanza nella regione del Medio Oriente. I composti bioattivi sono stati estratti dalla polvere di Cistanche tubulosa e testati per le loro proprietà antitumorali contro quattro linee cellulari di cancro del colon, incluse due derivate dal tumore primario (CaCo2 e HCT116) e due derivate dal sito metastatico (LoVo e SW620).

È stato anche studiato l'effetto di Cistanche tubulosa sull'induzione dell'apoptosi e sull'omeostasi redox cellulare. Cistanche tubulosa ha mostrato una concentrazione e un'inibizione della proliferazione dipendente dal tempo di tutte le linee cellulari tumorali testate di oltre il 60% dopo 72 ore di trattamento con 1 mg/mL di estratto grezzo. L'inibizione della proliferazione è stata contrassegnata dall'induzione dell'apoptosi, dalla produzione di specie reattive dell'ossigeno intracellulare e dai superossidi mitocondriali. Questi dati suggeriscono che Cistanche tubulosa è un candidato promettente per la terapia additiva antitumorale del colon. Questo è il primo studio che mostra la bioattività antitumorale di Cistanche tubulosa contro le cellule tumorali del colon.

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Abbreviazioni:

7-AAD, 7-Ammino-Actinomicina D; CTE, estratto di Cistanche tubulosa; EMEM, mezzo minimo essenziale di Eagle; FBS, siero bovino fetale; DCF, 2,7-diclorofluoresceina; DCFH-DA, 2,7- diclorodiidrofluoresceina diacetato; DMEM, mezzo di aquila modificato di Dulbecco; DMSO, dimetilsolfossido; MTT, 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio; PE, ficoeritrina; RFU, unità di fluorescenza relativa; ROS, specie reattive dell'ossigeno

INTRODUZIONE

Il cancro del colon-retto è uno dei tumori più comuni in tutto il mondo (Brenner et al., 2014) e la sua incidenza è in costante aumento con una stima di 2,4 milioni di casi nel 2035, a causa della dieta e dello stile di vita moderni, insieme alla ridotta attività fisica. Gli sforzi attuali non sono sufficienti per combattere l'attuale epidemia di cancro del colon-retto e pertanto sono necessari nuovi approcci per una prevenzione e un trattamento efficaci, compresi i cambiamenti nello stile di vita in combinazione con interventi alternativi più sicuri come la fitoterapia (Weidner et al., 2015). La fitoterapia, l'uso di piante medicinali per curare le malattie, è stata una parte inevitabile dell'antica storia umana. Le piante medicinali sono state a lungo utilizzate come fonti di trattamento alternative per i tumori, rappresentando oltre il sessanta per cento degli agenti antitumorali utilizzati nella medicina convenzionale (Balunas e Kinghorn, 2005; Saibu et al., 2015). Alcuni degli esempi più noti includono estratti di Catharanthus roseus G. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) e Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg e Newman, 2005; da Rocha et al., 2001). È stato dimostrato che diversi estratti di erbe e sostanze fitochimiche esercitano effetti antitumorali nel cancro del colon-retto attribuiti all'induzione della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e all'apoptosi associata delle cellule tumorali, come nel caso degli estratti di Melissa officinalis (Weidner et al., 2015).

Tra i candidati fitoterapeutici, Cistanche tubulosa, una pianta del deserto parassita delle Orobanchaceae (Jiang et al., 2009) ampiamente distribuita nelle regioni aride e semi-aride dell'Africa, dell'Asia e della regione mediterranea, ha dimostrato di possedere preziose proprietà medicinali. La cistanche tubulosa è stata ampiamente utilizzata nella medicina tradizionale e si suggerisce che abbia effetti curativi nella carenza renale, nella leucorrea morbosa, nella metrorragia, nell'infertilità femminile e nella costipazione senile (Jiang et al., 2009). Oltre ai suoi usi medicinali tradizionali, importanti le proprietà di Cistanche Tubulosa sono state intensamente studiate durante l'ultimo decennio, compresi gli effetti vasorilassanti (Yoshikawa et al., 2006), epatoprotettivi (Morikawa et al, 2010), anti-iperglicemici e ipolipemizzanti (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa è stata anche suggerita come un potente potenziatore del sistema immunitario, un promotore della formazione ossea e un agente antietà e antifatica (Xu et al., 2014). Inoltre, l'estratto di Cistanche tubulosa ha dimostrato di bloccare la deposizione di amiloide nel modello di malattia di Alzheimer (Wu et al., 2015). Nonostante i suoi vari usi terapeutici, l'effetto di Cistanche Tubulosa come potenziale agente antitumorale non è stato ancora studiato.

Nel presente lavoro, abbiamo studiato l'effetto antitumorale di Cistanche Tubulosa su due linee cellulari di cancro del colon primarie e due metastatiche e i potenziali meccanismi alla base di questo effetto.

MATERIALI E METODI

Raccolta e preparazione dell'estratto vegetale, i campioni di Cistanche tubulosa sono stati raccolti in un'area desertica del Qatar nel 2014 e l'autenticità della pianta è stata confermata da un erbologo. I campioni di voucher sono archiviati nel dipartimento di tossicologia e polivalente dell'ADLQ. I campioni di piante essiccate al sole sono stati macinati con Retsch Knife Mill Grindomix GM300 in polvere fine. Venti grammi di polvere sono stati estratti con 200 mL di acqua ultrapura durante la notte a 37 gradi su un agitatore rotante a 200 rpm. Gli estratti grezzi di Cistanche tubulosa (CTE) sono stati centrifugati per 30 minuti a 8000 giri/min per ridurre in pellet i composti non solubili, raccogliere il surnatante e liofilizzare utilizzando Labconco Freezone 6 plus Freeze dryer. L'estratto secco è stato ricostituito in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, SIGMA, Germany) ad una concentrazione di 20 mg/mL e filtrato sterile attraverso un filtro a membrana da 0.2-micron.

Linee cellulari e mantenimento cellulare

Le linee cellulari di carcinoma del colon umano CaCo2, SW620 e LoVo sono state ottenute dal Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Germania) mentre la linea cellulare HCT 116 è stata un gentile dono del Dipartimento di Scienze Biologiche e Ambientali dell'Università del Qatar. CaCo2 e HCT11 sono stati derivati ​​dal sito primario del carcinoma del colon mentre SW620 e LoVo sono stati derivati ​​dal sito metastatico. Le cellule SW620, HCT116 e LoVo sono state coltivate e mantenute in DME Medium mentre le cellule CaCo2 sono state mantenute in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, SIGMA, Germania). Le cellule sono state coltivate come monostrato coltivate a 37 gradi nel rispettivo mezzo integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS, SIGMA, Germania) e l'1% di penicillina/streptomicina (SIGMA, Germania) in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica.

Saggio di vitalità cellulare

Il test {{0}}[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) è stato utilizzato per valutare l'attività citotossica di CTE analogamente a quanto descritto in precedenza (Jaganjac et al., 2010). La densità di semina delle cellule CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo coltivate in 96-pozzetti era di 104 cellule per pozzetto. Le cellule sono state placcate nel rispettivo mezzo integrato con il 10% di FBS 24 ore prima del trattamento. Dopo 24 ore, il mezzo è stato rimosso e le cellule sono state trattate con 0, 0,25, 0,5, 1 e 2 mg/mL di CTE per 24, 48 e 72 ore a 37 gradi in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2. Dopo il trattamento con CTE, il terreno è stato rimosso e in ciascun pozzetto sono stati aggiunti 40 µL di soluzione MTT (0,5 mg/mL).

Dopo 3 ore di incubazione, la soluzione MTT è stata rimossa, il prodotto formazano sciolto in dimetilsolfossido (DMSO, SIGMA, Germania) e l'assorbanza è stata misurata a 590 nm con un lettore di micropiastre (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Svizzera) .

Saggio di apoptosi

L'apoptosi nelle cellule CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo è stata rilevata utilizzando il PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I con 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD) come colorante vitale (Becton Dickinson International, Belgio) secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule sono state seminate in 24-pozzetti a una densità di 5×104 cellule/pozzetto in un rispettivo terreno integrato con il 10% di FBS per 24 ore prima dell'aggiunta di CTE (0, 0,5 o 1 mg/mL). Dopo 24 incubazioni CTE, le cellule sono state raccolte, lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato freddo e colorate con ficoeritrina (PE) annessina V e 7-AAD per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Le cellule colorate sono state analizzate entro 1 ora mediante citometria a flusso utilizzando FACS. Citometro a flusso Aria III e software FACSDiva (Becton Dickinson) a bassa portata con un minimo di 104 celle. Il trattamento delle cellule per 4 ore con camptotecina 6 µM (SIGMA) è stato utilizzato come controllo positivo per il saggio.

Produzione intracellulare di ROS

La produzione intracellulare di ROS è stata esaminata utilizzando 2,7- diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA, SIGMA, Germania). DCFH-DA è una sonda non fluorescente, che viene ossidata con ROS intracellulare nel composto fluorescente 2, 7- diclorofluoresceina (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). Il test DCFHDA è stato eseguito in modo simile a quello descritto in precedenza (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). In breve, la densità di semina delle cellule CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo coltivate in 96-pozzetti di piastre nere era di 104 cellule per pozzetto. Le cellule sono state placcate nel rispettivo mezzo integrato con il 10% di FBS per 24 ore.

Prima del trattamento le cellule sono state incubate con 10 µM DCFH-DA a 37 gradi per 30 minuti in 5% di CO2/95% di aria. Le cellule sono state poi lavate etrattato con {{0}}, 0,5 e 1 mg/mL di CTE nel terreno senza rosso fenolo. La formazione intracellulare di ROS è stata monitorata continuamente per 25 ore a 37 gradi e 5% di CO2 utilizzando un lettore di micropiastre con fluorescenza superiore e modulo di controllo del gas (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Svizzera). L'intensità della fluorescenza è stata misurata con una lunghezza d'onda di eccitazione di 500 nm e rilevamento di emissione a 529 nm. Le unità arbitrarie, unità di fluorescenza relativa (RFU), erano basate direttamente sull'intensità della fluorescenza

Generazione di superossido mitocondriale

La capacità di CTE di indurre la generazione di superossido da parte dei mitocondri è stata stimata utilizzando una sonda MitoSOX Red (Life Technologies) permeabile alle cellule e mirata ai mitocondri e Hoechst 33342 per la colorazione nucleare (Life Technologies). Le cellule CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo sono state seminate in 96-pozzetti a una densità di 104 cellule per pozzetto in un rispettivo mezzo integrato con il 10% di FBS per 24 ore . Le cellule sono state quindi caricate con 4 µM di MitoSOX e 2 µM di Hoechst 33342 per 20 minuti, lavate con colorante in eccesso e pozzetti trattati con 0, 0,5 e 1 mg/mL di CTE per 24 ore a 37 gradi e 5% di CO2. L'intensità della fluorescenza è stata misurata con una lunghezza d'onda di eccitazione di 510 nm e rilevamento di emissione a 580 nm per MitoSOX e una lunghezza d'onda di eccitazione di 350 nm e rilevamento di emissione a 461 nm per Hoechst 33342 utilizzando un lettore di micropiastre con massima fluorescenza (Infinite 200 PRO, Tecan Trading SA, Svizzera)

analisi statistica

Le statistiche descrittive sono state mostrate come media più /− DS. La significatività delle differenze tra i gruppi è stata valutata utilizzando il test t di Student e il test del Chi-quadrato. Quando sono stati confrontati più di due gruppi, abbiamo utilizzato ANOVA unilaterale con test post hoc appropriati. È stato utilizzato SPSS 11.01 per Mircosoft Windows. Le differenze con P inferiore a 0,05 sono state considerate statisticamente significative.

RISULTATI

L'effetto del CTE sulla proliferazione delle linee cellulari di cancro del colon umano è mostrato nella Figura 1. Tutte le concentrazioni di CTE testate hanno mostrato un forte effetto inibitorio sulla linea cellulare CaCo2 in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo (Figura 1A). Settantadue ore di trattamento con CTE hanno inibito la crescita delle cellule CaCo2 di oltre il 60 percento rispetto al controllo (p < 0.05 per tutte le concentrazioni). L'impatto significativo del trattamento CTE sulla crescita delle cellule HCT116 è stato rilevato anche in tutti i momenti alle due concentrazioni più elevate (1 mg/mL e 2 mg/mL), raggiungendo una riduzione superiore al 70% a quest'ultima concentrazione (Figura 1B, p < 0,05).

Sebbene le due concentrazioni inferiori di CTE ({{0}}.25 e 0,5 mg/mL) abbiano ridotto significativamente la crescita delle cellule di HCT116 dopo 24 ore (p<0.05), 72="" they="" had="" no="" significant="" effect="" following="" hours="" of="" treatment="" compared="" to="" the="" control="" p="">{{0}}.{{10}}5). L'inibizione della proliferazione dipendente dal tempo e dalla concentrazione con CTE è stata ulteriormente confermata nelle cellule LoVo di oltre il 60 percento alla massima concentrazione (p <0.05) (Figura 1C) e tutte e quattro le concentrazioni di CTE testate hanno ridotto la crescita delle cellule SW620 dopo 48 ore (Figura 1D, p < 0.05 per tutti). Dopo 72 ore di trattamento, lo stesso effetto è stato osservato solo per le due concentrazioni più elevate (p < 0,05) mentre le concentrazioni di 0,25 e 0,5 mg/mL non hanno mostrato alcun effetto significativo rispetto al controllo (p > 0,05). L'impatto del trattamento CTE di 0,5 e 1 mg/mL sull'induzione dell'apoptosi è stato ulteriormente testato in tutte e quattro le linee cellulari (Figura 2). Un aumento del numero di cellule nell'apoptosi precoce è stato rilevato in HCT116 e LoVo dopo 24 ore di trattamento con 0,5 mg/mL (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D).

La capacità di CTE di indurre la produzione intracellulare di ROS è dimostrata nella Figura 3. Tre ore dopo il trattamento con CTE si è verificato un forte aumento della produzione intracellulare di ROS in tutte le linee cellulari (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24 hours of treatment with 1 mg/mL of CTE.

Fig. 1:

Effetto di Cistanche tubulosa sulla vitalità delle linee cellulari di cancro del colon. La vitalità cellulare misurata mediante analisi MTT di cellule (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 è presentata come percentuale della linea cellulare di cancro del colon non trattata di controllo. Vengono forniti i valori medi (± DS) per 5 repliche dell'esperimento rappresentativo: (*) significato p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Figura 2:

L'estratto di acqua di Cistanche tubulosa induce l'apoptosi nelle cellule tumorali del colon umano. Le analisi di citometria a flusso di annessina-V-FITC delle cellule (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 sono presentate come percentuale della linea cellulare di cancro del colon non trattata di controllo. Vengono forniti i valori medi (± DS) per 3 repliche dell'esperimento rappresentativo: (*) significato p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Figura 3:

L'estratto di acqua di Cistanche tubulosa induce la produzione intracellulare di ROS in un tempo e dose-dipendente. La produzione di ROS misurata mediante il test DCFH-DA nelle cellule (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 è presentata come valori RFU medi (±SD) per i rispettivi 5-replicati di un esperimento rappresentativo (*) Significato pag<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

Figura 4:

L'estratto di acqua di Cistanche tubulosa induce la produzione di superossido mitocondriale nelle cellule tumorali del colon umano. L'intensità della fluorescenza della sonda MitoSOX Red mirata ai mitocondri nelle cellule A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 è presentata come percentuale della linea cellulare di cancro del colon non trattata di controllo. Vengono forniti i valori medi (± DS) per 5 repliche dell'esperimento rappresentativo: (*) significato p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISCUSSIONE

Sebbene studi precedenti abbiano riportato numerose proprietà medicinali di Cistanche tubulosa, questo è il primo rapporto del suo effetto antiproliferativo nelle cellule maligne. I composti bioattivi di Cistanche tubulosa estratti con acqua, un solvente altamente polare, hanno mostrato una forte bioattività antitumorale. Abbiamo precedentemente confrontato l'efficienza di Cistanche tubulosa solubilizzata in acqua rispetto ad altri solventi come metanolo e acetato di etile, ma gli estratti acquosi hanno mostrato le attività antitumorali più promettenti (dati non mostrati).

Abbiamo dimostrato la capacità di CTE a 1 mg/mL e 2 mg/mL di inibire il 60% della crescita di linee cellulari di cancro del colon sia primario che metastatico, rivelando un ruolo potenzialmente importante di Cistanche tubulosa come trattamento del cancro del colon. Rispetto alle cellule normali, le cellule tumorali sono generalmente caratterizzate da un disturbo dell'omeostasi redox e una strategia comune delle attuali terapie antitumorali è quella di aumentare lo stress ossidativo cellulare (Yang et al, 2013). Sebbene livelli fisiologicamente bassi di ROS abbiano un ruolo importante come molecole di segnalazione, un'eccessiva produzione di ROS può contribuire all'instabilità e alla malignità del cancro (Liou e Storz, 2010). Paradossalmente, questo squilibrio nell'omeostasi redox cellulare rende le cellule tumorali più vulnerabili alla morte cellulare indotta da ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira e Hay, 2013). L'effetto antiproliferativo della CTE riportato in questo studio può essere mediato da vari meccanismi extra e intracellulari di composti noti e sconosciuti all'interno dell'estratto, mirando a molteplici percorsi che svolgono ruoli essenziali nell'apoptosi. Per distinguere tra diverse modalità di morte cellulare, abbiamo studiato il potenziale meccanismo responsabile della citotossicità indotta da CTE osservata

I nostri dati indicano che la CTE aumenta la produzione intracellulare di ROS e di conseguenza la morte cellulare indotta da ROS. Lo stato Redox della cellula svolge anche un ruolo cruciale nella regolazione dell'apoptosi e la catena di trasporto degli elettroni mitocondriale è uno dei principali siti di generazione cellulare di ROS (Trachootham et al., 2008). Inoltre, il ROS intracellulare potrebbe causare l'apoptosi cellulare attraverso percorsi sia dipendenti dai mitocondri che indipendenti (Sinha et al., 2013). In effetti, i nostri dati indicano anche che l'esternalizzazione della fosfatidilserina indotta da CTE è un effetto comune nell'apoptosi, sia nelle linee cellulari di cancro primario che metastatico, suggerendo che il meccanismo della morte indotta da CTE è mediato dall'apoptosi piuttosto che dalla necrosi. L'attivazione dell'apoptosi nelle cellule tumorali è una strategia correttiva e molti farmaci antitumorali possono esercitare effetti apoptotici nelle cellule tumorali.

Composti o estratti con attività pro-apoptotiche nelle cellule tumorali sono quindi potenzialmente utili nella ricerca sui farmaci antitumorali (Wong, 2011). Per determinare se l'effetto pro-apoptotico indotto da CTE è mediato dal meccanismo ROS indotto dai mitocondri, abbiamo misurato la produzione di superossido utilizzando una sonda fluorescente mirata ai mitocondri nelle cellule trattate con CTE. I nostri dati mostrano chiaramente che la CTE stimola la produzione di superossido mitocondriale suggerendo che l'attività antitumorale di Cistanche tubulosa è almeno in parte mediata dal meccanismo ROS indotto dai mitocondri.

CONCLUSIONI

In conclusione, i nostri dati suggeriscono che l'estratto acquoso della pianta del deserto Cistanche tubulosa può rappresentare un candidato promettente per un approccio antitumorale in combinazione con altre terapie convenzionali per la prevenzione e il trattamento del cancro del colon. Dimostriamo anche che la tossicità dell'estratto vegetale contro le cellule tumorali è mediata dall'aumento della produzione intracellulare di ROS e, almeno in parte, dall'apoptosi mitocondriale-dipendente. Sono in corso ulteriori studi per isolare e caratterizzare i singoli costituenti biologicamente attivi responsabili dell'attività antitumorale.

Sono necessarie ulteriori ricerche per valutare il potenziale utilizzo di questo estratto come efficace agente chemiopreventivo e per comprendere i meccanismi di azione sulle cellule tumorali del colon a livello molecolare. Sono inoltre necessari ulteriori studi preclinici e clinici per confermare gli effetti benefici sulla salute osservati di Cistanche tubulosa per la prevenzione del cancro.

RINGRAZIAMENTI

Sostegno finanziario e sponsorizzazione: questo studio è stato sostenuto dall'Anti-Doping Lab Qatar.

Conflitto di interessi: gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

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