I glicosidi feniletanoidi della Cistanche Tubulosa inducono l’apoptosi nelle cellule Eca‑109 attraverso il percorso dipendente dai mitocondri

introduzione

Il cancro esofageo è uno dei tipi di cancro più comuni con l'undicesimo tasso di morbilità più alto e il sesto tasso di mortalità più alto a livello globale e ha causato circa 439,{3}} morti nel 2015. L'incidenza del cancro esofageo varia notevolmente tra le diverse regioni, con quelle orientali L'Asia e l'Africa orientale e meridionale presentano i tassi di incidenza più elevati, mentre l'Africa occidentale presenta i tassi più bassi nel 2012. In Cina, i casi stimati di cancro esofageo e la mortalità sono stati rispettivamente di 477,000 e 375,000 , nel 2015. Sebbene il tasso di morbilità del cancro esofageo sia diminuito nei paesi con indice sociodemografico medio e medio-alto tra il 2005 e il 2015, il tasso di mortalità rimane elevato a causa della prognosi sfavorevole. La combinazione di resezione chirurgica con chemioterapia o radioterapia è stata utilizzata per trattare il cancro esofageo, tuttavia, è stato riportato che tra il 2003 e il 2014 il tasso di sopravvivenza a 5- anni è rimasto<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studylo ha dimostratoGlicosidi feniletanoidi della cistanche tubulosa(CTPG) potrebbe sopprimere la crescita delle cellule di melanoma B16-F10 in vitro e in vivo (24). Tuttavia, la scarsa solubilità in acqua del CTPG precedentemente utilizzato limita lo sviluppo del farmaco. Pertanto, è stato utilizzato il CTPG idrosolubile (CTPG-W) ed è stato studiato l'effetto antitumorale sulle cellule tumorali esofagee (Eca-109). È stato determinato che CTPG-W potrebbe inibire in modo dose-dipendente la vitalità delle cellule Eca-109 attraverso l'induzione dell'apoptosi attraverso un percorso mitocondriale-dipendente.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI PER MIGLIORARE LA FUNZIONE SESSUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiali e metodi

Animali.

Topi C57BL/6 femmine (6-8 settimane, ~25 g) sono stati acquistati dal Beijing Laboratory Animal Research Center (Pechino, Cina) e ospitati in ambienti a temperatura controllata (25˚C), sottoposti a ciclo di luce (12/ 12) Struttura per animali dell'Università dello Xinjiang (Urumqi, Cina). Tutti gli animali hanno ricevuto acqua e cibo privi di agenti patogeni.

Linea cellulare e coltura.

La linea cellulare di carcinoma esofageo umano (Eca-109) è stata preservata dal Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Cina) e coltivata in RPMI{{1} } terreno (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) integrato con il 10% di siero bovino fetale inattivato al calore (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Cina), 1% L -glutammina (100 mM), 100 U/ml di penicillina e 100 µg/ml di streptomicina a 37˚C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.

Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

CTPG-W (cat. n. SGJG20170410) è stato acquistato da Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Cina). I principali composti del CTPG sono stati qualificati e quantificati mediante HPLC secondo il nostro studio precedente (24). In breve, l'HPLC è stata condotta su una colonna ZORBAX SB‑C18 (250x4,6 mm; 5 µm) a 30 °C ed eluita con una soluzione di acido formico allo 0,2% e un gradiente di metanolo a partire dal 23%, aggiungendo 1 ml ogni minuto per 45 minuti fino al raggiungimento del 31%. Un totale di 10 µl di campione è stato iniettato e rilevato a 330 nm. Lo standard echinacoside è stato acquistato da Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Cina) e lo standard acteoside è stato acquistato da Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Germania). Gli standard sono stati utilizzati per analizzare i componenti di CTPG-W.

Saggio MTT.

La proliferazione cellulare è stata misurata con un test MTT. Le cellule Eca{{0}} sono state inoculate in piastre a pozzetti 96- ad una densità di 5x103 cellule in 100 µl RPMI{{5 }} terreno/pozzetto e coltivato a 37°C per 24 ore, quindi trattato con diverse concentrazioni (0, 200, 400, 600 e 800 µg/ml) di CTPG-W o dimetilsolfossido allo 0,4% (DMSO) per 24, 48 e 72 ore. Come controllo del solvente è stato utilizzato DMSO (800 µg/ml CTPG-W contenenti 0,4% di DMSO). Come controllo positivo è stato utilizzato cisplatino (20 µg/ml). Successivamente, il supernatante è stato scartato dopo centrifugazione a 225 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 µl di soluzione MTT (0,5 mg/ml in terreno RPMI-1640 senza FBS) e incubati a 37°C per 3 H. I cristalli di formazan formati sono stati sciolti in 200 µl di DMSO. I valori di densità ottica (OD) sono stati misurati a una lunghezza d'onda di 490 nm mediante un lettore di micropiastre a 96-pozzetto (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). La vitalità cellulare relativa è stata calcolata secondo la formula: Vitalità cellulare (%)=(ODtrattata/ODnon trattata)x100%. La morfologia delle cellule Eca‑109 è stata osservata con un microscopio a fluorescenza invertito (ingrandimento, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokyo, Giappone).

Per la proliferazione degli splenociti, i topi C57BL/6 sono stati sottoposti ad eutanasia mediante dislocazione cervicale e le milze sono state isolate. È stata preparata la sospensione monocellulare e gli splenociti sono stati seminati in piastre a pozzetti 96- con una densità di 1x105 cellule/pozzetto in 100 µl di terreno RPMI-1640 e quindi trattati con diverse concentrazioni (0, 200, 400, 600 e 800 µg/ml) di CTPG-W per 24, 48 e 72 ore a 37˚C con il 5% di CO2. La proliferazione degli splenociti è stata misurata mediante saggio MTT, secondo il protocollo sopra citato. Indice di stimolazione=ODtrattato/ODnon trattato.

Misura dell'apoptosi e del ciclo cellulare. Le cellule Eca{{0}} sono state coltivate in piastre da 60 mm ad una densità di 2,5x105 cellule/piastra per 24 ore e trattate con diverse concentrazioni ({{31} }, 200, 400, 600 e 800 µg/ml) di CTPG-W o 0,4% DMSO per 24 ore a 37˚C con il 5% di CO2. Le cellule sono state raccolte e colorate con un kit di rilevamento dell'apoptosi con annessina V‑fluoresceina isotiocianato (FITC)/propidio ioduro (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Cina), secondo i protocolli del produttore. I campioni sono stati raccolti mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) e analizzati da FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Per analizzare l'effetto di CTPG-W sul ciclo cellulare, 2,5x105 cellule Eca-109 sono state seminate in piastre di coltura da 60 mm e trattate con CTPG-W (0, 100, 200 e 400 µg/ml) o 0,4 % DMSO per 24 ore a 37˚C con il 5% di CO2. Tutte le cellule sono state raccolte e lavate due volte con PBS ghiacciato (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), quindi fissate in etanolo ghiacciato al 70% a 4°C per 30 minuti. Dopo il lavaggio due volte con PBS ghiacciato, le cellule sono state risospese in 300 µl di tampone di colorazione PI/RNasi (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) per 10 minuti a temperatura ambiente. La distribuzione del ciclo cellulare è stata analizzata con il software ModFit LT 3.0 mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur).

CISTANCHE TUBULOSA NATURALIAntistanchezzaProteggi il fegato PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analisi del potenziale di membrana mitocondriale (Δψm) e delle specie reattive dell'ossigeno (ROS).Per analizzare il Δψm, le cellule Eca{{0}} sono state trattate con CTPG-W (0, 400, 600 e 800 µg/ml) o 0,4% DMSO per 24 ore a 37˚C con il 5% di CO2 e colorato con il kit di analisi del potenziale della membrana mitocondriale con JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Cina), secondo il protocollo del produttore, per 20 minuti a 37˚ C. Dopo il lavaggio due volte con tampone di lavaggio JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology), i campioni sono stati risospesi con 300 µl di tampone di lavaggio JC‑1 e analizzati mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur). La fluorescenza del colorante JC‑1 nelle cellule Eca‑109 è stata osservata anche con un microscopio a fluorescenza invertito (ingrandimento, x200; Nikon Eclipse Ti‑E). Per l'analisi dei ROS, le cellule Eca-109 sono state trattate con CTPG-W (0, 400, 600 e 800 µg/ml) per 2, 4, 6, 12 e 24 ore e colorate con Reactive Oxygen Species Assay kit (Beyotime Institute of Biotechnology), secondo il protocollo del produttore, per 20 minuti a 37˚C. Dopo aver lavato tre volte con PBS ghiacciato, i campioni sono stati raccolti mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur) e analizzati dal software FlowJo 7.6.

Figura 1. Il controllo qualificato di CTPG-W. I componenti di CTPG-W sono stati analizzati qualitativamente e quantitativamente mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni e confrontati con gli standard di echinacoside e acteoside. CTPG-W, glicosidi feniletanoidi idrosolubili diC. tubulosa.

Attività di eliminazione dei radicali del 2,2‑difenil‑1‑picrilidrazil (DPPH). L'attività di eliminazione dei radicali liberi di CTPG-W è stata determinata con un dosaggio dei radicali liberi DPPH secondo il protocollo pubblicato con una modifica minore, poiché il metanolo è stato sostituito con etanolo per dissolvere DPPH (25,26). Per le misurazioni allo stato stazionario, 150 µl di DPPH (100 mmol/l) in etanolo sono stati miscelati con diverse concentrazioni di CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 e 600 µg/ml) in 50 µl di PBS e incubati al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. L'assorbanza a 517 nm è stata rilevata in presenza e in assenza di CTPG-W. Come controllo positivo sono stati utilizzati 50 µl di vitamina C in totale. L'attività di eliminazione dei radicali DPPH è stata calcolata utilizzando la formula: Scavenging (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, dove Ablank è l'assorbanza del controllo (senza DPPH), Asample è l'assorbanza del campione e A0 è l'assorbanza del PBS con DPPH.

Analisi Western Blot. Le cellule Eca{{0}} sono state trattate con CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) o DMSO allo 0,4% per 24 ore a 37˚C con il 5% di CO2. Il successivo lavaggio delle cellule avviene due volte con PBS 

Figura 2. L'effetto di CTPG-W sulla crescita delle cellule Eca-109 e degli splenociti. (A) Le cellule Eca-109 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG-W per 24, 48 e 72 ore, quindi la vitalità cellulare è stata rilevata con un test MTT. (B) I cambiamenti morfologici delle cellule Eca-109 dopo il trattamento CTPG-W a 24 ore. (C) Gli splenociti dei topi C57BL/6 sono stati trattati con diverse concentrazioni di CTPG-W per 24, 48 e 72 ore, quindi la proliferazione è stata analizzata con un test MTT.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

sono stati lisati nel tampone di lisi del test di radioimmunoprecipitazione (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Pechino, Cina) per 20 minuti su ghiaccio. Dopo la centrifugazione a 10,000 xg per 10 minuti a 4°C, i surnatanti sono stati raccolti e le concentrazioni proteiche sono state rilevate con un kit di acido bicinconinico (Thermo Fisher Scientific, Inc.) secondo i protocolli del produttore. L'analisi Western blot è stata condotta secondo la nostra precedente descrizione (24). Gli anticorpi contro la caspasi-7 (cat. n. D120077), caspasi-8 (cat. n. D155240), caspasi-9 (cat. n. D220078), linfoma a cellule B{ {13}} (Bcl-2)-associato X (Bax) (cat. n. D220073) e Bcl-2 (cat. n. D260117) e IgG anti-topo-perossidasi di rafano (HRP ) (cat. n. D111050) e IgG-HRP anti-coniglio (cat. n. D110058) sono stati acquistati da BBI Life Sciences (Shanghai, Cina). Gli anticorpi contro la caspasi-3 (cat. n. E-AB-10050) e la caspasi attiva-3 (cat. n. E-AB-22115) sono stati acquistati da Elabscience ( Wuhan, Cina). Altri anticorpi contro caspasi-7 (cat. n. 9492), poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) (cat. n. 9542), citocromo c (cat. n. AC909), c-Jun NH{ {37}}la chinasi terminale (JNK) (cat. n. 9252S) e l'actina (cat. n. 58169) sono state ottenute da Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Tutti gli anticorpi primari e secondari sono stati diluiti a 1:1,000. Gli anticorpi primari sono stati incubati a 4°C durante la notte e gli anticorpi secondari sono stati incubati a 37°C per 1 ora.

Figura 3. L'apoptosi delle cellule Eca-109 indotta da CTPG-W. Le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG-W per 24 ore. (A) Le cellule Eca‑109 apoptotiche e necrotiche sono state analizzate mediante citometria a flusso. Il pannello superiore mostra i singoli dot-plot mentre il pannello inferiore mostra i dati di riepilogo. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Le proteine ​​​​bersaglio sono state rilevate utilizzando un kit di analisi di chemiluminescenza potenziato (Beyotime Institute of Biotechnology), secondo il protocollo del produttore.

Analisi statistica. La significatività statistica è stata calcolata mediante analisi unidirezionale della varianza con il test post hoc di Tukey e i risultati sono stati analizzati utilizzando il software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) tra i gruppi di trattamento e di controllo. Tutti i dati sono stati presentati come media ± deviazione standard. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

ESTRATTO DI CISTANCHE TUBULOSA PER IL MIGLIORAMENTO DELLA FUNZIONE RENALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Risultati

CTPG‑W sopprime la crescita delle cellule Eca‑109.

I componenti di CTPG-W sono stati qualificati e quantificati mediante HPLC (Fig. 1), che sono stati confrontati con gli standard di echinacoside e acteoside. Secondo i tempi di ritenzione dei picchi e le aree dei picchi, CTPG-W conteneva il 39,16% di echinacoside e il 2,44% di acteoside. Innanzitutto, l'effetto di CTPG-W sulla vitalità delle cellule Eca-109 è stato determinato con un test MTT. CTPG-W è stato sciolto in DMSO a 200 mg/ml e diluito con il mezzo RPMI-1640 contenente il 10% di FBS inattivato al calore alle concentrazioni indicate. Le cellule Eca-109 sono state trattate con CTPG-W e la vitalità cellulare è stata analizzata con un test MTT nei punti temporali indicati. Il trattamento con CTPG‑W ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule Eca-109 in modo dose e tempo-dipendente (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Figura 4. L'effetto di CTPG-W sulla distribuzione del ciclo cellulare nelle cellule Eca-109. Sono state utilizzate diverse concentrazioni di CTPG-W per trattare le cellule Eca-109 per 24 ore e la distribuzione del ciclo cellulare è stata analizzata mediante citometria a flusso. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG‑W induce l'apoptosi nelle cellule Eca‑109. Per indagare se CTPG-W sopprimesse la crescita delle cellule Eca-109 attraverso l'induzione di apoptosi o necrosi, le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG-W. Dopo 24 ore, l'apoptosi e la necrosi delle cellule Eca-109 sono state rilevate con la colorazione dell'annessina V/PI. Come illustrato nella Fig. 3A, le cellule di annessina V- /PI+ sono state delimitate come cellule necrotiche e le cellule di annessina V+ /PI+ e annessina V+ /PI- sono state delimitate come cellule apoptotiche. CTPG-W ha indotto principalmente l'apoptosi delle cellule Eca-109 in modo dose-dipendente, sebbene anche le cellule Eca{{16} necrotiche aumentassero significativamente durante il trattamento con 600 e 800 µg/ml di CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W induce l'arresto del ciclo cellulare nella fase S nelle cellule Eca‑109. Il disturbo del ciclo cellulare del cancro sopprimerà la crescita cellulare e promuoverà l'apoptosi (27). La distribuzione del ciclo cellulare nelle cellule Eca-109 è stata rilevata con la colorazione PI dopo il trattamento CTPG-W per 24 ore. È stato osservato che le cellule nella fase S aumentavano e le cellule nelle fasi G0/G1 indicavano una diminuzione complessivamente significativa dopo il trattamento con CTPG‑W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W diminuisce Δψm e induce il rilascio del citocromo c. L'apoptosi può essere indotta da una via mitocondriale dipendente (28,29). I membri pro e anti-apoptotici della famiglia delle proteine ​​BCL-2 svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'integrità della membrana mitocondriale (30,31). Dopo il trattamento CTPG-W per 24 ore, il Δψm è stato valutato utilizzando la colorazione JC‑1. L'aggregato JC‑1 (fluorescenza rossa rilevata in FL‑2) si disintegrerà nel monomero (fluorescenza verde rilevata in FL-1) quando Δψm si riduce (32). Come illustrato nella Fig. 5A, le frequenze delle cellule FL-1+ FL-2-/+ sono aumentate significativamente in modo dose-dipendente, indicando che il Δψm delle cellule Eca‑109 è diminuito. I cambiamenti di fluorescenza nelle cellule Eca‑109 sono stati osservati anche con un microscopio a fluorescenza invertito (Fig. 5B). Con l'aumento delle concentrazioni di CTPG‑W, la fluorescenza rossa è diminuita e quella verde è aumentata, il che è coerente con i dati della citometria a flusso. È stato inoltre osservato che il livello di citocromo c nel citosol era notevolmente aumentato (Fig. 5C), che è il risultato di una riduzione di Δψm. Ciò rafforza la conclusione tratta dall'aumento del conteggio delle cellule FL-1+ FL-2-/+ secondo cui Δψm è diminuito a seguito del trattamento CTPG-W. È stato riportato che JNK può regolare l'attivazione della famiglia di proteine ​​BCL-2 causando il rilascio del citocromo c (33-35). È stato inoltre determinato che il livello di JNK era notevolmente sovraregolato in seguito al trattamento con CTPG-W (Fig. 5C). I risultati hanno indicato che CTPG-W può indurre l'apoptosi delle cellule Eca-109 attraverso un percorso mitocondriale-dipendente.

Figura 5. Riduzione di Δψm e sovraregolazione del citocromo ce JNK. Le cellule Eca-109 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG-W per 24 ore. (A) Δψm è stato rilevato mediante colorazione JC‑1 e i campioni sono stati analizzati mediante citometria a flusso. I singoli grafici a punti rappresentano i cambiamenti nella fluorescenza di JC‑1. Le frequenze delle celle FL-1+ FL-2-/+ sono rappresentate nel pannello inferiore. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Figura 6. I livelli di ROS nelle cellule Eca-109 dopo il trattamento con CTPG-W e l'attività antiossidante di CTPG-W. (A) Le cellule Eca-109 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG‑W e i livelli di ROS sono stati analizzati mediante citometria a flusso nei punti temporali indicati. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

L'effetto di CTPG‑W sulla generazione di ROS intracellulari.I ROS potrebbero ridurre Δψm per indurre l'apoptosi (36). Per studiare se CTPG-W può aumentare la produzione di ROS, le cellule Eca-109 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG-W. Le cellule sono state raccolte nei punti temporali indicati e colorate con DCFH-DA. La produzione di ROS intracellulari nelle cellule Eca-109 è stata determinata mediante citometria a flusso. Come illustrato nella Fig. 6A, 800 µg/ml di CTPG-W hanno aumentato significativamente la produzione di ROS da 2-6 h e sono diminuiti da 12-24 h. Inoltre, 400 µg/ml di CTPG‑W hanno aumentato significativamente la produzione di ROS da 12-24 h. Inoltre, 200 µg/ml di CTPG-W non hanno alterato in modo significativo la produzione di ROS. I cambiamenti dinamici nella produzione di ROS possono essere associati all'apoptosi delle cellule Eca-109. È stato inoltre determinato che CTPG-W aveva un'attività di eliminazione dei radicali liberi (Fig. 6B), che può essere associata alla ridotta produzione di ROS nelle cellule Eca-109 trattate con 800 µg/ml di CTPG-W dopo 12 ore.

Figura 7. I livelli di caspasi scisse e PARP scisse dopo il trattamento CTPG-W. Le proteine ​​sono state isolate dalle cellule Eca-109 trattate con CTPG-W per 24 ore e i livelli di caspasi scisse e PARP scisse sono stati rilevati con analisi western blot. DMSO, dimetilsolfossido; CTPG-W, glicosidi feniletanoidi idrosolubili diC. tubulosa; PARP, poli (ADP-ribosio) polimerasi.

CTPG‑W sovraregola l'attività di caspasi‑3, caspasi‑7, caspasi‑9 e PARP. Il rilascio di citocromo c dovuto alla riduzione di Δψm potrebbe attivare le proteasi della caspasi per indurre l'apoptosi (29,30,37). Dopo il trattamento con CTPG-W per 24 ore, l'attivazione di caspasi-3, 7, 8, 9 e PARP è stata rilevata mediante analisi western blot. Rispetto al controllo, i livelli di cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-7, cleaved-caspase-3 e cleaved-PARP, ma non i livelli di cleaved-caspase{{20 }}, sono stati sovraregolati dal trattamento con CTPG in modo dose-dipendente (Fig. 7). Questi risultati hanno indicato che CTPG-W ha ridotto Δψm e ha promosso il rilascio di citocromo c per attivare le caspasi che inducono l'apoptosi delle cellule Eca-109.

Discussione

Il CHM tradizionale potrebbe indurre l'apoptosi delle cellule tumorali esofagee attraverso diversi percorsi, tra cui il recettore della morte estrinseco e le vie di stress intrinseche del reticolo mitocondriale e endoplasmatico (29). Il nostro studio precedente ha dimostrato che il CTPG, in quanto componente principale di C. tubulosa, inibisce la crescita delle cellule di melanoma B16-F10 attraverso l'induzione dell'apoptosi attraverso un percorso mitocondriale dipendente (24). Nel presente studio, è stato studiato l'effetto antitumorale di CTPG-W sulle cellule Eca-109 ed è stato determinato che CTPG-W sopprime la crescita delle cellule Eca-109, induce apoptosi e arresto del ciclo cellulare, ridotto Δψm, aumentato il rilascio di citocromo ce caspasi attivate. CTPG e CTPG-W potrebbero indurre l'apoptosi e l'arresto del ciclo cellulare nelle cellule tumorali. Tuttavia, i meccanismi accurati sono diversi a causa dei diversi componenti di CTPG (26,64% echinacoside, 10,19% acteoside e 1,71% isoacteoside) e CTPG-W (39,16% echinacoside e 2,44% acteoside). CTPG ha arrestato le cellule B16-F10 nelle fasi G0/G1, ma CTPG-W ha arrestato le cellule Eca-109 nella fase S (24). La produzione di ROS è stata aumentata in modo dose-dipendente dal CTPG, ma ha indicato un cambiamento in modo tempo-dipendente da una dose elevata di CTPG‑W, che è aumentata significativamente all'inizio del trattamento con CTPG-W (2-6 h) e è diminuito significativamente dopo 12 ore, rispetto al controllo. Una possibile ragione è che il componente principale di CTPG-W è l’echinacoside. Diversi studi hanno riportato che l'echinacoside potrebbe inibire la produzione di ROS e l'apoptosi indotta dai ROS per esercitare i suoi effetti neuroprotettivi e antietà (38-40). Allo stesso modo, nel presente studio è stata osservata l’attività di eliminazione dei radicali liberi. Pertanto, è stato ipotizzato che alcuni componenti, tra cui verbascoside, iso-verbascoside e salidroside in una dose elevata di CTPG-W, potrebbero indurre immediatamente la generazione di ROS causando l'apoptosi delle cellule Eca-109 (41,42), e quindi ROS è stato recuperato da echinacoside. Un'altra possibile ragione per le differenze nella produzione di ROS da parte di CTPG e CTPG-W è che in questo studio e nello studio precedente sono state utilizzate linee cellulari diverse (24). Dong et al (43) hanno riferito che l'echinacoside potrebbe indurre l'apoptosi delle cellule tumorali del colon-retto umane SW480 attraverso la generazione di danno ossidativo al DNA senza aumento dei livelli di ROS.

Il trattamento con CTPG-W ha ridotto Δψm e ha causato il rilascio di citocromo c, che promuove la scissione della caspasi-9 (28). Coerentemente, i livelli di caspasi scissa-9 erano sovraregolati dal trattamento con CTPG-W. Successivamente, la caspasi attiva-9 può attivare la caspasi-3 per indurre l'apoptosi (44). Anche i livelli di caspasi scissa-3 sono risultati sovraregolati dal trattamento con CTPG-W. Tuttavia, la caspasi-8 non è stata attivata da CTPG-W, indicando che la via estrinseca del recettore della morte non era coinvolta nell'apoptosi indotta da CTPG-W. Queste osservazioni indicano che CTPG-W induce l'apoptosi delle cellule Eca-109 attraverso l'attivazione di un percorso mitocondriale-dipendente.

PARP svolge un ruolo importante nella stabilità genomica e può essere scisso dalle caspasi attive, in particolare dalla caspasi-3 e -7 (45). È stato determinato che il trattamento con CTPG-W attiva la caspasi-3 e -7, che possono scindere PARP per inibire la riparazione del DNA e causare apoptosi.

CTPG-W sopprime inoltre, in modo dose e tempo dipendente, la crescita delle cellule BEL-7404 del carcinoma epatocellulare umano (dati non pubblicati). Sebbene CTPG-W inibisca la crescita delle cellule Eca-109 e BEL-7404, promuove la proliferazione degli splenociti, il che potrebbe essere dovuto al contenuto di polisaccaridi (~50%) in CTPG-W (46 ). Allo stesso modo, diversi studi hanno riportato che i polisaccaridi possono favorire la proliferazione degli splenociti (46-49). Nel modello murino, è stato determinato che CTPG‑W aumentava significativamente l'indice della milza, rispetto al gruppo di controllo, ma non influenzava il peso corporeo e gli indici di altri organi tra cui cuore, fegato, reni e polmone (dati non pubblicati), indicando che CTPG-W non ha effetti citotossici sulle cellule normali.

Collettivamente, i dati hanno indicato che CTPG-W inibisce la crescita delle cellule Eca-109 mediante induzione dell'apoptosi attraverso un percorso mitocondriale dipendente

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