Caratteristiche cliniche, diagnosi, esiti e analisi del microbioma polmonare dell'aspergillosi polmonare invasiva nei pazienti con polmonite acquisita in comunità

ASTRATTO

Sfondo

L'aspergillosi polmonare invasiva (IPA) rimane sottostimata nei pazienti con polmonite acquisita in comunità (CAP). Questo studio mira a descrivere le caratteristiche cliniche e gli esiti dell'IPA nei pazienti con CAP, valutare le prestazioni diagnostiche del sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS) per l'IPA e analizzare il microbioma polmonare tramite dati mNGS.

Recentemente, la nuova epidemia di polmonite da coronavirus ha attirato l'attenzione diffusa in tutto il mondo. Molte persone hanno iniziato a prestare attenzione al fatto che la loro immunità sia abbastanza forte perché l'immunità è la prima linea di difesa del corpo contro le malattie. In questo articolo, esploriamo la relazione tra polmonite e immunità.

La polmonite è una grave infezione respiratoria e una malattia infiammatoria causata da molte cause. Virus come il comune raffreddore, l'influenza e il nuovo coronavirus possono causare la polmonite. L'obiettivo di questa malattia è che provoca danni irreversibili al sistema respiratorio e può portare a insufficienza respiratoria.

Tuttavia, se la tua immunità è adeguata, il tuo corpo è meglio equipaggiato per combattere virus e batteri. Ciò è dovuto principalmente ai globuli bianchi, una delle cellule immunitarie più importanti del corpo. I globuli bianchi possono riconoscere i patogeni invasori e attaccarli direttamente e possono anche secernere anticorpi per difendersi dall'invasione dei patogeni.

Oltre ai globuli bianchi, alcuni altri componenti importanti del sistema immunitario includono linfociti e fagocitosi. I linfociti attivano il sistema immunitario riconoscendo agenti patogeni estranei, mentre la fagocitosi è quando alcuni tipi di globuli bianchi inghiottono e abbattono agenti patogeni come i batteri invasori.

Quindi, mantenere sano il sistema immunitario è un modo efficace per prevenire le infezioni respiratorie come la polmonite. Puoi migliorare la tua immunità mangiando cibi ricchi di vitamine, proteine ​​e antiossidanti, come pesce di acque profonde, noci, fagioli, fragole, mirtilli e altro ancora. Inoltre, anche il mantenimento di una buona salute è molto importante, incluso non fumare, fare più esercizio fisico, mantenere un buon sonno e ridurre lo stress.

Insomma, per evitare infezioni respiratorie come la polmonite, è fondamentale mantenere una buona immunità. Dobbiamo migliorare l'immunità del corpo attraverso una dieta sana, un corretto esercizio fisico e abitudini di sonno. Pianifica ragionevolmente il tuo stile di vita in modo che il tuo corpo abbia un migliore meccanismo di difesa e stia lontano da malattie come la polmonite. Da questo punto di vista, dobbiamo migliorare la nostra immunità. Cistanche può migliorare significativamente l'immunità, perché la cenere di carne contiene una varietà di componenti biologicamente attivi, come polisaccaridi, due funghi, Huang Li, ecc. Questi componenti possono stimolare il sistema immunitario Vari tipi di cellule nel sistema, aumentare la loro attività immunitaria.

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Metodi

Questo studio di coorte retrospettivo ha incluso pazienti con CAP dal 22 aprile 2019 al 30 settembre 2021. Sono stati analizzati i dati clinici e microbiologici. Le prestazioni diagnostiche di mNGS sono state confrontate con i metodi di rilevamento tradizionali. Il microbioma polmonare rilevato da mNGS è stato caratterizzato ed è stata valutata la sua associazione con le caratteristiche cliniche.

Risultati principali

L'IPA è stata diagnosticata in 26 (23,4%) su 111 pazienti con CAP. I pazienti con IPA hanno mostrato un'immunità depressa, mortalità ospedaliera più elevata (30,8% vs 11,8%) e mortalità in unità di terapia intensiva (42,1% vs 17,5%) rispetto ai pazienti senza IPA. Il test dell'antigene galattomannano (GM) ha avuto la massima sensibilità (57,7%) nel rilevare l'Aspergillus spp, seguito da mNGS (42,3%), coltura (30,8%) e striscio (7,7%). Le tazze, la coltura e lo striscio avevano una specificità del 100%, mentre il test GM aveva una specificità del 92,9%. La struttura microbica dell'IPA differiva significativamente dai pazienti non IPA (p<0.001; Wilcoxon test). Nineteen different species were significantly correlated with clinical outcomes and laboratory biomarkers, particularly for Streptococcus salivarius, Prevotella timonensis, and Human betaherpesvirus 5.

Conclusioni

I nostri risultati rivelano che i pazienti con infezione da Aspergillus tendono ad avere un tasso di mortalità precoce più elevato. L'NGS può essere suggerito come complemento ai test microbiologici di routine nella diagnosi di pazienti a rischio di infezione da Aspergillus. Il microbiota polmonare è associato a condizioni infiammatorie, immunitarie e metaboliche dell'IPA e quindi influenza gli esiti clinici.

INTRODUZIONE

L'aspergillosi polmonare invasiva (IPA) è un'importante causa di morbilità e mortalità, che tipicamente colpisce gli ospiti immunocompromessi, come i pazienti con infezione da HIV così come i pazienti in terapia con corticosteroidi, i trapiantati o il cancro ematologico.1 Numerosi casi di diagnosi errata o mancata diagnosi e solo la diagnosi post mortem a causa della mancanza di risorse mediche e di nuovi fattori di rischio viene sottovalutata.2 La diagnosi clinica di IPA comprende fattori dell'ospite, caratteristiche cliniche ed evidenze micologiche.3 Problemi derivanti dall'inaccessibilità dei campioni di tessuto, bassa sensibilità della coltura, scarsa applicabilità di i tradizionali fattori dell'ospite e l'assenza di risultati clinici e radiologici tipici portano a diagnosi ritardate e mancate nei pazienti con IPA. la rilevazione del DNA di Aspergillus nel fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF) mediante PCR.5.

Nell'ultimo decennio, lo sviluppo di metodi molecolari per la quantificazione e il sequenziamento del DNA patogeno ha notevolmente facilitato il rilevamento di vari microrganismi. Il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (NGS) è stato ora ampiamente applicato alla diagnosi di malattie infettive in contesti clinici, in particolare con agenti patogeni specifici o non identificati o misti in un approccio non mirato.6 Ad esempio, la combinazione di mNGS con metodi di rilevamento convenzionali potrebbe aumentare il tasso di rilevamento del complesso Mycobacterium tuberculosis7 e facilitare il rilevamento di agenti patogeni misti nei pazienti con polmonite acquisita in comunità (CAP) grave immunocompromessa.8 Ad oggi, le prestazioni diagnostiche dell'NGS per il rilevamento dell'infezione polmonare da aspergillosi non sono state chiare.

Recentemente, le variazioni nella composizione e nella diversità dei microbiomi polmonari sono state descritte in numerose malattie respiratorie, fornendo nuovi punti di vista per una diagnosi precisa. I pazienti con tubercolosi confermata batteriologicamente hanno mostrato un aumento considerevole delle specie batteriche rispetto ai pazienti con tubercolosi negativa.9 Lo squilibrio della comunità polmonare guidato dall'arricchimento con il potenziale patogeno è correlato con gli esiti nei pazienti intubati/ventilati meccanicamente.10 Hérivaux et al hanno scoperto pazienti con IPA ha mostrato un'abbondanza differenziale di specifici taxa batterici.11

Con le nuove tecniche diagnostiche disponibili, è possibile valutare le caratteristiche cliniche e il microbioma polmonare dell'IPA da una nuova prospettiva per una comprensione completa della malattia. Questo studio è stato progettato per descrivere le caratteristiche cliniche e gli esiti dell'IPA nei pazienti con CAP, valutare le prestazioni diagnostiche di mNGS per l'IPA e rivelare la relazione tra le caratteristiche cliniche e il microbioma polmonare nell'IPA.

METODI

Disegno dello studio e partecipanti

Questo era uno studio di coorte retrospettivo che consisteva in pazienti ospedalizzati (maggiori o uguali a 18 anni di età) diagnosticati come CAP presso il primo ospedale affiliato della Chongqing Medical University tra il 22 aprile 2019 e il 30 settembre 2021. I pazienti arruolati in questo studio devono soddisfare i seguenti criteri inclusivi: (1) diagnosi di CAP conforme alle linee guida IDSA/ATS 200712, (2) lavaggio broncoalveolare, (3) nessuna esposizione agli antibiotici nelle ultime 2 settimane prima della raccolta del campione e (4) test del galattomannano (GM), striscio, coltura e risultati mNGS BALF di BALF. I casi con probabile IPA richiedono la presenza di almeno un fattore dell'ospite, una manifestazione clinica e un'evidenza micologica nel BALF, secondo i criteri del 2019 dell'Organizzazione europea per la ricerca e il trattamento del cancro/Mycoses Study Group (EORTIC/MSG).3 In questo studio, una modifica nei criteri diagnostici è stata l'aggiunta di NGS come uno dei metodi di test micologici tra cui test GM, striscio e coltura. I casi senza probabile IPA includevano pazienti senza evidenza di evidenza clinica o radiologica o presenza di Aspergillus spp nel BALF. Tutti i pazienti arruolati sono stati seguiti telefonicamente per informarsi sulla sopravvivenza o sulla data di morte.

Raccolta dati e analisi microbiologiche

Le informazioni cliniche sono state estratte dalle cartelle cliniche elettroniche utilizzando un modulo di raccolta dati standardizzato, che includeva informazioni demografiche, dati clinici, risultati di laboratorio, TC del torace, trattamenti antifungini ed esiti. Tutti i dati sono stati esaminati da due investigatori in modo indipendente per verificare l'accuratezza dei dati. La 7-category ordinal scale13 è stata modificata in base al disegno dello studio, che consisteva in categorie che si escludono a vicenda come segue: categoria 7, morte; categoria 6, che richiede ventilazione invasiva e supporto d'organo aggiuntivo (p. es., terapia sostitutiva renale continua o ossigenazione extracorporea della membrana); categoria 5, che richiede ventilazione meccanica invasiva; categoria 4, che richiede ventilazione non invasiva o ossigeno ad alto flusso; categoria 3, che richiede ossigeno supplementare tramite maschera o cannule nasali; categoria 2, ospedalizzato, senza ossigeno; categoria 1, dimesso. Il miglioramento dello stato clinico è stato definito come un declino di 2 categorie valutato dalla 7-scala ordinale di livello in punti temporali fissi (giorni 1, 7, 14, 21 e 28).
Il test per l'antigene GM nel siero e GM nel BALF viene generalmente eseguito in tutti i pazienti arruolati. Un risultato è stato considerato positivo quando i valori dell'indice ottico erano Maggiori o uguali a 1.0 nel siero o Maggiori o uguali a 1.0 nel BALF o Maggiori o uguali a 0 .7 nel siero e maggiore o uguale a 0.8 nel BALF. I campioni BALF sono stati sottoposti a mNGS, striscio al microscopio e coltura fungina ordinaria.

Metagenomica sequenziamento di nuova generazione

Da ciascun paziente sono stati prelevati 1,5–3 ml di BALF secondo le procedure standard.14 Una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml contenente 0,6 ml di campione BALF, enzima e 1 g di 0,5 mm di microsfere di vetro è stata agitata da un miscelatore vortex e un campione di 0,3 ml è stato separato in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml e il DNA è stato estratto utilizzando il kit TIANamp Micro DNA (DP316, Tiangen Biotech) seguendo il manuale del produttore.15 Le librerie di DNA sono state costruite attraverso il DNA frammentazione, riparazione dell'estremità, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR. Quindi, le librerie con qualità confermata sono state sequenziate dalla piattaforma Illumina NextSeq 550 con singole letture di 75 bp (Illumina, San Diego, California, USA).16

Il controllo interno, denominato unique molecolare spiked-in (UMSI), è stato aggiunto al campione prima dell'estrazione del DNA. La sequenza di UMSI variava in diversi campioni. Ogni esecuzione del test NGS includeva un controllo negativo esterno eseguito in parallelo con i campioni clinici. Durante l'analisi, è stato possibile rilevare la contaminazione tra i campioni se la sequenza UMSI era la stessa o se le letture di alcuni agenti patogeni nel controllo esterno erano molto elevate.

I dati di sequenziamento di alta qualità sono stati generati rimuovendo le letture di bassa qualità, seguite dalla sottrazione computazionale delle sequenze dell'ospite umano mappate sul genoma di riferimento umano (hg19) utilizzando l'allineamento di Burrows-Wheeler.17 I dati rimanenti rimuovendo le letture di bassa complessità sono stati classificati allineandosi simultaneamente a quattro database del genoma microbico (batteri, funghi, virus e parassiti), che sono stati scaricati dal National Center for Biotechnology Information (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/). L'interpretazione dei miei risultati può essere vista nei metodi supplementari online.

Paziente e coinvolgimento del pubblico

I pazienti e il pubblico non sono stati coinvolti nella progettazione e nella conduzione di questo studio, nella scelta delle misure di esito o nel reclutamento. I risultati di questo studio non saranno divulgati ai partecipanti e alle comunità collegate.

analisi statistiche

Le variabili continue sono state espresse come mediana (IQR) e confrontate con il test U di Mann-Whitney. Le variabili categoriche sono state espresse come numeri (percento) e confrontate con il test χ2 o il test esatto di Fisher. Le tabelle di contingenza 2×2 sono state stabilite per determinare la sensibilità, la specificità, il valore predittivo positivo (PPV) e il valore predittivo negativo (NPV). Un valore bilaterale inferiore a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando IBM SPSS Statistics, V.23.0 se non diversamente indicato.

Le letture di alta qualità sono state prima mappate al genoma di riferimento umano (hg19) e quindi le letture non umane sono state allineate a quattro database del genoma microbico (batteri, funghi, virus e parassiti). Dopo aver rimosso il microbico di fondo che appariva nei controlli negativi (tabella supplementare online 1), è stata utilizzata la nuova stima bayesiana dell'abbondanza per stimare l'abbondanza relativa delle specie (tabella supplementare online 2). L'indice di diversità alfa per ciascun campione è stato calcolato in base agli indici Shannon e Simpson e la diversità beta è stata calcolata in base alla distanza UniFrac ponderata e alla distanza Bray-Curtis. I valori P per l'analisi alfa e beta sono stati calcolati utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. La dimensione dell'effetto dell'analisi discriminante lineare (LDA) è stata utilizzata per trovare specie significativamente diverse tra i gruppi, con soglie di log10 Punteggio LDA maggiore o uguale a 2 e valore p minore o uguale a 0,05. La correlazione tra il microbiota rappresentativo e i dati clinici è stata valutata da Spearman.

RISULTATI

Reclutamento dei pazienti e caratteristiche cliniche

Sono stati esaminati in totale 123 pazienti con 128 campioni BALF e 111 pazienti sono stati arruolati in questo studio.

A ventisei pazienti è stata diagnosticata probabile IPA (denominata IPA) e 85 controlli senza IPA (denominata controllo) (figura 1). I confronti delle caratteristiche demografiche e cliniche tra il gruppo IPA e il gruppo di controllo sono stati riassunti nella Tabella 1. La popolazione dello studio aveva un'età media di 60 (IQR, 53-73) anni e il 66,7% era costituito da uomini. Complessivamente, 33 pazienti (29,7%) avevano una storia di fumo. Ventidue pazienti (19,8 per cento) avevano malattia polmonare ostruttiva cronica. Quindici pazienti (13,5%) avevano ricevuto corticosteroidi e 36 pazienti (32,4%) erano considerati immunocompromessi (tabella supplementare online 3). I pazienti con probabile IPA avevano un tasso significativamente più alto di fattori di rischio noti per l'aspergillosi rispetto a quelli senza IPA, incluso il trattamento con corticosteroidi per più di 28 giorni (38,5% vs 5,9%, p=0.000) e pazienti immunocompromessi status (53,8 percento contro 25,9 percento , p=0.008). Non sono state riscontrate differenze significative nel punteggio di valutazione dell'insufficienza d'organo sequenziale e confusione, urea, frequenza respiratoria, pressione sanguigna e punteggio di età 65 dei pazienti tra i due gruppi al momento del ricovero.

Microbiologici, immagini TC e reperti di laboratorio

Isolati di Aspergillus fumigatus sono stati ottenuti per 6 su 26 (23,1%) casi probabili di IPA, seguiti da Aspergillus flavus per 3 su 26 (11,5%) e Aspergillus ustus per 1 su 26 (3,8%) (tabella 2). L'ispessimento della parete bronchiale è stato mostrato più spesso alla TC del torace nell'IPA (44,0 percento contro 12,8 percento, p=0.000) (tabella 2). I pazienti con IPA hanno livelli significativamente più bassi di conta totale dei linfociti (774,1 vs 1088,9, p=0.009) e sottopopolazione di linfociti, inclusa la conta dei linfociti CD3 più T (553,0 vs 782,6, p=0.016), CD4 più conta dei linfociti T (287,9 vs 409,5, p=0.031) e conta dei linfociti T CD4− CD8− (25,9 vs 45,0, p=0.007 ) rispetto ai pazienti di controllo (tabella supplementare online 4), che indica la funzione immunitaria compromessa dei pazienti con IPA.

Confronto delle prestazioni diagnostiche

Per confrontare le prestazioni diagnostiche di BALF mNGS e dei test convenzionali per distinguere i casi con probabile IPA dai casi senza probabile IPA, i risultati sono stati mostrati nella Figura 2. Il test GM (57,7%) ha avuto la massima sensibilità nel rilevare l'Aspergillus spp, seguito da mNGS (42,3 percento ), cultura (30,8 percento ) e diffamazione (7,7 percento ). Rispetto allo striscio, mNGS ha mostrato una sensibilità significativamente più alta, 42,3% contro 7,7%, p=0.{{30}}1). Il mNGS, la coltura e lo striscio avevano una specificità dell'100 percento, mentre il test GM aveva una specificità del 92,9 percento, con una differenza significativa tra mNGS (o coltura o striscio) e il test GM (p{ {18}}.029). Il PPV di mNGS, coltura e striscio per l'identificazione di Aspergillus spp era del 100%, mentre il test GM era del 71,4%. Il VAN si è classificato come test GM (87,8 percento), mNGS (85,0 percento), coltura (82,5 percento) e striscio (78,0 percento), senza differenze significative tra questi metodi. Abbiamo analizzato le differenze di sensibilità/specificità/PPV/NPV di GM su siero rispetto a BALF, utilizzando un indice GM fluido BAL maggiore o uguale a 1,0 o un indice GM sierico maggiore o uguale a 1,0 come positivo, secondo EORTIC 2019 /MSG. Era significativamente più alto nella sensibilità ma inferiore nella specificità del BALF GM rispetto a quello del siero GM (57,7% vs 26,9% , p=0.048, 92,9% vs 100% , 0,029, rispettivamente), che è stato mostrato in tabella supplementare online 5. Non c'erano differenze in PPV e NPV.

Esiti clinici

Non ci sono state differenze significative nella mortalità di 28-giorno, 60-giorno e 90-giorno tra i due gruppi (tabella 3). La mortalità ospedaliera (30,8% vs 11,8%, p=0.021) e i tassi di mortalità in unità di terapia intensiva (ICU) (42,1% vs 17,5%, p=0.029) erano significativamente più alti nel gruppo IPA che nel gruppo di controllo. La distribuzione dei pazienti che rientrano in ciascuna categoria della 7-scala di categoria ha mostrato una differenza statistica tra i due gruppi entro il giorno 28 (p=0.017); tuttavia, la significatività con i test statistici non è stata raggiunta nella 7-scala ordinale di categoria entro i giorni 1, 7 e 14 (figura 3). Più farmaci antifungini sono stati somministrati al 23,1% dei pazienti con probabile IPA, rispetto al 5,9% dei pazienti senza probabile IPA (p=0.01). La percentuale di pazienti trattati con voriconazolo era notevolmente più alta nei casi con probabile IPA (53,9% vs 8,2%, p=0.000). Non c'era alcuna differenza significativa nell'uso di amfotericina B e caspofungin tra i due gruppi (tabella 3).

Analisi del microbioma polmonare

Per confrontare la composizione complessiva e la diversità della firma microbica polmonare nei pazienti con IPA e nel controllo, abbiamo analizzato campioni BALF raccolti da 109 pazienti con CAP, inclusi 24 casi (2 pazienti mancanti a causa della perdita di dati mNGS) con diagnosi di probabile IPA (denominati IPA) e 85 casi senza probabile IPA (controllo denominato). Abbiamo valutato la diversità delle comunità polmonari utilizzando l'indice di diversità di Shannon e Simpson. C'è stata una diminuzione della diversità sia nell'indice di diversità di Shannon che di Simpson nei pazienti IPA rispetto ai pazienti non IPA nonostante differenze significative (figura 4A, B). Utilizzando la metrica UniFrac pesata e la metrica Bray-Curtis, abbiamo osservato che la diversità dei pazienti IPA differiva significativamente dai pazienti non IPA (p<0.001; Wilcoxon test), suggesting that lung community structure of patients diagnosed with probable IPA differed substantially from those without probable IPA (figure 4C, D). Based on the average relative abundance, we plotted the top 10 phyla, genera, and species among 2 groups. 

Nella coorte complessiva, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes e Ascomycota erano i phyla più abbondanti, mentre Prevotella, Streptococcus, Acinetobacter e Pneumocystis erano i generi più comuni (figura 5A, B). L'abbondanza relativa delle prime 10 specie classificate come Pneumocystis jirovecii, Acinetobacter baumannii, Lautropia mirabilis, Streptococcus oralis, Corynebacterium striatum, Human betaherpesvirus 5, Rothia mucilaginosa, Staphylococcus aureus, Prevotella melanogenic, Nocardia Farcinica, con solo H. betaherpesvirus 5 è stata la significativamente diverso tra i due gruppi (figura 5C). Concentrandosi sulle specie differenziali nell'IPA rispetto ai loro controlli, abbiamo trovato 21 specie con punteggio LDA maggiore o uguale a 2 e p<0.05, which H. betaherpesvirus 5, A. fumigatus, Aspergillus niger, Citrobacter braakii, Bacillus thermoamylovorans, Helcococcus kunzite, Lactobacillus delbrueckii, Burkholderia dolosa, Marinobacter hydrocarbonoclasticus, Riemerella anatipestifer, Corynebacterium halotolerant, and Lactobacillus plantarum were significantly abundant in the cases diagnosed with probable IPA, and Streptococcus salivarius, Citrobacter freundii, Paraburkholderia fungorum, Dolosigranulum program, Prevotella timonensis, Sphingobium yanoikuyae, Serratia marcescens, and Corynebacterium oculi were enriched in cases without probable IPA (figure 5D, online supplemental figure 1).

Per indagare ulteriormente sulla correlazione tra i dati clinici e il microbiota polmonare dell'IPA, abbiamo eseguito il test di correlazione basato sui ranghi di Spearman sulle 21 specie significativamente diverse con esiti clinici e risultati di laboratorio (figura 6A). Abbiamo osservato che 19 specie diverse erano significativamente correlate con 7 esiti clinici e 22 biomarcatori di laboratorio, in particolare S. salivarius, P. Sinensis e H. betaherpesvirus 5. S. salivarius era principalmente correlato positivamente con otto biomarcatori di laboratorio, inclusi globuli rossi, totale linfociti, linfociti T, cellule T helper, linfociti T citotossici, linfociti B, potassio sierico e albumina e negativamente relativo con aspartato aminotransferasi, bilirubina diretta e D-dimero. Considerando che, S. salivarius era principalmente associato negativamente a 11 esiti clinici, tra cui mortalità in terapia intensiva, durata della degenza in terapia intensiva, mortalità ospedaliera, mortalità al giorno 28 e tempo per l'indipendenza dall'ossigeno supplementare entro 28 giorni, e correlata positivamente con la durata della mortalità della degenza ospedaliera al giorno 28, giorni senza ventilazione entro 28 giorni e tempo per il miglioramento dello stato clinico. Simile a S. salivarius, P. timonensis era principalmente positivamente relativo a sei biomarcatori di laboratorio, inclusi linfociti totali, linfociti T, cellule T helper, cellule T CD4−CD8−, linfociti B e potassio sierico, e correlato negativamente con la procalcitonina.

Allo stesso modo, P. timonensis era principalmente associato negativamente alla durata della degenza in terapia intensiva e alla mortalità ospedaliera, ma positivamente con i giorni senza ventilazione entro 28 giorni. Opposto a S. salivarius e P. Sinensis, H. betaherpesvirus 5 è stato associato negativamente a sei biomarcatori di laboratorio, inclusi linfociti totali, linfociti T, cellule T helper, cellule T CD4 più CD8 più, linfociti B e potassio sierico e parente positivo con azoto ureico nel sangue. Nel frattempo, l'H. betaherpesvirus 5 era principalmente correlato negativamente con la durata della degenza in terapia intensiva e il tempo per l'indipendenza dall'ossigeno supplementare entro 28 giorni. Queste osservazioni hanno suggerito che la disbiosi delle comunità microbiche nel polmone è associata alle condizioni fisiopatologiche del paziente e quindi può influenzare gli esiti clinici.

Per indagare ulteriormente l'impatto clinico di 21 specie significativamente diverse, abbiamo effettuato l'analisi di sopravvivenza tracciando la curva di probabilità cumulativa. Come mostrato nelle Figure 6B e C, il rilevamento di A. fumigatus e H. betaherpesvirus 5 è stato significativamente predittivo di esiti peggiori in terapia intensiva (p=0.045, 0.032) . Mentre nella Figura 6D, E, abbiamo scoperto che il rilevamento di S. salivarius e P. timonensis era predittivo in modo estremamente significativo di risultati migliorati in terapia intensiva (p=0.0031, 0,0054). Abbiamo quindi concluso che nel microbiota polmonare della CAP, gli esiti in terapia intensiva possono essere previsti dalla composizione della comunità, in particolare A. fumigatus, H. betaherpesvirus 5, S. salivarius e P. Sinensis.

DISCUSSIONE

In questo studio di coorte retrospettivo, abbiamo esaminato le caratteristiche cliniche dell'IPA. È interessante notare che i pazienti classificati come aventi probabile infezione da Aspergillus avevano una mortalità ospedaliera (30,8%) e in terapia intensiva (42,1%) significativamente più elevata rispetto al controllo. La mortalità al giorno 28, sebbene non statisticamente significativa, era numericamente più alta nei pazienti IPA rispetto al controllo. Questi dati hanno suggerito che i pazienti con infezione da Aspergillus tendono ad avere un tasso di mortalità precoce più elevato. Uno studio precedente riportava una stima del 45% della mortalità in terapia intensiva e del 26% della mortalità in ospedale18 Tra l'aspergillosi tracheobronchiale invasiva, un'entità rara di IPA, i tassi di mortalità per 30-giorni e 90-giorni erano entrambi del 90% . 19 Loughlin et al. hanno riferito che la mortalità in UTI nei pazienti con probabile infezione da Aspergillus non era significativamente più alta rispetto a quelli senza infezione da Aspergillus, 4 probabilmente a causa dello stato generalmente critico nella coorte di pazienti con polmonite associata a ventilazione meccanica in terapia intensiva. In questo studio, la condizione generale dei pazienti arruolati con CAP era relativamente lieve, che può essere notevolmente aggravata dall'infezione da Aspergillus e potenzialmente pericolosa per la vita.

Cornillet et al. hanno suggerito che le caratteristiche cliniche non specifiche e le difficoltà diagnostiche dei pazienti con IPA, in particolare quando i pazienti senza neutropenia, portano facilmente a una gestione subottimale e a un inizio ritardato del trattamento, con conseguente elevata mortalità e morbilità.20 Dati i devastanti tassi di mortalità dei pazienti con IPA, e una diagnosi accurata è evidenziata e urgentemente necessaria per un efficace trattamento antimicotico per ridurre il tasso di morbilità e mortalità. Nell'ultimo decennio, il rilevamento di GM è stato ampiamente utilizzato nella diagnosi di IPA.21 Tuttavia, il test GM per campioni di siero ha una sensibilità limitata nella diagnosi di IPA in ospiti non neutropenici.22 Invece, il rilevamento di GM in campioni di fluido BAL di pazienti a rischio di IPA ha un'accuratezza diagnostica eccellente,23 24 perché il GM viene rilasciato prima ea concentrazioni più elevate nel fluido BAL rispetto al siero.25 Recentemente, mNGS ha svolto un ruolo sempre più importante nella diagnosi delle malattie fungine. Ding et al hanno dimostrato che la sensibilità di mNGS era significativamente superiore alla coltura nel rilevare Candida albicans. 9 In questo studio, il BALF è stato raccolto direttamente dal tratto respiratorio inferiore, che ha evitato la contaminazione dal microbiota orale. Aspergillus in BALF è stato rilevato mediante mNGS, coltura, striscio e test GM. I risultati hanno mostrato che NGS aveva specificità e PPV paragonabili alla coltura nel rilevamento di Aspergillus. Sebbene la sensibilità di mNGS fosse inferiore rispetto al test GM, mNGS ha mostrato una maggiore sensibilità rispetto allo striscio e una maggiore specificità rispetto ai test su siero e BALF GM. Questi risultati hanno indicato che mNGS agisce come un utile test non basato sulla coltura per rilevare l'Aspergillus, suggerendo un complemento ai test microbiologici di routine nella diagnosi dei pazienti a rischio di IPA.

Il nostro studio ha scoperto che i pazienti con CAP con Aspergillus avevano maggiori probabilità di essere coinfettati con infezione batterica o (e) virale a causa dello stato immunocompromesso e del trattamento con corticosteroidi. È stato riferito che i pazienti con influenza immunocompromessi avevano un'incidenza di IPA fino al 32% , mentre, nel gruppo di casi di influenza non immunocompromessi, l'incidenza era del 14% .18 Con l'emergere della pandemia COVID-19 e l'uso di corticosteroidi in pazienti con grave aspergillosi polmonare (CAPA) associata a COVID-19,26 COVID{7}}è stato riportato in diversi case report.27-29 In una meta-analisi, l'incidenza e la mortalità di CAPA in terapia intensiva erano rispettivamente del 10,2% e del 54,9%.30

A causa delle vaste letture microbiche nei dati mNGS che possono essere utilizzate per analizzare le firme microbiche in numerose malattie, il nostro studio ha tentato di esplorare la differenza nella struttura e nella composizione del microbioma tra i pazienti IPA e i pazienti CAP non IPA analizzando i dati mNGS. Il nostro studio attuale comprendeva il microbiota polmonare di 24 pazienti con IPA e 85 pazienti con CAP non IPA. È stata studiata la relazione tra microbiota diverso e dati clinici per tutti i 109 pazienti con CAP. Per la diversità alfa, non vi erano differenze significative nell'indice Shannon e nell'indice Simpson del microbiota nei pazienti IPA e nei pazienti CAP non IPA, a dimostrazione che la diversità all'interno del campione delle comunità era simile tra i pazienti IPA e i pazienti non IPA.

Per la diversità beta, i nostri risultati hanno mostrato una differenza sostanziale nella distanza UniFrac ponderata (p=2.1×10−6) e nella distanza Bray-Curtis (p=0.033) tra IPA e non IPA Pazienti con CAP, indicando un potenziale effetto di Aspergillus spp sulla struttura del microbiota polmonare nei pazienti con diagnosi di IPA. Studi simili hanno mostrato differenze significative nella diversità beta del microbiota tra IPA e controlli.11 Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che gli agenti causali nei controlli erano complessi, che possono essere qualsiasi patogeno della CAP (come batteri, virus, funghi, parassiti e persino patogeni atipici) eccetto Aspergillus. Pertanto l'eterogeneità microbica polmonare nel controllo era superiore all'IPA. Nel frattempo, questi studi hanno dimostrato che Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria e Bacteroidetes erano i phyla più abbondanti nella coorte IPA.11 Tuttavia, oltre ai batteri, il nostro studio ha rilevato che l'abbondanza relativa di Ascomycota era elevata anche a livello di phylum, per la metagenomica può raccogliere quasi tutti gli acidi nucleici del microbiota, inclusi batteri, funghi, virus e parassiti.

Le specie significativamente diverse, in particolare S. salivarius, P. Sinensis e H. betaherpesvirus 5 erano fortemente correlate ai dati clinici. S. salivarius e P. timonensis erano positivamente correlati a biomarcatori di laboratorio come i linfociti T e negativamente correlati a esiti clinici come la mortalità ospedaliera. Considerando che, H. betaherpesvirus 5 era correlato negativamente a biomarcatori di laboratorio come i linfociti T e positivamente correlato a esiti clinici come la mortalità ospedaliera. Precedenti studi hanno dimostrato che S. salivarius è un batterio probiotico che può inibire l'adesione dello pneumococco alle cellule epiteliali faringee.31 Inoltre, un altro studio ha dimostrato che gli isolati di S. salivarius avevano una capacità superiore di inibire la crescita di Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus. 32 Tutti questi studi hanno coinciso con il nostro studio secondo cui S. salivarius era positivamente correlato con il miglior esito clinico dei pazienti.

Il possibile meccanismo di S. salivarius correlato positivamente con il miglioramento dell'esito dei pazienti potrebbe essere che possono inibire la crescita del potenziale patogeno e attivare il sistema immunitario dell'ospite. Per P. Sinensis, uno studio precedente ha mostrato che P. timonensis potrebbe indurre drammaticamente l'espressione di mucine associate alla membrana nel modello tridimensionale delle cellule epiteliali endometriali e formare il biofilm nella superficie epiteliale, che a sua volta influenza l'adesione di altri batteri .33 La ragione della correlazione positiva con il miglior esito clinico dei pazienti potrebbe essere la resistenza alla colonizzazione di P. Sinensis nel polmone e l'attivazione del sistema immunitario dell'ospite. In ambito clinico, H. betaherpesvirus 5 può creare infezioni latenti per tutta la vita in persone sane. Tuttavia, una volta immunocompromesso, H. betaherpesvirus 5 può essere riattivato, ad esempio, trapiantati di organi solidi e pazienti HIV positivi.34 Pertanto, la riattivazione di H. betaherpesvirus 5 ha indicato il sistema immunitario indebolito e gli scarsi risultati clinici dei pazienti IPA .

Il nostro studio ha diversi limiti. In primo luogo, lo studio retrospettivo è stato progettato per analizzare i dati raccolti ed è stato limitato a una dimensione del campione relativamente piccola, che potrebbe predisporlo a introdurre bias da informazioni incomplete. In secondo luogo, questo era lo studio di osservazione. Sebbene abbiamo trovato alcune correlazioni interessanti tra il microbiota polmonare e i dati clinici, la relazione causale deve essere risolta da uno studio prospettico di coorte o da un esperimento sui meccanismi, come un esperimento sugli animali, che sarà il prossimo passo del nostro studio. In caso contrario, lo studio ha identificato i pazienti con probabile infezione da Aspergillus rigorosamente sulla base dei nuovi criteri diagnostici EORTIC/MSG 2019, quindi alcuni casi non potevano soddisfare i criteri per una probabile diagnosi di IPA a causa dell'assenza dei classici fattori dell'ospite.

Contributori

Concetto di studio e design: YL, ZA e HX. Acquisizione dati: ZA, ML, HL e MD. Analisi e interpretazione dei dati: ZA e HX. Stesura del manoscritto: ZA, HX e YL. Revisione critica del manoscritto per importanti contenuti intellettuali: HX, ZA e YL. Analisi statistica: ZA, HL e HX. Supporto amministrativo, tecnico o materiale: HX, HL e YL. Tutti gli autori hanno contribuito all'articolo e hanno approvato la versione presentata.

Finanziamento

Progetto di ricerca scientifica medica di Chongqing (progetto congiunto della Commissione per la salute di Chongqing e dell'Ufficio per la scienza e la tecnologia (2022GDRC010)).

Interessi conflittuali

Nessuno dichiarato.

Paziente e coinvolgimento del pubblico

I pazienti e/o il pubblico non sono stati coinvolti nei piani di progettazione, conduzione, segnalazione o diffusione di questa ricerca.

Consenso del paziente alla pubblicazione

Non applicabile.

Approvazione etica

Questo studio coinvolge partecipanti umani. Questo studio è stato approvato dal comitato etico del First Affiliated Hospital of Chongqing Medical Hospital (numero approvato 2021-301). I partecipanti hanno dato il consenso informato a partecipare allo studio prima di prendervi parte.

Provenienza e peer review

Non commissionato; sottoposto a revisione paritaria esterna.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati

Tutti i dati rilevanti per lo studio sono inclusi nell'articolo o caricati come informazioni supplementari online.

Materiale supplementare

Questo contenuto è stato fornito dall'autore(i). Non è stato verificato da BMJ Publishing Group Limited (BMJ) e potrebbe non essere stato sottoposto a revisione paritaria. Eventuali opinioni o raccomandazioni discusse sono esclusivamente quelle degli autori e non sono approvate da BMJ. BMJ declina ogni responsabilità e responsabilità derivante da qualsiasi affidamento riposto sul contenuto. Laddove il contenuto includa materiale tradotto, BMJ non garantisce l'accuratezza e l'affidabilità delle traduzioni (incluse, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, normative locali, linee guida cliniche, terminologia, nomi di farmaci e dosaggi di farmaci) e non è responsabile per eventuali errori e/o o omissioni derivanti dalla traduzione e adattamento o altro.

Accesso libero

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