Clonazione, identificazione funzionale e analisi dell'espressione della calcone sintasi da Cistanche Tubulosa

Riassunto: Obiettivo

Studiare la funzione dicalcone sintasi da Cistanche tubulosae il modello di espressione del gene CtCHS nei fiori bianchi, rossi e viola.

MetodiIl gene CtCHS è stato clonato mediante RT-PCR ed è stata effettuata l'analisi bioinformatica. Il plasmide pET-28a-CtCHS è stato trasferito nell'Escherichia coli per indurre l'espressione proteica mediante IPTG. La proteina ricombinante CtCHS è stata incubata con i substrati p-coumaroyl CoA e malonil CoA e i prodotti sono stati rilevati mediante HPLC e MS. Il plasmide pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS è stato trasferito nel protoplasto di Arabidopsis thaliana per osservare la localizzazione subcellulare della proteina CtCHS. Il modello di espressione del gene CtCHS nei fiori di C. tubulosa con tre colori è stato rilevato mediante qRT-PCR.

RisultatiÈ stato clonato un gene CtCHS. La lunghezza dell'ORF (open reading frame) era 1173 bp, codificava 390 aminoacidi, e il peso molecolare della proteina era 42 8000.

ESTRATTO DI CISTANCHE BIOLOGICHE CON 30% ECHINACOSIDE E 12% ACTEOSIDE

CtCHS conteneva i residui catalitici Cys164, His303, Asn336, che erano conservati nella calcone sintasi. La proteina CtCHS è stata espressa in E. coli e purificata per ottenere la proteina ricombinante. La proteina CtCHS potrebbe catalizzare p-cumaroil CoA e malonil CoA per produrre naringenina calcone. La proteina CtCHS era localizzata principalmente nel citoplasma. Il gene CtCHS era altamente espresso nei fiori viola e rossi e i relativi livelli di espressione erano rispettivamente 8,44 e 3,21 volte superiori a quelli dei fiori bianchi.

Conclusione Un gene CtCHS è stato clonato dal fiore di C. tubulosa e la proteina è stata espressa. La proteina CtCHS ha la funzione calcone sintasi e l'espressione del gene CtCHS è maggiore nei fiori più scuri, indicando che il gene CtCHS può regolare il colore dei fiori di C. tubulosa, il che pone le basi per ulteriori ricerche sul meccanismo di regolazione del colore dei fiori di C. . tubulosa.

Parole chiave: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; calcone sintasi; analisi dell'attività enzimatica; localizzazione subcellulare; analisi dell'espressione

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT è il genere pianta Pyreal, che è distribuita naturalmente nello Xinjiang meridionale [1] nell'area Hetian dello Xinjiang [2]. I fiori della pipa hanno un alto valore medicinale. I suoi gambi di carne sono una delle fonti della versione 2020 di "Farmacopea cinese". [3] La ricerca sugli steli carnosi del cordone dei fiori a pipa è aumentata, ma ci sono relativamente poche ricerche biologiche sui suoi fiori. Il periodo di fioritura dei fiori a pipa va da aprile a maggio [4], principalmente Ci sono tre colori, bianco , rosso e viola. I fiori a pipa sono ricchi di colore, ma il loro meccanismo di regolazione del colore dei fiori non è stato segnalato. Le classi sono correlate al tipo, al contenuto, al contenuto e alla distribuzione della struttura del tessuto dei petali, al pigmento e alla regolazione dei fattori ambientali e fattori genetici [5]. Il pigmento nei fiori delle piante comprende principalmente tre categorie: flavonoidi, carotene e beetina, la gamma di colori più ampia [7]. I tipi e il contenuto di flavonoidi influenzano il colore di molte piante, ad esempio come le tre varietà di Paeonia Lactiflora Pall.

Appare come bianco, e il colore principale del colore contiene il colore rosso e la bella competenza rende i fiori presenti come rosso porpora [8]. Il colore dei fiori è una caratteristica importante di molte piante ornamentali ed è anche il fattore chiave che attira gli insetti rosa [9]. Gli studi hanno dimostrato che viene tramandato. La più alta frequenza di visite di insetti è la pianta di cistanche viola intenso [10]. Per la ricerca biologica sulla ricerca genetica sintetica dei cistanoidi nei fiori di cistanosaurus dei fiori tubolari, è utile chiarire il meccanismo di controllo della colorazione dei cordoni dei fiori tubolari, fornendo basi teoriche per migliorare il colore della tecnologia di ingegneria genetica, promuovendo i suoi colori più ricchi, aumentando la visualizzazione, ampliare la portata delle applicazioni.

La via biosintetica diflavonoidiinizia con ilvia dei fenilpropanoidi. La fenilalanina viene prima convertita in acido cinnamico sotto l'azione della fenilalanina ammonialasi (PAL) e l'acido cinnamico viene 4-idrossilato dall'acido cinnamico. L'enzima (acido cinnamico-4-idrossilasi, C4H) e il 4-coumarato coenzima A ligasi (4-coumarato coenzima A ligasi, 4CL) catalizzano la reazione per generare 4-coumaroil-CoA [11]. Una molecola di 4-coumaroil-CoA e tre molecole di malonil-CoA sono catalizzate dalla calcone sintasi (CHS) per generare naringenina calcone, che hacomposti flavonoidi.Lo scheletro di base della calcone isomerasi, della flavanone-3-idrossilasi, della diidroflavonolo 4-reduttasi, ecc. genera una varietà di flavonoidi come isoflavoni, flavonoli, antociani, ecc. [12]. Essendo un enzima chiave nella via biosintetica dei flavonoidi, il CHS regola il contenuto di flavonoidi nelle piante e svolge anche un ruolo importante nella regolazione del colore dei fiori delle piante [13]. Ad esempio, il silenziamento genico post-trascrizionale di Gentiana scabra Bunge CHS può inibire la biosintesi degli antociani e causare uno sbiancamento specifico dei lobi della corolla [14]. Silenziamento del gene CHS di Actinidia eriantha Benth. Il CHS riduce il contenuto di antociani nei petali e fa sì che il colore dei petali rossi diventi più chiaro [15]. Pertanto, in questo studio, un gene CtCHS è stato clonato dai fiori di Cistanche deserticola e su di esso sono state eseguite analisi bioinformatica, espressione e purificazione procariotica, analisi dell'attività enzimatica, analisi della localizzazione subcellulare e analisi dell'espressione in tre colori di fiori per esplorare la funzione di CtCHS. La proteina e il pattern di espressione del gene CtCHS sono stati utilizzati per esplorare preliminarmente la relazione tra CtCHS e il colore dei fiori di Cistanche deserticola, che ha gettato le basi per lo studio del meccanismo di regolazione del colore dei fiori di Cistanche deserticola.

1 Materiali e strumenti

1.1 Materiali

I fiori di Cistanche tuberosa sono stati raccolti nella contea di Yutian, nella prefettura di Hotan, nello Xinjiang, nel maggio 2018. Durante il campionamento è stato seguito il principio casuale e sono stati selezionati fiori di Cistanche tuberosa con un buono stato fisiologico e un'altezza della pianta costante. Tre ceppi di Cistanche deserticola con tre colori di fiori bianco, rosso e viola sono stati presi e identificati come Cistanche tubulosa (Schenk) Wight dal professor Tu Pengfei della Scuola di Farmacia dell'Università di Pechino. Sono stati rapidamente congelati in azoto liquido, conservati su ghiaccio secco e trasportati a Pechino. Le cellule chimicamente competenti di E. coli DH5 sono state acquistate da Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., mentre le cellule chimicamente competenti di E. coli BL21 (DE3) sono state acquistate da Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Il vettore è stato acquistato da Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA è stato acquistato da Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenina -chalcone sono stati acquistati da Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., e naringenina è stata acquistata da Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Strumenti

Spettrofotometro Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, USA); strumento per PCR in gradiente (azienda Eppendorf, Germania); Strumento per PCR quantitativo a fluorescenza CFX 96, imager su gel UVP, strumento per elettroforesi su gel, strumento per elettroforesi proteica (BioRad Company, USA) ;EnSpire

Lettore di micropiastre (PerkinElmer Company, USA); incubatore a temperatura costante (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Oscillatore a piena temperatura di grande capacità DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Un oscillatore a temperatura costante a bagnomaria (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Banco da lavoro ultra pulito AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); sterilizzatore a vapore ad alta pressione (TOMY Company, Giappone); Strumento per acqua pura Milli Q (Millipore, Stati Uniti); LC-20Un cromatografo in fase liquida ad alta efficienza (Shimadzu Company, Giappone); Spettrometria di massa ad alta risoluzione UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, USA); Microscopio confocale laser FV1200 (Olympus Company, Giappone).

2 Metodi sperimentali

2.1 Estrazione dell'RNA e sintesi del cDNA. I fiori di Cistanche deserticola sono stati macinati in azoto liquido e poi sottoposti al test di estrazione dell'RNA.

L'RNA totale è stato estratto utilizzando un kit (Norgen, Cat 17200), la concentrazione e la qualità dell'RNA sono state rilevate da NanoDrop 2000C e i campioni di RNA con un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,1 sono stati selezionati per la sintesi della trascrizione inversa del cDNA. La trascrittasi inversa M-MLV (Promega, M170B) è stata utilizzata per trascrivere in senso inverso l'RNA totale qualificato in cDNA. Le operazioni sperimentali sono state eseguite secondo le istruzioni.

2.2 Clonazione del gene CtCHS

Sulla base dei dati del trascrittoma del fiore di Cistanche deserticola del nostro gruppo di ricerca [16], è stato selezionato un CtCHS con un frame di lettura aperto completo e il software SnapGene è stato utilizzato per progettare primer specifici basati sulla sequenza genetica (Tabella 1). L'amplificazione PCR è stata eseguita utilizzando il cDNA del fiore di Cistanche deserticola come modello. Il sistema di amplificazione era 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, primer upstream e downstream (10 μmol/L) 2 μL ciascuno, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

DNA polimerasi 1 μL, ddH2O 17 μL. Le condizioni di reazione erano: pre-denaturazione a 95 gradi per 3 minuti; 25 cicli di denaturazione a 95 gradi per 15 s, ricottura a 55 gradi per 15 s ed estensione a 72 gradi per 1 min; ed estensione della reazione a 72 gradi per 5 min. Il prodotto della PCR è stato rilevato mediante elettroforesi su gel di agarosio all'1% e il kit di purificazione del DNA (Novizan, Cat DC301-01) è stato utilizzato per il recupero del gel, quindi il DNA recuperato è stato purificato mediante un kit di clonazione rapida (Novizan, Cat C601-01). Il frammento di DNA è stato legato con il vettore pCE2 TA/Blunt-Zero, trasformato in cellule competenti di Escherichia coli DH5 e, dopo aver coltivato durante la notte a 37 gradi, i singoli ceppi clonati sono stati selezionati e inviati all'azienda per il sequenziamento.

Tabella 1 Sequenze di primer

2.3 Analisi bioinformatica

Utilizzare il software online ProtParam per analizzare le proprietà fisiche e chimiche delle proteine; utilizzare lo strumento online Prot Scale per analizzare l'idrofilicità/idrofobicità delle proteine; utilizzare lo strumento online SOPMA per prevedere la struttura secondaria delle proteine; utilizzare il software di analisi online SWISS-MODEL per prevedere la struttura terziaria delle proteine; utilizzare il software online TMHMM Prevedere la struttura transmembrana della proteina; utilizzare il software DNAMAN per confrontare l'omologia di CtCHS con le sequenze di aminoacidi CHS di altre specie; utilizzare il software MEGA-X per costruire un albero filogenetico, utilizzando il neighbor-joining (NJ) e la correzione di Poisson. La distanza evolutiva viene calcolata utilizzando il metodo Bootstrap e il numero di ripetizioni Bootstrap è 1000 volte.

Per un ulteriore rilevamento è stato utilizzato UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Le condizioni della fase liquida erano colonna Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3,0 mm, 1,7 μm), temperatura della colonna 40 gradi, naringenina , calcone e naringenina. Il volume di caricamento della sostanza di controllo è di 4 μL e il volume di caricamento del prodotto della reazione enzimatica è di 7 μL. Come fase mobile viene utilizzata l'acqua (A)-acetonitrile (B). Il gradiente di eluizione è: da 0 a 5 minuti, 30% B; da 5 a 15 minuti , 30%~60% B; 15~20 minuti, 60%~100% B; 20~25 minuti, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. La portata volumetrica è 0,3 ml/min. Le condizioni della spettrometria di massa sono sorgente ionica elettrospray, azoto come gas di trasporto, pressione del gas guaina 3,5 MPa, pressione del gas ausiliario 1,0 MPa, pressione di spruzzatura 3500 V, temperatura capillare 350 gradi, temperatura di riscaldamento del gas ausiliario 200 gradi, modalità ioni positivi e negativi, scansione l'intervallo ionico m/z è 100-1500, la risoluzione MS completa è 35 000, la risoluzione dd-MS2 è 17 500, (N)

CE/incrementato nce impostato su 35, 60.

2.6 Localizzazione subcellulare della proteina CtCHS

Sulla base della sequenza CtCHS e del principio della clonazione senza soluzione di continuità, sono stati progettati primer con siti di taglio enzimatico Kpn Ⅰ e BamH Ⅰ e i corrispondenti frammenti target sono stati amplificati mediante PCR. Il plasmide pCAMBIA1300-35S-GFP è stato digerito con endonucleasi di restrizione Kpn Ⅰ e BamH Ⅰ e il frammento target e il vettore sono stati collegati attraverso il kit di clonazione senza soluzione di continuità (Novizan, Cat C115-01) e quindi trasferiti nelle cellule competenti di E. coli DH5. , selezionare ceppi di cloni singoli per il sequenziamento ed estrarre plasmidi dai ceppi corretti. I plasmidi pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS e pCAMBIA 1300-35S-GFP sono stati trasformati in protoplasti di Arabidopsis thaliana utilizzando PEG4000 e coltivati ​​in condizioni di scarsa illuminazione per 8-10 ore. La localizzazione subcellulare della proteina CtCHS è stata osservata al microscopio confocale laser.

2.7 Analisi del pattern di espressione di CtCHS

Sulla base della sequenza CtCHS, DNAMAN è stato utilizzato per progettare primer quantitativi con fluorescenza in tempo reale, con F-box come gene di riferimento interno. Le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 1. L'espressione relativa di CtCHS nei fiori di Cistanche deserticola di diversi colori è stata rilevata mediante PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale. Utilizzare TransStart Green qPCR SuperMix (oro totale, AQ101-02) per misurare con il metodo con colorante fluorescente SYBR Green, sistema di reazione: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, primer a monte e a valle (10

μmol/L) {{0}},2 μL ciascuno, modello di cDNA 0,5 μL, acqua priva di nucleotidasi 4,1 μL, per la reazione è stato utilizzato un metodo a due fasi e la procedura di reazione si è basata sul metodo di Dong Xianjuan et al. [18]. Ciascun campione conteneva 3 repliche biologiche e l'esperimento è stato ripetuto tre volte. I dati sperimentali sono stati analizzati utilizzando Excel-2

L'espressione relativa di CtCHS è stata calcolata utilizzando il metodo −ΔΔCt e GraphPad Prism 8 è stato utilizzato per eseguire analisi di significatività e disegnare istogrammi.