Clonazione, identificazione funzionale e analisi dell'espressione della calcone sintasi dalla cistanche tubulosa Ⅱ

3 Risultati e analisi

3.1 Clonazione del gene CtCHS

Quattro sequenze annotate come "chalcone sintasi" sono state selezionate utilizzando i dati del trascrittoma dei fiori di Cistanches tubulosa. Attraverso il confronto Blast dell'NCBI, si è scoperto che solo una sequenza aveva l'intera lunghezza del gene CHS e aveva un FPKM maggiore di 10. Primer specifici sono stati progettati sulla base di questa sequenza e un frammento di circa 1200 bp è stato ottenuto mediante amplificazione PCR utilizzando CDNA del fiore di Cistanches tubulosa come modello (Figura 1). Il prodotto della PCR è stato recuperato su gel e collegato al vettore pCE2TA/Blunt-Zero. I risultati del sequenziamento erano coerenti con l'analisi del trascrittoma. Il gene è stato chiamato CtCHS. La lunghezza della sequenza è 1173 bp e codifica 390 aminoacidi.

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3.2 Analisi bioinformatica di CtCHS

3.2.1 Proprietà fisiche e chimiche del CtCHS e analisi del dominio transmembrana

Il software online ProtParam è stato utilizzato per analizzare le proprietà fisiche e chimiche della proteina codificata dal gene CtCHS. CtCHS codifica 390 aminoacidi, la formula molecolare è C1908H3041N511O562S22, la massa molecolare relativa è 42 836.54, il punto isoelettrico teorico è 5,85 ed è instabile. Il coefficiente II è 43,24, che è una proteina instabile, e l'idrofilicità media complessiva (GRAVY) è -0,052, che è una proteina idrofila. Lo strumento online Prot Scale è stato ulteriormente utilizzato per analizzare l'idrofilicità/idrofobicità delle proteine. I risultati dell'analisi hanno mostrato che il valore massimo dell'idrofilicità/idrofobicità della proteina CtCHS era 2,422 (342) e il valore minimo era -2,489 (119). La catena peptidica amminoacidica codificata dal gene CtCHS ha più residui amminoacidici idrofili rispetto ai residui amminoacidici idrofobici, quindi è una proteina idrofila. Il software online TMHMM è stato utilizzato per prevedere la struttura transmembrana della proteina. La proteina CtCHS non ha dominio transmembrana.

Fig. 1 Amplificazione PCR del gene CtCHS

3.2.2 Previsione della struttura secondaria e della struttura terziaria della proteina CtCHS

Lo strumento online SOPMA è stato utilizzato per prevedere la struttura secondaria delle proteine. I risultati sono mostrati nella Figura 2-A. Il 44,87% di eliche, il 31,03% di bobine casuali, il 15,64% di catene estese e l'8,46% di fogli costituiscono la struttura secondaria della proteina CtCHS. struttura a livelli. Il software di analisi online SWISS-MODEL è stato utilizzato per prevedere la struttura terziaria della proteina, mentre la struttura cristallina del riso CHS1 è stata utilizzata come modello per prevedere la struttura tridimensionale della proteina CtCHS. I risultati sono mostrati nella Figura 2-B. La consistenza tra Cistanche tubulosa CtCHS e riso CHS1 è 83,55%.

3.2.3 Confronto di sequenze e analisi e applicazione dell'albero filogenetico

Il software DNAMAN esegue il confronto dell'omologia tra CtCHS e le sequenze di aminoacidi CHS di altre specie. I risultati sono mostrati nella Figura 3-C. La sequenza aminoacidica CtCHS è coerente con Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) e Antirrhinum majus L. (P06515.1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) e Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Le sequenze di aminoacidi di CHS sono molto simili, con una somiglianza del 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% e 81,61%.

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Inoltre, l'allineamento di sequenze multiple ha anche mostrato che CtCHS ha conservato i residui catalitici Cys164, His303 e Asn336. Per comprendere ulteriormente la posizione evolutiva di Cistanche tubulosa CtCHS nella famiglia delle piante CHS, è stato utilizzato il software MEGA-X per costruire un albero filogenetico tra CtCHS e proteine ​​CHS di altre piante. I risultati sono mostrati nella Figura 3-DE lewisii AHJ80976.1). ElCHS è strettamente correlato.

3.3 Espressione e purificazione procariotica di CtCHS

Il plasmide pET-28a-CtCHS è stato trasformato nel ceppo di espressione di E. coli BL21 (DE3) e l'espressione della proteina è stata indotta da IPTG a bassa temperatura. La proteina è stata purificata utilizzando una colonna per cromatografia di affinità con ioni di nichel e la proteina purificata è stata rilevata mediante SDSPAGE al 10%. I risultati sono mostrati nella Figura 3. La banda della proteina CtCHS appariva vicina a 40,000, il che è coerente con la massa molecolare relativa della proteina CtCHS di 42.800.

3.4 Analisi dell'attività enzimatica CtCHS

Per identificare la funzione di CtCHS, la proteina CtCHS purificata è stata incubata con malonil-CoA, 4-coumaroyl-CoA e i prodotti sono stati rilevati mediante HPLC e MS. In condizioni naturali, la naringenina-calcone è instabile in soluzione e viene facilmente ciclizzata in naringenina. Pertanto, la naringenina-calcone e la naringenina sono stati selezionati come controlli standard.

I risultati del test HPLC sono mostrati nelle Figure 4-A e B. Il tempo di ritenzione del prodotto della reazione enzimatica è simile a quello dello standard di naringenina. Entrambi hanno un assorbimento massimo a 289 nm nello spettro di assorbimento UV, che è diverso dal tempo di ritenzione della naringenina-calcone. Il tempo e gli spettri di assorbimento UV erano diversi, ma come controllo negativo, il prodotto dopo l'incubazione della proteina CtCHS inattivata ad alta temperatura con il substrato non conteneva naringenina, calcone e naringenina. Ulteriore rilevamento tramite spettrometria di massa, lo spettro di massa di primo livello (Figura 4-C, D) ha mostrato che il prodotto della reazione enzimatica ha [MH]-picco m/z271.060 97, mentre la naringenina ha [MH ]-picco m/z 271.060 91.

Confrontando gli spettri MS2 (Figura 5-E, F), il prodotto della reazione enzimatica CtCHS e la naringenina presentano entrambi picchi caratteristici dei frammenti a m/z 107, 151 e 177, il che è coerente con il rapporto della letteratura [19], indicando che CtCHS ha un complesso calcone. Attività enzimatica, può catalizzare la reazione di malonil-CoA e 4-cumaroil-CoA in naringenina-calcone.

3.5 Analisi della localizzazione subcellulare

Per studiare il ruolo della proteina CtCHS nelle cellule, il plasmide pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS è stato costruito e trasformato in protoplasti di Arabidopsis thaliana per osservarne la localizzazione subcellulare. I risultati sono mostrati nella Figura 5. Come controllo, la proteina pCAMBIA1300-35S-GFP era distribuita nel nucleo e nel citoplasma, mentre la proteina di fusione pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS era distribuita principalmente in il citoplasma, indicando che la proteina CtCHS può funzionare nel citoplasma delle cellule vegetali. Funzione.

3.6 Analisi del pattern di espressione di CtCHS

qRT-PCR è stato utilizzato per rilevare l'espressione relativa di CtCHS nei fiori di Cistanche deserticola con tre colori: bianco, viola e rosso. I risultati sono mostrati nella Figura 6. L'espressione di CtCHS nei fiori viola e rossi era significativamente più alta di quella nei fiori bianchi. quantità. Rispetto ai fiori bianchi, il livello di espressione di CtCHS nei fiori viola è 8,44 volte più alto e il livello di espressione di CtCHS nei fiori rossi è 3,21 volte più alto. Questi risultati indicano che i cambiamenti nei livelli di espressione di CtCHS possono essere correlati alla differenza nel colore dei fiori di Cistanche deserticola. Più alto è il livello di espressione, più scuro sarà il colore del fiore. , più basso è il livello di espressione, più chiaro sarà il colore del fiore.

****P＜0.000 1Fig. 6 Livello di espressione relativa di CtCHS in fiori con colori diversi

4. Discussione

CHS è unenzima chiave nella via biosintetica dei flavonoidied è legato a the regolazione del colore dei fioriin molte piante. Ad esempio, il colore del fiore diDianthus chinensisL.[20] e Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] sono tutti affetti da CHS. controllo.Cistanches tubulosaha principalmente tre colori di fiori: bianco, rosso e viola, ma il suo meccanismo di regolazione del colore dei fiori non è stato ancora segnalato. In questo studio, un gene CtCHS è stato clonato utilizzando RT-PCRanalisi dei dati del trascrittoma dei fiori di Cistanches tubulosa, e il suo

Analisi bioinformaticaè stato condotto e i risultati hanno mostrato che CtCHS ha un'elevata somiglianza e una stretta relazione genetica con la sequenza aminoacidica di ElCHS di Physalis nigra (AHJ80976.1). La CHS è una polichetide sintasi di tipo III (PKSIII) e gli studi hanno scoperto che la CHS ha una triade catalitica Cys-His-Asn conservata [23]. In questo studio, l'analisi dell'allineamento delle sequenze di amminoacidi ha mostrato che CtCHS ha conservato residui catalitici Cys164, His303 e Asn336, indicando che CtCHS può avere una tipica funzione calcone sintasi.

capace. L'analisi dell'attività enzimatica è stata eseguita utilizzando l'espressione procariotica della proteina CtCHS in Escherichia coli e rilevata mediante HPLC e MS. Si è scoperto che la proteina CtCHS può catalizzare 4-cumaroil-CoA e malonil-CoA per produrre naringenina-calcone.

Il CHS è coinvolto nella sintesi dei flavonoidi in molte piante, ma la sua posizione subcellulare è diversa nelle diverse specie. Ad esempio, Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. EaCHS[26] sono tutti localizzati nel citoplasma, mentre Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], la melanzana Solanum melongena L. SmCHS [28] si trova nel citoplasma e nel nucleo, mentre nell'uva Vitis vinifera L. VvCHS si trova nel citoplasma, nel nucleo e nella parete cellulare [29]. In questo studio, il plasmide pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS è stato utilizzato per trasformare i protoplasti di Arabidopsis thaliana ed è stato osservato che la proteina CtCHS era localizzata principalmente nel citoplasma e può catalizzare la produzione di naringenina-calcone nel citoplasma per favorire l'accumulo di flavonoidi.

La via dei fenilpropanoidi si dirama da 4-coumaroyl-CoA nella via di sintesi dei flavonoidi e nella via di biosintesi dei lignani. CHS catalizza 4-coumaroyl-CoA e malonil-CoA per generare naringenina e calcone per avviare i flavonoidi. La via biosintetica dei composti simili è il primo enzima chiave in questa via [30]. Pertanto, il CHS altamente espresso è utile affinché le piante accumuli livelli più elevati di flavonoidi e producano fiori più scuri. Ad esempio, il livello di espressione di CHS nelle varietà a fiore viola di Hosta plantaginea (Lam.) Aschers è superiore a quello delle varietà a fiore bianco. Hosta HpCHS viene trasformato in tabacco per ottenere Rispetto al tabacco selvatico, le piante con sovraespressione hanno petali più scuri e un contenuto totale di antociani più elevato [31].

In questo studio, il livello di espressione del gene CtCHS è correlato al colore dei fiori di Cistanches tubulosa. È altamente espresso nei fiori viola più scuri e nei fiori rossi, ed è scarso nei fiori bianchi di colore chiaro. La differenza di espressione di CtCHS potrebbe essere dovuta alla differenza nei fiori di Cistanches tubulosa. Uno dei motivi per avere abiti e colori diversi. In sintesi, questo studio ha clonato un gene CtCHS dai fiori di Cistanche deserticola e ha condotto su di esso un'analisi bioinformatica. La proteina ricombinante CtCHS è stata ottenuta mediante espressione esogena in Escherichia coli. L'analisi dell'attività enzimatica ha dimostrato che la proteina CtCHS può catalizzare il 4-coumaroil coenzima. A e il malonil-coenzima A generano naringenina-calcone. Si è scoperto che il gene CtCHS è altamente espresso nei fiori viola e rossi e basso nei fiori bianchi. Questi risultati indicano che il gene CtCHS può regolare la produzione di diversi colori dei fiori in Cistanche deserticola, il che è utile per ulteriori ricerche sul meccanismo di regolazione del colore dei fiori di Cistanche tubulosa e fornisce un riferimento per la ricerca successiva sul ruolo di CtCHS nella regolazione del colore dei fiori di Cistanche tubulosa. colore del fiore in Cistanche deserticola.