Coagulazione, recettori attivati ​​dalla proteasi e malattia renale diabetica: lezioni dai topi con deficit di ENOS

Ossido nitrico sintasi endoteliale(eNOS) è noto per aggravare la progressione e la prognosi dellamalattia renale diabetica(DKD). Uno dei meccanismi attraverso i quali ciò si ottiene è che bassi livelli di eNOS sono associati all’ipercoagulabilità, che promuove il danno renale. Nella cascata estrinseca della coagulazione, il fattore tissutale (fattore III) e i fattori della coagulazione a valle, come il fattore X attivo (FXa), esacerbano l’infiammazione attraverso l’attivazione dei recettori attivati ​​dalla proteasi (PAR). Recentemente, è stato dimostrato che la mancanza o la ridotta espressione di eNOS nei topi diabetici, come modello di DKD avanzata, aumenta i livelli del fattore tissutale renale e l'espressione di PAR1 e 2 nei loro reni. Inoltre, inibizione farmaceutica o delezione genetica di fattori della coagulazione o PARmiglioramento dell'infiammazionein DKD nei topi privi di eNOS. In questa recensione, riassumiamo la relazione tra eNOS, coagulazione e PAR e proponiamo una nuova opzione terapeutica per la gestione dei pazienti con DKD.

Parole chiave:glomerulosclerosi diabetica; fattore Xa;infiammazione; fattore tissutale

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introduzione

Il numero di pazienti conmalattia renale diabetica(DKD) è in aumento in tutto il mondo (de Boer et al. 2011; Kainz et al. 2015; Ogurtsova et al. 2017). La DKD è una delle principali cause di mortalità nei pazienti con complicanze diabetiche (Afkarian et al. 2013). Inoltre, la DKD è progressiva ed è la causa principale della malattia renale allo stadio terminale che richiede una terapia sostitutiva renale (Gregg et al. 2014; Liyanage et al. 2015). In Giappone, la nefropatia diabetica rappresenta oltre il 39% dei nuovi pazienti in dialisi (Nitta et al. 2020). Pertanto, lo sviluppo dinuovo terapeuticoopzioni sono necessarie per gestire i pazienti con DKD.

sistema nella patogenesi della DKD. L’ipercoagulabilità è associata alla DKD (Goldberg 2009; Domingueti et al. 2016). È stato dimostrato che un livello elevato di fibrinogeno nel sangue è associato a una bassa velocità di filtrazione glomerulare stimata, a un'elevata proteinuria e a un grave danno istologico ed è un fattore predittivo della progressione verso la malattia renale allo stadio terminale (Dalla Vestra et al. 2005; Pan et al.2018; Zhang et al.2018). Alcuni studi hanno mostrato una correlazione tra il livello di D-dimero, un prodotto di degradazione della fibrina, e la disfunzione renale nella DKD (Domingueti et al. 2018; Pan et al. 2018). L’ipercoagulabilità nella DKD è probabilmente determinata da molteplici fattori. Ad esempio, il sistema renina-angiotensina-aldosterone attiva il fattore tissutale (TF, fattore III) e aumenta gli eventi trombotici (Dielis et al. 2005). Altrimenti, iperglicemia, dislipidemia, infiammazione o disfunzione endoteliale sono coinvolte nello stato pro-trombotico nella patogenesi della DKD (Goldberg 2009).

Nella DKD è presente una disfunzione endoteliale che progredisce fino a complicanze microvascolari (Goldberg 2009; Nakagawa et al. 2011). L'alterata produzione endoteliale di ossido nitrico sintasi (eNOS) o la ridotta attività di eNOS (ad esempio, alterata fosforilazione di eNOS) è un segno distintivo della disfunzione endoteliale nella DKD (Nakagawa et al. 2011; Cheng et al. 2012). Abbiamo dimostrato che una perdita di espressione di eNOS era collegata all’aumento del livello di TF e dell’attività del sistema di coagulazione estrinseca (Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), che è strettamente associato a eventi trombotici in pazienti con insufficienza renale cronica malattie (Kolachalama et al. 2018).

Oltre all’elevato rischio di eventi trombotici, le proteasi della coagulazione, come il fattore attivo FVII (FVIIa), il fattore attivo (FXa) e la trombina, che sono presenti nella cascata estrinseca della coagulazione, mediano il danno tissutale attraverso un recettore attivato dalla proteasi ( PAR)-dipendente (Madhusudhan et al. 2016; Posma et al. 2019). In questa recensione, riassumiamo i risultati ottenuti da topi diabetici privi di eNOS e discutiamo la relazione tra la via della coagulazione-PAR, i livelli di eNOS ePatogenesi della DKD.

Via del fattore tissutale/recettori attivati ​​dalla proteasi

Il fattore tissutale (TF), noto come fattore III, è una proteina transmembrana da 47 kDa che interagisce con il fattore VII (FVII) (Grover e Mackman 2018). Il complesso TF/FVIIa è un attivatore della cascata estrinseca della coagulazione e catalizza l'attivazione di FX e FIX. FXa e il cofattore V attivato (FVa) formano un complesso protrombotico che genera trombina. Infine, la trombina converte il fibrinogeno in fibrina, determinando la formazione di trombi (Grover e Mackman 2018). Il TF è espresso sia nelle cellule muscolari lisce vascolari che nei fibroblasti avventiziali. In condizioni infiammatorie, la sua espressione è indotta nelle cellule endoteliali o nelle cellule circolanti come i monociti (Østerud e Bjørklid 2006).

I recettori attivati ​​dalla proteasi (PAR) sono membri della superfamiglia dei recettori accoppiati a proteine ​​G, che comprende quattro proteine ​​PAR (PAR1-4). I PAR subiscono la scissione da parte delle proteasi all'estremità N-terminale e vengono attivati ​​dopo il legame con un nuovo N-terminale contenente un ligando legato. I quattro membri dei PAR (PAR1-4) sono attivati ​​da specifiche proteasi della coagulazione: il complesso TF e FVIIa attiva PAR2, il fattore Xa attiva sia PAR1 che PAR2 e la trombina attiva PAR1, PAR3 e PAR4 (Camerer et al. 2000; Coughlin 2005; Rothmeier e Ruf 2012; Zhao et al. 2014). La relazione tra TF, proteasi della coagulazione e PAR è mostrata in Fig. 1.

È noto che i PAR sono ampiamente espressi nelle cellule renali e sono coinvolti nella fisiopatologia del danno renale. Sia PAR1 che PAR2 sono espressi nelle cellule endoteliali glomerulari, nelle cellule mesangiali e nelle cellule tubulari renali derivate da esseri umani o di topo; PAR2, PAR3 e PAR4 sono espressi nei podociti umani; PAR1, PAR3 e PAR4 sono espressi nei podociti murini (Tanaka et al. 2005; Vesey et al. 2005; Madhusudhan et al. 2012; Dong et al. 2015; Madhusudhan et al. 2016).

Sebbene gli effetti dannosi o protettivi dei PAR inlesione renalesono stati dimostrati, i dati accumulati suggeriscono che i PAR esacerbano l'infiammazione stimolando la produzione di citochine e chemochine (Rothmeier e Ruf 2012; Isermann 2017; Posma et al. 2019). Coerentemente con questa scoperta, gli agonisti PAR1 e PAR2 promuovono l'espressione di mediatori infiammatori, come la proteina chemiotattica monocitaria 1 (MCP1) e l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1), e molecole pro-fibrotiche nell'endotelio. , mesangiali e tubulari renali (Vesey et al. 2005; Vesey et al. 2013; Ellinghaus et al. 2016; Waasdorp et al. 2016; Oe et al. 2019). Negli studi in vivo, la mancanza di PAR1 o la presenza di inibitori di PAR1 ha ridotto l’infiammazione in modelli di glomerulonefrite a mezzaluna o danno renale ostruttivo (Cunningham et al. 2000; Waasdorp et al. 2019; Lok et al. 2020). Allo stesso modo, gli effetti terapeutici dell'inibizione di PAR2 nelle lesioni renali sono stati accompagnati daridotta infiammazionenei reni (Hayashi et al. 2016; Du et al. 2017; Han et al. 2019; Watanabe et al. 2019).

Polimorfismi endoteliali dell'ossido nitrico sintasi nella DKD

Ossido nitrico sintasi endoteliale(eNOS) è una delle tre isoforme di NOS e contribuisce alla produzione di NO nell'endotelio vascolare (Walford e Loscalzo 2003). L'NO prodotto da eNOS nell'endotelio vascolare svolge un ruolo cruciale nella regolazione del rilassamento vascolare, nell'antinfiammatorio e nella prevenzione della formazione di trombi (Walford e Loscalzo 2003). L'alterata espressione di eNOS è associata allo sviluppo di DKD. Meta-analisi condotte di recente sugli esseri umani hanno rivelato che G894T (rs1799983), C-786T (rs2070744) e l'introne 4b/4a ​​(rs869109213) nei geni eNOS (NOS3) sono strettamente associati al sviluppo della DKD (Dellamea et al. 2014; Zhang et al. 2015; Dong et al. 2018). Di queste varianti, il ruolo del polimorfismo G894T (Glu298Asp) nella funzione eNOS è stato ben caratterizzato. La ridotta produzione di NO o l'accumulo di nitriti è stata indicata nelle cellule CHO trasfettate con 298Asp rispetto a quelle con 298Glu (Noiri et al. 2002). Collettivamente, questi risultati indicano che la ridotta produzione di NO dovuta alla disfunzione di eNOS è importante per la progressione della DKD negli esseri umani.

Topi diabetici privi di eNOS come modello di nefropatia diabetica umana

La creazione di modelli preclinici affidabili simili alla DKD umana è essenziale per lo studio di nuove opzioni terapeutiche. Sulla base delle prove che mostrano un’associazione tra il polimorfismo di eNOS e la DKD, numerosi studi hanno dimostrato che i modelli knock-out di eNOS del DM di tipo I e di tipo II sono alcuni dei modelli di successo che imitano la DKD umana (Brosius et al. 2009; Azushima et al.2018). È stato dimostrato che topi diabetici indotti da streptozotocina e privi di eNOS sviluppano grave albuminuria, espansione mesangiale, ispessimento della membrana basale glomerulare e ialinosi arteriolare, simili alla DKD umana (Nakagawa et al. 2007). Allo stesso modo, topi diabetici di tipo II (db/db) privi di eNOS hanno mostrato grave glomerulosclerosi e albuminuria (Zhao et al. 2006).

TF elevato nei topi diabetici privi di eNOS

L'NO inibisce la formazione di trombi e l'aggregazione piastrinica (Walford e Loscalzo 2003). Poiché la formazione di trombi glomerulari è stata osservata in topi diabetici privi di eNOS (Nakagawa et al. 2007), l'alterata espressione di eNOS è probabilmente associata all'aumento della coagulazione TF-dipendente. L'associazione tra eNOS e TF nella DKD è stata affrontata nei nostri precedenti rapporti (Li et al. 2010; Wang et al. 2011a; Oe et al. 2016) (Fig. 2).

La ridotta o la mancanza di espressione di eNOS aumenta l'attività renale di TF nei topi Akita diabetici Abbiamo caratterizzato l'espressione di TF nei topi diabetici Akita (Ins2Akita/+), un modello di DM di tipo I, con vari livelli di espressione di eNOS (eNOS+/+, eNOS+/- , e eNOS-/-) (Wang et al. 2011a). Abbiamo scoperto che la gravità della DKD era associata a una ridotta espressione di eNOS. L'escrezione urinaria di albumina, la glomerulosclerosi e la riduzione della velocità di filtrazione glomerulare erano esacerbate nel seguente ordine: eNOS+/+; Ins2Akita/+ < eNOS+/-; Ins2Akita/+ < eNOS-/-; Ins2Akita/+. È interessante notare che l'espressione e l'attività del TF renale erano aumentate in eNOS+/-; Ins2Akita/+ e eNOS-/-; Topi Ins2Akita/+ rispetto a quelli in eNOS+/+; Topi Ins2Akita/+. Anche la deposizione di fibrina glomerulare è stata notevole in eNOS+/-; Ins2 Akita/+ e eNOS-/-; Ins2 Akita/+ topi. Inoltre, l'espressione dell'mRNA di Tf renale era correlata alla gravità della malattia, all'escrezione urinaria di albumina einfiammatorio renaleespressione delle citochine.

Una dieta ricca di grassi e la mancanza di eNOS aumentano sinergicamente il TF nei topi diabetici

Molti studi hanno dimostrato una connessione tra obesità e trombosi (Samad e Ruf 2013). Ad esempio, la sovraregolazione della via TLR4-NF-kB in condizioni di malattia metabolica aumenta i livelli di TF (Lv et al. 2009; Owens et al. 2012; Rogero e Calder 2018). Inoltre, il palmitato di acidi grassi saturi induce il rilascio dell'istone H3 tramite meccanismi dipendenti dal percorso ROS e JNK e istoni extracellulari, che aumentano l'espressione di TF nei monociti (Shrestha et al. 2013). Concentrandosi sulla relazione tra coagulazione, eNOS e dislipidemia, il nostro studio precedente ha dimostrato gli effetti combinati del deficit di eNOS e di una dieta ricca di grassi sull’espressione di TF (Li et al. 2010). Nello studio, topi eNOS-null sono stati trattati con STZ a basso dosaggio per sviluppare DM e sono stati alimentati con una dieta ricca di grassi. La mancanza di espressione di eNOS ha aumentato l’escrezione urinaria di albumina e le lesioni istologiche, che sono state ulteriormente esacerbate da una dieta ricca di grassi. L'espressione e l'attività del TF erano aumentate nei reni dei topi a causa della mancanza di espressione di eNOS e di una dieta ricca di grassi in modo sinergico. È interessante notare che un aumento del livello di TF immunoreattivo è stato dimostrato da esperimenti di colocalizzazione con un marcatore monocito/macrofago glomerulare.

Gli anticorpi neutralizzanti contro il TF migliorano l'infiammazione nei reni diabetici nei topi eNOS-Knockout

Un aumento della coagulazione TF-dipendente è associato ad un aumento dell’infiammazione (Witkowski et al. 2016). Miglioramento dell’inibizione del sistema di coagulazione TF-dipendentemalattie infiammatorie, come la sepsi indotta da LPS (Pawlinski et al. 2010). Per chiarire il nesso causale tra infiammazione e TF nella DKD, abbiamo esaminato l’effetto a breve termine degli anticorpi neutralizzanti contro il TF sull’infiammazione dei reni diabetici in topi con deficit di eNOS (Li et al. 2010). I risultati hanno mostrato che la somministrazione di anticorpi anti-TF ha ridotto marcatamente i livelli di espressione renale di geni correlati all’infiammazione e alla fibrosi come Tnfa, Ccl2, Tgfb e mRNA Col4 nei reni di topo quattro giorni dopo la neutralizzazione del TF.

L’inibitore della coagulazione FXa migliora le lesioni renali nei topi diabetici privi di eNOS

Anche la coagulazione FXa, situata a valle di TF/VIIa, contribuisce all'infiammazione attraverso la via PAR-dipendente. Il suo ruolo nella DKD è stato dimostrato in diversi modelli animali. Sumi et al. (2011) hanno dimostrato che fondaparinux, un inibitore di FXa, riduce i livelli di proteine ​​urinarie, l’ipertrofia glomerulare e la deposizione di fibrina nei topi db/db. L’effetto terapeutico dell’inibizione di FXa nei topi DKD privi di eNOS è stato dimostrato dal nostro gruppo (Oe et al. 2016). Edoxaban (50 mg/kg/giorno), un inibitore orale del FXa, è stato somministrato a eNOS-/-; Topi Ins2Akita/+ per tre mesi e i risultati hanno mostrato un miglioramento dei danni istologici, come la proliferazione della matrice mesangiale. I livelli di espressione dei geni infiammatori nei reni sono stati ridotti da edoxaban (Tabella 1). FXa attiva sia PAR1 che PAR2. Per chiarire il meccanismo del danno renale mediato da FXa, abbiamo dimostrato che gli effetti antinfiammatori degli inibitori di FXa sono simili a quelli riscontrati nei topi PAR2-/- e nei topi PAR2-/- con inibitori di FXa . Questi risultati hanno suggerito che FXa probabilmente causava l'infiammazione attraverso un meccanismo PAR2-dipendente nella DKD. Al contrario, edoxaban non ha migliorato il danno glomerulare in eNOS+/+; Topi Ins2Akita/+, suggerendo che l'effetto terapeutico dell'inibizione di FXa era associato all'ipercoagulabilità dipendente da eNOS nei topi diabetici di tipo I.

Altri fattori di coagulazione nella DKD

Poiché la trombina prende di mira PAR1, che fa progredire l’infiammazione vascolare (Chen e Dorling 2009), è probabile che la trombina esacerba la DKD. Tuttavia, è stato dimostrato il ruolo protettivo o dannoso della trombina nella patogenesi della DKD; la trombina a basse dosi (50 pM) ha prevenuto, mentre la trombina ad alte dosi (20 nM) ha aggravato l'apoptosi indotta dal glucosio nei podociti (Wang et al. 2011b). Gli effetti degli inibitori della trombina come il dabigatran sui topi diabetici privi di eNOS dovrebbero essere chiariti in futuro.

Il fibrinogeno è coinvolto in diversi stati infiammatori. È interessante notare che la riduzione parziale o l’assenza di fibrinogeno è risultata vantaggiosa nei modelli di ischemia-riperfusione renale o di fibrosi renale ostruttiva (Sörensen et al. 2011; Craciun et al. 2014). Poiché la deposizione di fibrina glomerulare è aumentata nei topi diabetici privi di eNOS (Nakagawa et al. 2007; Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), chiarire il suo ruolo nella patogenesi della DKD merita ulteriori ricerche.

Espressione di PAR1 e PAR2 nei topi diabetici privi di eNOS

Una maggiore espressione di PAR è associata a danno renale. Noi e altri abbiamo dimostrato che i livelli di espressione dell’mRNA di Par1 e/o Par2 erano aumentati in modelli animali con nefropatia diabetica, danno renale indotto da ade nove, fibrosi renale ostruttiva e danno renale indotto da cisplatino (Chung et al. 2013; Hayashi et al.2016; Oe et al.2016; Watanabe et al.2019). Inoltre, i livelli della proteina PAR2 glomerulare erano aumentati nei topi db/db, un modello di DM di tipo II (Sumi et al. 2011). Abbiamo dimostrato l'associazione tra espressione di PAR e deficit di eNOS nei topi diabetici (Oe et al. 2016). Il livello di espressione dell'mRNA di Par1 era significativamente più alto in eNOS−/−; Topi Ins2Akita/+ che in eNOS−/−; Topi Ins2Akita/+ e non DM. Allo stesso modo, l'espressione di Par2 era significativamente più alta in eNOS−/−; Topi Ins2Akita/+ rispetto ai topi non DM. Al contrario, i livelli di mRNA di Par4 non differivano tra i genotipi. La mancanza di eNOS esacerba l’infiammazione nella DKD (Wang et al. 2011a). Poiché, secondo quanto riferito, le citochine proinfiammatorie aumentano i PARs (Nystedt et al. 1996), un'elevata infiammazione causata dalla mancanza di eNOS probabilmente induce l'espressione renale di Pars nella DKD. Collettivamente, i risultati dei nostri studi hanno suggerito che i livelli di espressione di PAR1 e PAR2, simili al caso del TF, erano aumentati nei reni diabetici quando mancava eNOS (Fig. 2).

La delezione di PAR2 ha migliorato la lesione renale diabetica nei topi con eNOS ridotto

Noi e altri abbiamo affrontato il ruolo di PAR2 nella DKD in studi precedenti. La delezione di Par2 non ha influenzato il danno glomerulare nei topi Akita diabetici wild-type (Ins2Akita/+) con eNOS (Oe et al. 2016). Inoltre, i topi diabetici indotti da STZ privi di PAR2 hanno mostrato un’albuminuria ridotta rispetto ai topi diabetici wild-type, ma una maggiore espansione mesangiale (Waasdorp et al. 2017). Collettivamente, questi risultati dimostrano che non ci sono o sono lievi effetti terapeutici dell'inibizione di PAR2 sul danno renale nei modelli precoci e lievi di DKD. Al contrario, abbiamo dimostrato gli effetti del deficit di PAR2 sulla DKD nei topi Akita diabetici con ridotta espressione di eNOS (eNOS+/-; Ins2Akita/+) (Oe et al. 2016). La mancanza di PAR2 ha ridotto significativamente i livelli di escrezione urinaria di albumina, l’espansione mesangiale e lo spessore del GBM. Anche i livelli di espressione dei geni proinfiammatori e correlati alla fibrosi, tra cui Tnfa, Tgfb e Col4, erano ridotti nei reni dei topi. Questi risultati suggeriscono che PAR2 è patogeno non nella lesione glomerulare diabetica precoce, ma relativamente avanzata causata dal deficit di eNOS (Tabella 1).

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