L'attività del complemento è regolata nella glomerulopatia C3 dalle proteine ​​di fusione del fattore H IgG con e senza domini di targeting della properdina

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Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² e Matthew C. Pickering

'Centro per le malattie infiammatorie, Imperial College London, Regno Unito; e²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, USA

C3 glomerulopatiaè caratterizzato dall'accumulo di complemento C3 all'interno dei glomeruli. Le cause includono, ma non sono limitate a, anomalie nel fattore H, il principale regolatore negativo della via alternativa del complemento. I topi carenti di fattore H (Cfh-/-) sviluppano C3glomerulopatiainsieme a una riduzione dei livelli plasmatici di C3. Utilizzando questo modello, abbiamo valutato l'efficacia di due proteine ​​di fusione contenenti i domini regolatori del percorso alternativo del fattore H (FH1-5)

legato a un'immunoglobulina murina non bersaglio (IgG-FH1-5) o a un anticorpo della proprietà anti-topo (Anti-P-FH1-5). Entrambe le proteine ​​hanno aumentato la C3 plasmatica e ridotto la deposizione di C3 glomerulare in misura equivalente, suggerendo che il targeting della propria dina non era necessario affinché FH1-5 alterasse l'attivazione di C3 nel plasma o nei glomeruli. Dopo la somministrazione di IgG-FH1-5, i livelli plasmatici di C3 sono correlati temporalmente con le variazioni dei livelli di fattore B, mentre i livelli plasmatici di C5 sono correlati con le variazioni dei livelli plasmatici di propriedina. In particolare, l'aumento del plasma

I livelli di C5 e di appropriatedina sono persistiti più a lungo degli aumenti di C3 e fattore B. Nei topi Cfh-/- IgG-FH1-5 ha ridotto il danno renale durante la nefrite sierica nefrotossica accelerata. Pertanto, i nostri dati dimostrano che l'IgG-FH1-5 ha ripristinato l'attività della via alternativa circolante e ridotto la deposizione di C3 glomerulare nei topi Cfh-/- e che i livelli plasmatici di propriedina sono un marker sensibile dell'attività della C5 convertasi nella carenza di fattore H. La proteina FH{12}} coniugata con immunoglobuline, grazie alla sua emivita plasmatica relativamente lunga, può essere una potenziale terapia per C3glomerulopatia.

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Dichiarazione traslazionale

C3 glomerulopatia(C3G) è una malattia renale caratterizzata da un anomalo accumulo di complemento C3 all'interno dei glomeruli e da danno glomerulare. È dovuto all'attivazione incontrollata della via alternativa del complemento. Le proteine ​​di fusione, costituite da domini funzionali del regolatore del percorso alternativo, il fattore H (FH), legate a un anticorpo, hanno ripristinato la regolazione del complemento e ridotto il C3 glomerulare in un modello murino C3G. La coniugazione anticorpale non mirata ha determinato un'emivita plasmatica della proteina di fusione relativamente lunga e questo, o metodi di coniugazione simili, potrebbero essere utilizzati per aumentare la funzione FH nella terapia del C3G.

C3 glomerulopatia(C3G) è una malattia renale mediata dal complemento caratterizzata da quantità anormali di C3 all'interno dei glomeruli.1 Può evolvere in insufficienza renale e non ha un trattamento definitivo.2 Il C3G è associato all'attivazione anormale della via alternativa del complemento (AP). L'attivazione di AP determina la produzione di C3bBb (C3 convertasi), un enzima che scinde C3. Dopo l'aggiunta di un'altra molecola C3b, il complesso C3bBbC3b risultante (C5 convertasi) può scindere il complemento C5. Incontrollato

L'attivazione di AP in C3G può essere associata a una riduzione del C3, C5, del fattore B (FB) e del proprio circolante. Le cause dell'attivazione incontrollata di AP includono la perdita di cambiamenti funzionali nei regolatori del complemento e il guadagno di cambiamenti funzionali negli attivatori del complemento.2 Il principale regolatore AP negativo è il fattore H (FH), e la carenza di FH nell'uomo, nei maiali e nei topi è associata a C3G. 3 Il fattore nefritico C3, un anticorpo che stabilizza la convertasi AP C3 è frequente in C3G.4 Il fattore nefritico C3 può comportare una riduzione del solo C3 (fattore nefritico C3 indipendente dalla fattore nefritico C3 dipendente).5,6

Sebbene la carenza di propriedina non abbia migliorato i livelli plasmatici di C3, i livelli di C5 sono aumentati, suggerendo che la correttana era necessaria per l'attività della C5 ma non della C3 convertasi.8,9

La somministrazione di topi di topo10 o FH11,12 umano a topi Cfh–/– ha ridotto la colorazione glomerulare di C3 e aumentato i livelli di C3 circolante. Anche i costrutti che contengono solo i domini regolatori e target di FH (molecole mini-FH) sono efficaci in questo modello.13 Altri approcci includono proteine ​​che prendono di mira i siti di attivazione del complemento. Questi includono TT30,14 una proteina contenente i domini regolatori del complemento di FH (FH1-5) legati ai domini di legame del complemento del recettore 2 del complemento e molecole di FH omodimeriche,15 molecole mini-FH che contengono domini di legame del complemento della proteina correlata al fattore H 1.

Poiché l'utilità terapeutica dell'inibizione dell'attivazione del complemento C3 è allo studio in C3G,2 è importante comprendere la cinetica della deposizione glomerulare di C3 e la sua relazione con l'attivazione di AP all'interno sia dei glomeruli che della circolazione. In modelli di glomerulonefrite mediata da immunocomplessi, la C3c glomerulare si è schiarita entro 24 ore dalla prevenzione dell'attivazione del complemento, mentre la C3d glomerulare è persistita per settimane.16 Allo stesso modo, nei topi Cfh–/–, l'FH esogeno si traduce in una riduzione della colorazione della C3c glomerulare a 24 ore , mentre il glomerulare C3d rimane invariato.11

In questo studio, abbiamo studiato l'efficacia di 2 nuove proteine ​​di fusione con attività di regolazione del complemento nel modello murino Cfh–/– di C3G. Le proteine ​​contenevano i domini regolatori dell'FH di topo (FH1-5), che è stato coniugato con Ig di topo per prolungare l'emivita biologica. Una delle proteine ​​di fusione, denominata IgG-FH1-5, è stata coniugata a un anticorpo monoclonale murino non mirato. L'altro, denominato anti-P-FH1-5, è stato coniugato a un anticorpo monoclonale contro la proprietà di topo. Ciò è stato fatto per verificare l'ipotesi che il targeting di questa proteina di fusione verso i siti di attivazione del complemento, interagendo con la deposizione della propriadina, aumenterebbe la regolazione del complemento tissutale. I nostri dati dimostrano che sia le proteine ​​​​non-targeting (IgG-FH1-5) che le proteine ​​​​propordin-targeting (anti-P-FH1-5) hanno ripristinato la regolazione plasmatica e glomerulare C3 nei topi Cfh–/–. Studi Timecourse hanno mostrato che il ripristino dei livelli di C3 e FB rispecchiava i livelli delle proteine ​​di fusione nella circolazione. Al contrario, gli aumenti di C5 plasmatico persistevano dopo che le proteine ​​di fusione erano state eliminate dalla circolazione. Mostriamo che IgG-FH1-5 ha migliorato la lesione glomerulare durante la nefrite nefrotossica sierica accelerata nei topi Cfh–/–.

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RISULTATI

Generazione di proteine ​​di fusione e valutazione in vitro e in vivo dell'attività Le proteine ​​di fusione sono state create collegando i primi 5 domini SCR (short consensus repeat) di topo FH (FH1-5) a un anticorpo della proprietà anti-topo (anti -P-FH1-5) o un anticorpo con un dominio Ig non mirato (IgG-FH1- 5, Figura supplementare S1). L'attività delle proteine ​​è stata valutata utilizzando un test emolitico specifico per AP (Figura 1a). Anti-P-FH1-5 e IgG-FH1-5 hanno inibito l'emolisi in modo dose-dipendente con una maggiore potenza per l'anti-P-FH1-5. Anche l'anti-properdina (anti-P) ha ridotto l'emolisi in modo dose-dipendente, ma il controllo IgG- non ha avuto alcun effetto. Dopo iniezioni equimolari delle proteine ​​nei topi Cfh–/–, la proteina IgG-FH1-5 era rilevabile fino a 11 giorni dopo l'iniezione, mentre l'anti-P-FH1-5 era rilevabile fino a 4 giorni dopo iniezione (Figura supplementare S2). Per determinare se IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5 potessero ripristinare la regolazione plasmatica dell'AP nei topi Cfh–/–, abbiamo prima misurato i livelli plasmatici di C3 dopo l'iniezione delle proteine ​​di fusione (Figura 1b) . La somministrazione di IgG-FH1-5 o anti-P-FH1-5 ha aumentato significativamente la C3 plasmatica a 24 ore e, in misura minore, a 96 ore dopo l'iniezione (Figura 1b). Questi dati hanno dimostrato che sia IgG-FH1-5 che anti-P-FH{53}} potrebbero ripristinare temporaneamente la regolazione plasmatica dell'AP nei topi Cfh–/–. Successivamente abbiamo eseguito un'analisi dettagliata di questi cambiamenti caratterizzando l'andamento temporale dei cambiamenti non solo nel plasma C3 ma anche nel plasma C5 e nelle proteine ​​​​del percorso alternativo FB e rightin. Dopo somministrazione di IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5 nei topi Cfh–/–, gli aumenti dei livelli di C5 e di propriedina circolanti persistono più a lungo degli aumenti di C3 e FB

Abbiamo confrontato la cinetica dei cambiamenti in C3, C5, FB e appropriatedina misurando le proteine ​​a intervalli fino a 27 giorni dopo una singola iniezione di IgG-FH1-5 o anti-P-FH{7}} ( Figura 2). Dopo la somministrazione di IgG-FH1-5, il picco di aumento di C3, C5, FB e proprio si è verificato il giorno 1 dopo l'iniezione. Il tempo in cui queste modifiche scendevano ai livelli di pre-trattamento era diverso. Il ritorno ai livelli di pretrattamento si è verificato tra i giorni 1 e 4 per FB, tra i giorni 7 e 11 per C3 e tra i giorni 14 e 21 sia per la correttadina che per C5 (Figura 2a, c, e e g). Dopo la somministrazione di anti-P-FH1-5, i livelli di C3 di picco si sono verificati il ​​giorno 1 ma sono scesi ai livelli di pretrattamento tra i giorni 4 e 7 (Figura 2b). I livelli di picco C5 si sono verificati il ​​giorno 4 e sono tornati ai livelli di pretrattamento tra i giorni 7 e 11 (Figura 2d). Il picco di aumento di FB si è verificato il giorno 1 ed è sceso ai livelli di pretrattamento tra i giorni 1 e 4 (Figura 2f). Come previsto, la appropriatedina plasmatica libera è stata esaurita dopo l'iniezione di anti-P-FH1-5 o anti-P (Figura 2h). I livelli di propriedina plasmatica libera sono rimasti bassi fino a 7 giorni dopo l'anti-P-FH1-5 e fino a 14 giorni dopo l'anti-P (Figura 2h). Sebbene entrambe le proteine ​​di fusione abbiano temporaneamente ripristinato la regolazione plasmatica dell'AP, la durata del miglioramento dei livelli di C3, FB e C5 ha riflesso la durata del loro rilevamento nel plasma, che era più breve per l'anti-P-FH1-5 (Figura supplementare S2) . In sintesi, i cambiamenti nei livelli di C3 e FB dopo l'iniezione di una delle due proteine ​​erano più brevi di quelli di C5 e della rightin. Questi dati suggeriscono che l'FB plasmatico è un marcatore sensibile dell'attività della convertasi C3 in questo contesto, mentre la propriadina è un marcatore dell'attività della convertasi C5. In particolare, dopo l'iniezione di anti-P, si è verificato un aumento di C5 a 24 e 96 ore e al giorno 7

Figura 1| (a) Complemento al saggio di emolisi dipendente dal percorso alternativo. Gli anticorpi sono stati titolati in 2-fold diluizioni da 60 nM a 0,5 nM. I reagenti IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 e anti-P hanno ridotto l'emolisi degli eritrociti di coniglio in modo dose-dipendente. Nessuna inibizione è stata utilizzata la proteina di controllo IgG. Le barre orizzontali indicano i valori medi e le barre di errore rappresentano SD. ( b ) Complemento plasmatico C3 nei topi Cfh–/– dopo l'iniezione di proteine ​​di fusione. La C3 plasmatica è stata misurata prima e 24 ore e 96 ore dopo la somministrazione di IgG-FH1-5 (triangoli rossi, n ¼ 5) Anti–P–FH1-5 (triangoli viola, n ¼ 6), Anti -P (punti verdi, n ¼ 5) e controllo IgG (punti blu, n ¼ 5). Le barre orizzontali indicano i valori medi e i baffi indicano SD. ***P # 0,001 rispetto al valore di pretrattamento e derivato da 2-way ANOVA con test di confronto multiplo Bonferroni. FH, fattore H; P, proprion.

(Figura 2d). Come riportato, 8,9 indica che la convertasi C5 dipende dalla propriadina nei topi Cfh–/–.

IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5 hanno ridotto il C3c glomerulare ma non hanno alterato la colorazione C3d nei topi Cfh–/–

Successivamente abbiamo valutato l'influenza di IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5 sulle proteine ​​glomerulari C3b/iC3b/C3c, C3d, rightdin e FH-correlate (FHR). A 96 ore dopo l'iniezione di IgG-FH1-5, la colorazione glomerulare C3b/iC3b/C3c era ridotta ma la colorazione glomerulare C3d (Figura 3a) e FHR (Figura 3b) non lo era. Glomerular C3b/iC3b/C3c è rimasto invariato sia con il controllo IgG che con l'anti-P. Il pattern lineare anormale della colorazione della proprietà glomerulare nei topi Cfh–/– non trattati9 è rimasto 96 ore dopo il controllo delle IgG. Nei topi Cfh–/– iniettati con anti-P o IgG-FH1-5, il livello di proprietà glomerulare era quasi non rilevabile a 96 ore (Figura 3b). Inaspettatamente, l'iniezione di anti-P-FH1-5 ha prodotto un pattern di colorazione glomerulare granulare utilizzando anticorpi anti-properdina, anti-FH/FHR e anti-IgG (Figura 3b). Questa scoperta suggeriva che la proteina anti-P-FH1-5 fosse depositata nei glomeruli. L'iniezione della proteina anti-P-FH1-5 nei topi wild-type ha determinato la colorazione glomerulare con anticorpi anti-properdina, anti-FH/FHR e anti-IgG a 96 ore (Figura supplementare S3), indicando che questo il reagente interagisce con i glomeruli normali. Tuttavia, abbiamo ipotizzato che la proteina anti-P-FH{52}} potrebbe anche interagire con la proprietà glomerulare preesistente nei topi Cfh–/–. Quando abbiamo iniettato il reagente in topi Cfh–/– che erano stati pretrattati con anti-P per rimuovere la proprietà glomerulare, si è verificata una riduzione dei pattern di colorazione granulare utilizzando anticorpi anti-properdina, anti-FH/FHR e anti-IgG ( Figura supplementare S4). Queste osservazioni indicano che l'interazione glomerulare della proteina anti-P-FH1-5 nei topi Cfh–/– dipende in parte dalla proprietà glomerulare.

IgG-FH1-5 ha migliorato il danno renale durante la nefrite sierica nefrotossica accelerata nei topi Cfh–/–

Nei pazienti con C3G, il danno renale acuto può svilupparsi nel contesto di infezioni intercorrenti. Ad esempio, la perdita della funzione renale nella nefropatia FHR5 è associata ad episodi di ematuria macroscopica sinfaringea.17 La disregolazione C3 sottostante nei pazienti con C3G si traduce probabilmente in un aumento del danno renale mediato dal complemento dopo un trigger che provoca un'infiammazione renale. Per modellare questo, abbiamo indotto una nefrite sierica nefrotossica accelerata, un immunocomplesso

Figura 2| Andamento del tempo del profilo del complemento plasmatico nei topi Cfh–/– iniettati con IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5. Plasma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) e rightdin (P; g,h) dall'inizio della sperimentazione fino a 27 giorni dopo una singola iniezione di IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; triangoli rossi, n ¼ 5) o anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; triangoli viola, n ¼ 6). I controlli includevano anti-P (punti verdi, n=5) e un anticorpo monoclonale corrispondente all'isotipo (controllo IgG; punti blu, n=5). Le barre orizzontali indicano i valori medi e i baffi indicano SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 rispetto al valore del pretrattamento e derivato dall'{27}}analisi della varianza della via con il test di confronto multiplo Bonferroni. FB, fattore B; FH, fattore H.

modello di glomerulonefrite che coinvolge il complemento e le vie mediate dal recettore Fc,18,19 nei topi Cfh–/–. In precedenza abbiamo dimostrato che i topi Cfh–/– sono ipersensibili al danno renale in questo contesto7 e abbiamo ipotizzato che la proteina FH1-5, migliorando la regolazione AP, potrebbe migliorare il danno renale mediato dal complemento in questo modello. Poiché i nostri dati hanno indicato che la proteina anti-P-FH1-5 si è depositata nei glomeruli normali, abbiamo utilizzato IgG-FH1-5 durante la nefrite sierica nefrotossica accelerata. Ventiquattro ore prima dell'iniezione del siero nefrotossico di pecora, i topi hanno ricevuto un'iniezione ip di controllo IgG (n=7) o IgG-FH1-5 (n=8). Il protocollo sperimentale è illustrato nella Figura 4a. I topi sono stati abbattuti 6 giorni dopo la somministrazione di siero nefrotossico di pecora. Tutte e 3 le misure istologiche della patologia glomerulare (punteggio di gravità, numero totale di cellule e numero di macrofagi) erano significativamente inferiori nel gruppo IgG-FH1-5 (Figura 4b). Anche la lesione tubulointerstiziale era inferiore nel gruppo IgG-FH1-5 (Figura 4b). L'urea sierica era significativamente elevata

Figura 3| Immunocolorazione del complemento glomerulare nei topi Cfh–/– 96 ore dopo l'iniezione di IgG-FH1-5 o anti-P-FH1-5. (a) Immagini rappresentative insieme alla quantificazione di C3b/iC3b/C3c e C3d glomerulari nei 4 gruppi sperimentali: IgG-FH1-5 (triangoli rossi, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (triangoli viola, n ¼ 6), anti-P (punti verdi, n ¼ 5) e controllo IgG (punti blu, n ¼ 5). (b) I punti dati rappresentano i valori mediani e i baffi denotano un intervallo interquartile. Valori P derivati ​​dal test di Kruskal-Wallis con test di confronto multiplo Dunn. (b)immagini rappresentative di IgG glomerulari, FHR e, colorazioni nei 4 gruppi sperimentali. Bar ¼ 100 mm. AFU, unità fluorescenti arbitrarie; FH, fattore H; P, proprion. Per ottimizzare la visualizzazione di questa immagine, consultare la versione online di questo articolo all'indirizzowww.kidney-international.org.

il gruppo di controllo IgG, ma i cambiamenti nell'albumina sierica e il rapporto albumina-creatinina nelle urine non differivano (Figura 4b). Come previsto, C3b/iC3b/C3c glomerulare era significativamente ridotto nel gruppo IgG-FH1-5 (Figura 4b), ma IgG di topo glomerulare (Figura 4b) e IgG di pecora (dati non mostrati) non differivano tra i gruppi .

Figura 4| Il pretrattamento con IgG-FH1-5 ha migliorato il danno renale durante la nefrite sierica nefrotossica accelerata nei topi Cfh–/–. (a) Schema del protocollo di nefrite nefrotossica sierica accelerata. I topi preimmunizzati con IgG di pecora hanno ricevuto IgG-FH1-5 (gruppo di trattamento, n=8) o IgG-controllo (gruppo di controllo, n=7) 24 ore prima della somministrazione del siero nefrotossico di pecora. (b) Funzione renale e istologia 6 giorni dopo l'induzione della nefrite sierica accelerata nefrotossica nei topi trattati con IgG-FH1-5 (trattamento; triangoli rossi, n ¼ 8) o controllo IgG (controllo; cerchi blu, n ¼ 7). Le barre orizzontali denotano i valori mediani e i baffi denotano un intervallo interquartile. *P # 0.05, **P # 0.01, ***P # 0,001 rispetto al controllo e derivato dal test di Mann-Whitney. FH, fattore H; P, proprion.

DISCUSSIONE

Sia IgG-FH1-5 che anti-P-FH1-5 hanno normalizzato i livelli di C3, FB e C5 nei topi Cfh–/–. Questa scoperta è coerente con il fatto che i domini regolatori del complemento dell'FH murino si trovano all'interno dei domini SCR da 1 a 5 (un sito di legame di C3b e l'attività del cofattore per la scissione mediata dal fattore I di C3b).20 Domini di riconoscimento della superficie, che l'influenza che si lega all'eparina e alle cellule endoteliali e include un secondo sito di legame C3b, sono presenti all'interno dei domini SCR 18 attraverso

20 (FH18-20) e quindi non sono presenti nelle proteine ​​di fusione.20 Tuttavia, entrambe le proteine ​​hanno ridotto iC3b/C3b/C3c glomerulare, indicando che FH18-20 non era richiesto in questa impostazione. Questa scoperta è coerente con i dati precedenti che mostrano che i topi Cfh–/– che esprimono una proteina FH mutante costituita dai domini SCR da 1 a 15 (Cfh–/– .FHD16-20) non hanno sviluppato una deposizione anormale di C3 glomerulare.21,22 Tuttavia, gli animali Cfh–/–.FH D16-20 non sono stati in grado di regolare l'attivazione di C3 lungo l'endotelio renale e hanno sviluppato microangiopatia trombotica. È possibile che, a causa della mancanza dei domini FH18-20 mirati alla superficie, la somministrazione di proteine ​​di fusione contenenti FH1-5 in carenza di FH possa causare suscettibilità alla microangiopatia trombotica. È anche possibile che l'aumentata avidità per il legame C3b, sotto la struttura dimerica delle proteine ​​di fusione, sia sufficiente per compensare l'assenza dei domini FH18-20 diretti alla superficie. Tuttavia, il riconoscimento della superficie di C3b è influenzato anche dai cambiamenti conformazionali in FH.23 Una proteina legante l'FH dello Streptococcus pneumoniae (PspCN, che lega il dominio SCR 9), innesca un cambiamento conformazionale di FH e il complesso FH-PspCN ha aumentato il legame di C3b e maggiore attività di accelerazione del decadimento. Il sito di legame FH20 C3d non è esposto in FH ma diventa esposto nel complesso FH-PspCN. Questo potrebbe spiegare perché FH19-20 interagisce con la superficie C3d ma FH no.24,25 Ipotizziamo che i nostri agenti, attraverso cambiamenti conformazionali, possano interagire in modo efficiente sia con la fase fluida che con la superficie C3b. In particolare, sia IgG-FH1-5 che anti-P-FH1-5 hanno protetto gli eritrociti dalla lisi in un test di emolisi AP-dipendente.

Nessuna delle due proteine ​​di fusione ha ridotto la colorazione del C3d glomerulare, forse a causa della natura persistente del C3d glomerulare. Nella nefrite immunocomplessa sperimentale, la C3c glomerulare si è risolta entro 24 ore dalla cessazione dell'attivazione del complemento ma la C3d è persistita per settimane.16 Inoltre, la C3d glomerulare è persistente nella nefrite lupica.26 Ciò probabilmente riflette la sua interazione covalente con le superfici glomerulari. Iniezioni ripetute di FH umano in topi Cfh–/– hanno mostrato una riduzione della C3d glomerulare in 10 giorni.11 È probabile che la somministrazione ripetuta di IgG-FH1-5 possa ridurre la C3d glomerulare in questo modello. Non vi è stato alcun cambiamento nella colorazione FHR glomerulare. Poco si sa sulle funzioni delle proteine ​​​​FHR murine, ma possono interagire sia con C3b27,28 che con C3d.27 In effetti, l'apparente affinità di FHR-A e FHR-B per C3d è più forte di quella di FH.27 Ipotizziamo che le proteine ​​​​FHR glomerulari possano essere eliminate dai glomeruli solo quando C3d è stato rimosso. In questo contesto, è da notare che nel C3G umano, la proteina 5 correlata al fattore H si associa al C3d glomerulare.29

La proteina anti-P-FH1-5 ha esaurito i livelli plasmatici di propriedina libera come previsto perché la parte anti-properdina di questa proteina di fusione può bloccare l'attività AP (a causa dell'esaurimento della propriadina) per 8 giorni dopo una singola iniezione.30 Tuttavia, i nostri dati hanno mostrato che l'efficacia dell'FH1-5 nell'aumentare i livelli plasmatici di C3 e nel ridurre la colorazione glomerulare di C3b/iC3b/C3c era comparabile tra le 2 proteine ​​di fusione (cioè, era indipendente dal targeting della propriadina). Inoltre, l'anormale colorazione della rightdina glomerulare è stata significativamente ridotta dopo la somministrazione di anti-P o IgG-FH1-5. Evidentemente, contrariamente alle proteine ​​C3d e FHR, la proprietà glomerulare viene prontamente eliminata dopo il ripristino della regolazione C3. La proprietà glomerulare è cambiata nel pattern dopo la somministrazione della proteina anti-P-FH1-5, ma ciò è stato complicato dall'osservazione che abbiamo rilevato la deposizione di questa proteina di fusione sia nei glomeruli Cfh–/– che nei glomeruli wild-type. Ciò era in parte dovuto a un'interazione con la proprietà glomerulare, ma la deposizione nei glomeruli di tipo selvatico indicava che era anche in parte completamente indipendente dal complemento glomerulare e probabilmente correlato alle proprietà fisico-chimiche della proteina di fusione.

I nostri dati cinetici hanno dimostrato nuove scoperte riguardanti i cambiamenti temporali di FB, C5 e appropriatedina che accompagnano gli aumenti di C3 nei topi Cfh–/– dopo l'iniezione delle proteine ​​di fusione. I livelli di FB sono aumentati rapidamente dopo l'iniezione

ed è tornato ai livelli basali in un momento in cui sia i livelli di C5 che di rightin sono rimasti elevati. I livelli di properdina nei topi Cfh–/– sono stati ridotti al basale e aumentati a livelli normali (20 mg/ml30) dopo l'iniezione di IgG-FH1-5 e sono rimasti a questi livelli per almeno 14 giorni. Un andamento temporale simile è stato osservato per l'aumento dei livelli plasmatici di C5. Sorprendentemente, IgG-FH1-5 era per lo più assente dalla circolazione a 11 giorni, indicando che la formazione della convertasi C5 nei topi Cfh–/– è più lenta di quella della convertasi C3 (perché i livelli di C3 sono tornati al basale tra 7 e 11 giorni). Il plasma C5 è aumentato dopo il trattamento anti-P ed è ulteriormente aumentato con la proteina anti-P-FH1-5. Pertanto, sia il targeting della propriadina che gli effetti dell'FH1-5 stavano contribuendo all'aumento dei livelli di C5 e indicano che la C5 convertasi è parzialmente dipendente dalla propriadina nei topi Cfh–/–. Questa scoperta è coerente con il miglioramento della disregolazione di C5 nei topi con deficienza combinata di FH e propriedina.8,9 I livelli di propriedina circolante possono essere ridotti in C3G e sembrano correlare con l'attività della C5 convertasi di superficie in contrasto con C5 plasmatica o C5b solubile{ {30}}.31,32 I nostri dati supportano un legame intimo tra i livelli di propriedina e l'attività della C5 convertasi e supportano l'uso dei livelli di propriena come biomarcatore dell'attivazione glomerulare C5 in corso.

In particolare, la proteina IgG-FH1-5 era ancora rilevabile in circolazione fino a 11 giorni dopo una singola iniezione. Questo è molto più lungo di quanto precedentemente riportato per la proteina FH{4}} di topo non coniugata, che è stata rimossa dalla circolazione entro 24 ore.14 Questo risultato indica che l'emivita plasmatica più lunga dell'IgG-FH{ La proteina {9}} è derivata dalla coniugazione dell'anticorpo. Anche l'emivita plasmatica della proteina IgG-FH1-5 era più lunga di quella osservata in precedenza per l'FH a lunghezza intera.10,11 Ad esempio, l'FH umano è stato rimosso dalla circolazione 96 ore dopo una singola iniezione in topi Cfh–/–.11 In combinazione con i nostri dati che dimostrano l'efficacia della proteina IgG-FH1-5 nella regolazione del complemento, riteniamo che la coniugazione della proteina FH1-5 per prolungarne il profilo farmacocinetico abbia un potenziale terapeutico utilità in C3G.

In sintesi, dimostriamo che, nonostante la mancanza di domini di riconoscimento della superficie, le proteine ​​di fusione FH{0}} erano efficaci nel ridurre l'attivazione del C3 glomerulare e nel ripristinare la regolazione del complemento plasmatico nella carenza di FH. Non vi era alcun vantaggio evidente nel coniugare i domini FH1-5 con l'antipropordina e la proteina IgG-FH1-5 riduceva il danno renale nella nefrite sperimentale. In contrasto con le sfide nella produzione di preparazioni su larga scala di FH per uso terapeutico, la produzione su larga scala di terapie a base di anticorpi è ben consolidata, il che rende l'IgG-FH1-5 un potenziale terapeutico attraente per il C3G.

METODI

Proteine ​​di fusione

IgG-FH1-5. I primi 5 domini SCR FH del mouse (mFH1-5) collegati

a un Ig di topo IgG1 non target (un anticorpo anti-idiotipico sollevato contro un anticorpo monoclonale di topo).

Anti-P-FH1-5. FH murino1-5 legato all'anticorpo murino anti-properdina (anti-P),30 fornito ad Alexion da W. Song, University of Pennsylvania).

Controlli. I controlli erano Ig di topo non-targeting corrispondenti agli isotipi (controllo IgG) e anti-properdina di topo (anti-P) (Figura supplementare S1). Le proteine ​​sono state generate usando vettori pVEK e cellule Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), purificate usando la proteina A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

Saggio emolitico specifico per AP

Il 20% di siero di topo normale titolato da 60 nM a 0,5 nM è stato incubato con eritrociti di coniglio (1.{4}} cellule/ml) a 37°C per 30 minuti. Il rilascio di eme è stato quantificato spettrofotometricamente (densità ottica 415 nm); La lisi al 100% era siero senza inibitore.

Plasma FB e FH

Il plasma è stato ottenuto dopo centrifugazione del sangue raccolto in provette contenenti acido etilendiamminotetraacetico (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Germania). Le proteine ​​sono state misurate mediante test immunologico di elettroforesi capillare (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Gli anticorpi utilizzati sono stati l'anticorpo policlonale FH anti-topo (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) e l'anticorpo FB anti-topo (Abcam, Cambridge, Regno Unito); È stato utilizzato il modulo di rilevamento anti-coniglio WES (ProteinSimple, San Jose, CA). I segnali chemiluminescenti sono stati analizzati con il software Compass per SW (ProteinSimple, versione 5.0.1), quantificati come aree di picco e normalizzati al controllo del test.

Topi

Tutti i topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni; le procedure sono state eseguite secondo le linee guida istituzionali e approvate dall'Home Office del Regno Unito. I topi wild-type C57BL/6 sono stati acquistati dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e i topi Cfh–/– sono stati generati come descritto in precedenza.7 I topi sono stati abbinati per età e sesso; dosi equimolari di proteine ​​sono state somministrate tramite iniezione ip (1 mg per il controllo anti-properdina e IgG; 1,4 mg per IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5). La nefrite sierica nefrotossica accelerata è stata indotta mediante iniezione endovenosa di siero nefrotossico di pecora in topi pre-immunizzati con IgG di pecora.7 La somministrazione delle proteine ​​di fusione è stata eseguita 24 ore prima dell'induzione del siero nefrotossico di pecora (Figura 4a).

La C3, C5 e la appropriatedina libera Il plasma C3 è stato misurato mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico.14 I livelli plasmatici "liberi" di appropriatedina e C5 sono stati misurati utilizzando saggi immunologici di elettrochemiluminescenza (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) con anti -propordino o un C5 antimurino personalizzato rivestito su lastre MSD ad alto legame. Sono stati rilevati appropriatedina e C5 "libere" legate con anti-properdina (da W. Song) o anti-C5 monoclonale biotinilato (Alexion) combinato con streptavidina-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). Il segnale chemiluminescente è stato acquisito utilizzando un imager SECTOR S 6000 (MSD, Meso Scale Diagnostics) ed è stato analizzato con il software MSD Discovery Workbench (Meso Scale

Diagnostica, versione 4.0.12.1). Come standard sono stati usati la correttadina murina ricombinante e C5.

Funzione renale ed istologia

L'ematuria e la proteinuria sono state valutate utilizzando Hema-Combistix (Bayer, Reading, Regno Unito); è stata misurata l'urea plasmatica e il tessuto renale è stato processato come descritto in precedenza.9 La creatinina urinaria è stata determinata su campioni di urine spot utilizzando il test Creatinine Companion Protocol (#1012; Excell, Philadelphia, PA) e spot urine/ l'albumina plasmatica è stata misurata mediante test di immunoassorbimento enzimatico (#E99-134; Beethyl Laboratories, Montgomery, TX). Le sezioni renali colorate con acido di Schiff sono state valutate in cieco e classificate in base alla gravità del danno glomerulare e tubulointerstiziale (0 [nessuno], 1 [lieve], 2 [moderato]). Dieci glomeruli per sezione sono stati valutati per determinare il numero medio di cellule glomerulari. La colorazione dell'immunofluorescenza è stata eseguita su criosezioni di 5- mm montate utilizzando il mezzo Vectashield con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Gli anticorpi utilizzati sono stati anti-topo policlonale di capra coniugato con fluoresceina isotiocianato (FITC) C3b/C3c/iC3b (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; IgG anti-topo di capra policlonale coniugato FITC specifico per la catena del fico (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); IgG anti-capra/pecora monoclonale di topo coniugato con FITC (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); o appropriatedina antiumana di capra coniugata con FITC (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immunologic Laboratories, Copenhagen, Danimarca).9 Anti-topo di capra biotinilato C3d (1:10; # BAF2655; R&S Systems , Minneapolis, MN) è stato utilizzato su sezioni bloccate con biotina (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA), con l'anticorpo secondario della streptavidina AF488 (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). L'FH è stato visualizzato in sezioni bloccate CD16/CD{52}} anti-topo di ratto purificato (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) utilizzando FH antiumano di capra (1:1000; #A312; Quidel, San Diego , CA) e l'anticorpo secondario IgG-FITC anti-capra monoclonale (1:100; clone GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). I macrofagi glomerulari sono stati identificati utilizzando CD68 anti-topo di ratto coniugato con FITC (clone FA-11 GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). L'analisi quantitativa dell'immunofluorescenza è stata eseguita utilizzando un microscopio ottico Leica DM4B accoppiato con la fotocamera digitale Leica DFC700T (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) e il software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, versione 7). Sono stati esaminati dieci glomeruli per sezione e l'intensità media è stata espressa in unità arbitrarie di fluorescienza.

analisi statistica

GraphPad Prism, versione 8.0 (GraphPad, San Diego, CA) è stato utilizzato per l'analisi statistica. Per l'analisi del decorso temporale è stata utilizzata l'analisi della varianza a misure ripetute 2-con il test Bonferroni a confronti multipli (i fattori erano tempo e trattamento). Il test di confronto multiplo di Kruskal-Wallis con Dunn è stato utilizzato per confrontare più gruppi e il test di Mann-Whitney è stato utilizzato per 2 gruppi.

CHIARIMENTI

MCP ha ricevuto commissioni di consulenza da Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope e Achillion Pharmaceuticals. HTC ha ricevuto commissioni di consulenza da Alexion, Novartis, Aurinia e Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ e SK-K sono dipendenti di Alexion Pharmaceuticals. SK è un ex dipendente di Alexion Pharmaceuticals ed è attualmente impiegato da Gemini Pharmaceuticals. Tutti gli altri autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.

RINGRAZIAMENTI

MCP è un Wellcome Trust Senior Fellow in Clinical Science (riferimento 212252/Z/18/Z) e ACG e DPL sono supportati da questa borsa di studio. YZ, SK, YW, KKJ e SK-K sono stati finanziati da Alexion Pharmaceuticals.

MATERIALE SUPPLEMENTARE

File supplementare (PDF)

Figura S1. Le proteine ​​di fusione utilizzate in questo studio. IgG-FH1-5 contiene i primi 5 domini del fattore H murino (FH1-5) collegato a una Ig murina non bersaglio. L'anti-P-FH1-5 è costituito da mFH1-5 legato a un anticorpo neutralizzante murino anti-propordina di topo (anti-P; vedere Miwa et al.30). Le proteine ​​di controllo includevano una Ig murina non mirata isotipica (controllo IgG) e l'anticorpo neutralizzante della proprietà anti-topo di topo (Anti-P). Figura S2. Analisi WES blot per rilevare FH1-5 in campioni di plasma di topi carenti di FH iniettati con (A) IgG-FH1-5 o (B) Anti-P-FH1-5. La 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5) è rilevabile fino a 11 giorni dopo l'iniezione di IgG-FH1-5 e fino a 4 giorni dopo l'iniezione di proteina anti-P-FH1-5 (caselle rosse ). I controlli includevano il plasma di topi selvatici in cui viene rilevata la proteina del fattore H a lunghezza intera (FH, scatole nere, corsia C1) e topi privi di FH non iniettati, dove non è evidente FH (scatole nere, corsia C2,). Come previsto, né FHnorFH1-5 è rilevabile nei campioni di plasma di topi a cui è stato iniettato il controllo Anti-P o IgG.

Figura S3. Immunocolorazione del complemento glomerulare 96 ore dopo l'iniezione di controllo IgG o anti-P-FH1-5 in topi wild-type. Vengono mostrate immagini glomerulari rappresentative (barra ¼ 100 mm).

Figura S4. Il ruolo della propriedina sulla deposizione di anti-P-FH1-5 nei glomeruli di topi carenti di FH. I topi Cfh–/– sono stati iniettati con controllo IgG o anti-P (trattamento 1) seguiti 24-ore dopo da controllo IgG o anti-P-FH1-5 (trattamento 2). Gli animali sono stati abbattuti 120 ore dopo il trattamento uno ed è stata valutata la colorazione glomerulare per IgG, rightin e FH/FHR. Vengono mostrate immagini rappresentative. L'iniezione di anti-P ha ridotto marcatamente la correttadina (riga 1, colonna 2) ma non la colorazione FH/FHR (rimane invariata) o IgG (rimane assente). La somministrazione di anti-P-FH1-5 24-ore dopo che il controllo IgG ha determinato la comparsa di una colorazione granulare con anticorpi anti-IgG, anti-FH/FHR e anti-P, come osservato dopo l'iniezione di anti-P-FH 1-5 da solo (vedi Figura 3b). Questa colorazione granulare è stata ridotta quando l'iniezione di anti-P-FH1-5 è stata preceduta da un'iniezione di anti-P, che esaurisce sia la circolazione (vedi Figura 1h) che glomerulare (vedi Figura 3b). La colorazione glomerulare con anti-IgG era evidente solo nei topi a cui era stato iniettato anti-P-FH1-5 (riga 3, colonne 3 e 4) ed era significativamente più bassa nei topi che avevano ricevuto anti-P-FH1-5 preceduto da anti-P. Abbiamo concluso che la deposizione di anti-P-FH1-5 nei glomeruli di topi Cfh–/– dipendeva in parte dalla propriadina. Le barre orizzontali denotano i valori mediani e i baffi denotano l'intervallo interquartile. Il valore P è stato derivato dal test di Mann-Whitney. Barra ¼ 100 mm.

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