Potenziale cosmeceutico degli estratti derivati ​​dai residui dell'industria della pesca: scarti di sardine e telai di merluzzo, parte 2

3.2. Attività antibatterica

Il glicoside di cistanche può anche aumentare l'attività della SOD nei tessuti del cuore e del fegato e ridurre significativamente il contenuto di lipofuscina e MDA in ciascun tessuto, eliminando efficacemente vari radicali reattivi dell'ossigeno (OH-, H₂O₂, ecc.) e proteggendo dai danni al DNA causati da radicali OH. I glicosidi feniletanoidi di Cistanche hanno una forte capacità di scavenging dei radicali liberi, una maggiore capacità riducente rispetto alla vitamina C, migliorano l'attività della SOD nella sospensione dello sperma, riducono il contenuto di MDA e hanno un certo effetto protettivo sulla funzione della membrana dello sperma. I polisaccaridi Cistanche possono migliorare l'attività di SOD e GSH-Px negli eritrociti e nei tessuti polmonari di topi sperimentalmente senescenti causati dal D-galattosio, nonché ridurre il contenuto di MDA e collagene nei polmoni e nel plasma e aumentare il contenuto di elastina, hanno un buon effetto scavenging su DPPH, prolunga il tempo di ipossia nei topi senescenti, migliora l'attività della SOD nel siero e ritarda la degenerazione fisiologica del polmone nei topi senescenti sperimentalmente Con la degenerazione morfologica cellulare, gli esperimenti hanno dimostrato che Cistanche ha la buona capacità antiossidante e ha il potenziale per essere un farmaco per prevenire e curare le malattie dell'invecchiamento cutaneo. Allo stesso tempo, l'echinacoside in Cistanche ha una significativa capacità di eliminare i radicali liberi DPPH e ha la capacità di eliminare le specie reattive dell'ossigeno e prevenire la degradazione del collagene indotta dai radicali liberi, e ha anche un buon effetto di riparazione sul danno dell'anione dei radicali liberi della timina.

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S. aureus e K. pneumoniae sono stati scelti come batteri gram-positivi e gram-negativi rappresentativi per valutare la capacità antimicrobica degli estratti. I test di attività antibatterica eseguiti con gli estratti di baccalà hanno rivelato che tutti erano in grado di influenzare il comportamento di crescita di entrambi i ceppi batterici (risultati MIC* nelle tabelle 3 e 4). Tuttavia, la vera inibizione della crescita (valori MIC) non si è verificata in presenza di nessuno degli estratti alle concentrazioni testate.

Poiché S1 e S3 sono stati solubilizzati in DMSO, sono stati eseguiti saggi con questo solvente per valutare la sua influenza sui risultati ottenuti per gli estratti di sardine. I risultati rivelano che la massima concentrazione di DMSO utilizzata nei test di attività antibatterica dei diversi estratti (fino al 12,5%) non ha influenzato la crescita di entrambi i ceppi batterici.

In generale, tutti gli estratti di sardine hanno inibito la crescita batterica di ceppi selezionati sia gram-positivi che gram-negativi, ma è stato dimostrato che S. aureus è più suscettibile di K. pneumoniae, il che è previsto poiché la membrana esterna dei batteri gram-negativi pone una barriera aggiuntiva per prevenire l'interferenza di diverse molecole con la cellula [44]. L'S2 ha dimostrato di essere l'estratto con il potenziale antibatterico più promettente, indicando che temperature di estrazione più elevate hanno favorito l'estrazione di composti antibatterici. Tenendo conto di questi risultati, S2 è stato selezionato per essere testato contro un altro batterio gram-positivo, vale a dire C. acnes, un anaerobio aerotollerante legato alla condizione della pelle dell'acne [45]. Per valutare l'impatto del processo di sgrassamento sulla capacità di inibizione della crescita di C. acnes, è stato selezionato anche il campione S3 da testare in questo test. I risultati sono riassunti nella Tabella 5 che mostra che C. acnes si comporta in modo simile a S. aureus con la sua crescita influenzata da entrambi gli estratti di sardine. Tra i due campioni, S2 ha presentato il più alto effetto inibitorio (valori MIC e MBC inferiori) suggerendo che il processo di sgrassatura potrebbe modificare o eliminare alcuni composti antimicrobici dai campioni di sardine prima del processo di estrazione, in particolare gli acidi grassi liberi e i prodotti di ossidazione dei lipidi [22 ].

Precedenti studi hanno dimostrato che alcuni residui di aminoacidi presenti nei peptidi possono portare a diverse attività antibatteriche [46]. Rodrigues et al. hanno dimostrato che gli estratti ricchi di derivati ​​proteici ottenuti mediante estrazione con solventi eutettici profondi (DES) dai flussi di scarto della lavorazione delle sardine hanno attività antibatterica nei confronti di S. aureus ed Escherichia coli [47]. Tuttavia, i valori MIC*, MIC e MBC di questi estratti erano inferiori a quelli ottenuti in questo lavoro per la stessa materia prima, il che potrebbe essere spiegato dall'effetto sinergico e/o additivo tra i componenti degli estratti e il DES, come descritto precedentemente [29]. Tuttavia, l'effetto antimicrobico dell'estratto S2 è simile ad altri estratti ottenuti mediante estrazione subcritica con acqua, vale a dire utilizzando foglie di k¯anuka (S. aureus—MIC: 0,9 mg/mL, MBC: 3,8–5 mg/ mL; E. coli—MIC: 3,8–7,5 mg/mL, MBC: 4,4–7,5 mg/mL) [48], che sono ricchi di composti fenolici già riconosciuti come dotati di rilevanti effetti antimicrobici [49].

In questo studio, il più alto coefficiente di correlazione ottenuto è stato per i valori MIC di S. aureus e il contenuto totale di acido glutammico (R2=0.6, Tabella S1).

3.3. Antiossidante cellulare e effetto antinfiammatorio

In questo lavoro, è stata utilizzata una linea cellulare di cheratinociti umani (HaCaT) per comprendere meglio la bioattività, vale a dire gli effetti antiossidanti e antinfiammatori, degli estratti poiché alcuni dei processi correlati all'assorbimento, alla distribuzione e al metabolismo dei composti bioattivi sono meglio affrontati [50]. Le cellule HaCaT sono uno dei tipi cellulari predominanti che si incontrano nella pelle, essendo responsabili dell'integrità della pelle e, se colpite dalla senescenza o dallo stress ossidativo, possono accelerare il processo di invecchiamento della pelle [51]. Inoltre, i cheratinociti svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'infiammazione cutanea, rispondendo a stimoli esterni, come l'LPS batterico, e contribuendo attivamente alle vie infiammatorie, in particolare rilasciando citochine proinfiammatorie o chemochine [31,52].

Nel primo approccio, sono stati eseguiti test di citotossicità per valutare la sicurezza dei campioni e selezionare concentrazioni non tossiche per ulteriori studi di bioattività. La tabella 6 presenta i valori IC50 di ciascun campione che mostrano che S1 ha presentato l'effetto citotossico più elevato. In studi precedenti, questi campioni hanno mostrato valori IC50 più elevati in Caco-2, un modello per gli enterociti di cripta, rispetto a HaCaT, il che indica che i campioni sono più tossici per i cheratinociti rispetto alle cellule intestinali [11,22].

L'attività antiossidante cellulare è stata quindi valutata valutando la capacità dei campioni di eliminare i ROS intracellulari generati dal fattore di stress chimico AAPH. Parallelamente, sono stati eseguiti anche test anti-infiammatori per studiare l'effetto dei campioni nel ridurre la secrezione di IL-8, che è stato costantemente riportato come un importante biomarcatore di infiammazione cutanea [53-55], in seguito a stimolo pro-infiammatorio con LPS. In questi saggi sono state utilizzate concentrazioni non citotossiche degli estratti (0.1875, 0.375 e {{10}}.75 mg/mL per tutti i campioni tranne S1 dove 0,75 mg/mL non è stato testato poiché questa concentrazione presentava un effetto citotossico, Tabella 6). In generale, tutti i campioni hanno inibito la formazione di ROS in HaCaT ed è stato osservato un effetto dose-dipendente (Figura 1). Tra i campioni di merluzzo, Cf2 e Cf4 hanno mostrato le più alte attività antiossidanti cellulari e tra i campioni di sardine, S1 ha mostrato la più alta riduzione percentuale di ROS rispetto al controllo.

Per quanto riguarda l'effetto antinfiammatorio, solo Cf1 (0.375 e 0.75 mg/mL), S2 (0.75 mg/mL) e S3 ({{1 0}}.375 e 0,75 mg/mL) hanno rivelato la capacità di inibire la secrezione di IL-8 da parte delle cellule HaCaT dopo l'infiammazione indotta da LPS (Figura 2). Al contrario, gli altri campioni non hanno ridotto IL-8 e, per alcune concentrazioni, Cf4 e S1 hanno mostrato un effetto pro-infiammatorio. Questi due estratti sono stati quelli che hanno dimostrato il più alto effetto citotossico nelle cellule HaCaT e quindi le concentrazioni testate, sebbene non portino alla morte cellulare, potrebbero indurre l'attivazione di vie infiammatorie poiché le cellule danneggiate possono rilasciare segnali di pericolo che avvisano altre cellule della morte cellulare. 56].

Gli estratti con il più alto effetto antinfiammatorio, vale a dire Cf1, S2 e S3, sono stati ulteriormente selezionati per valutare la loro capacità di inibire la secrezione di IL-6, una citochina riconosciuta anche come un importante biomarcatore nei disturbi della pelle [53]. I risultati mostrano che Cf1 è stato l'unico campione in grado di ridurre significativamente la secrezione di IL-6 di 69,4 ± 3,5 e 53.0 ± 14,7% di IL-6 (rispetto al controllo positivo, p-value < 0.{{20}}01) rispettivamente a 0,375 e 0,75 mg/mL, mentre gli estratti di sardina sono aumentati nei livelli di IL-6 dei supernatanti (Figura 3). Nel complesso, solo Cf1 ha rivelato la capacità di ridurre la secrezione sia di IL-8 che di IL-6 da parte delle cellule HaCaT, suggerendo che questo estratto di merluzzo potrebbe essere ulteriormente esplorato per applicazioni antinfiammatorie nelle condizioni della pelle.

L'attività antinfiammatoria degli estratti di merluzzo era stata precedentemente valutata in una linea cellulare intestinale (cellule Caco-2) [11] e i risultati erano in linea con i dati presentati in questo studio per le cellule HaCaT. In entrambe le linee cellulari, Cf1 ha presentato il più alto effetto antinfiammatorio, rafforzando l'uso di temperature più basse per estrarre composti bioattivi dai telai di merluzzo.

I nostri risultati provengono da studi precedenti a sostegno dell'idea che gli estratti/idrolisati derivati ​​dal pesce mostrino un ampio spettro di bioattività, tra cui attività antiossidanti, antimicrobiche, anti-invecchiamento, anti-ipertensive, anti-virus dell'immunodeficienza umana, anti-proliferative o anticoagulanti. 23,57]. Canzone et al. hanno dimostrato che gli idrolizzati enzimatici dell'acciuga a mezza pinna di pesce marino contenevano frazioni peptidiche antibatteriche, con attività contro E. coli [58]. Anche la pelle di pesce e il collagene idrolizzato mediante idrolisi subcritica dell'acqua hanno mostrato un'elevata attività antiossidante e antimicrobica contro Bacillus cereus, S. aureus e Pseudomonas putida [59]. Inoltre, Wang e collaboratori hanno prodotto estratti derivati ​​da corsi d'acqua di due specie ittiche (trota iridea e sogliola) che potrebbero inibire la crescita di batteri patogeni (S. aureus o Salmonella) e con proprietà antinfiammatorie [60].

4. Conclusioni

In questo lavoro, abbiamo applicato una piattaforma di saggi biologici in vitro per valutare per la prima volta il potenziale cosmeceutico di estratti proteici derivati ​​da scarti della pesca, in particolare residui di sardine e telai di merluzzo, ottenuti mediante tecnologia ad alta pressione. Abbiamo dimostrato che entrambi i tipi di estratti hanno mostrato un potenziale antiossidante, anti-invecchiamento e anti-iperpigmentazione. Tra tutti, gli estratti di sardine hanno presentato la più alta attività antibatterica e questo effetto è stato più pronunciato per i campioni ottenuti utilizzando temperature di estrazione più elevate (250 °C) e senza la fase di sgrassatura. I campioni di merluzzo erano gli agenti antinfiammatori più efficaci e, in questo caso, temperature più basse (90 °C) hanno favorito l'estrazione di questi composti bioattivi. Sebbene siano necessari ulteriori studi per identificare quali composti potrebbero essere responsabili degli effetti bioattivi, la treonina totale, la valina libera e la leucina libera e totale sono state identificate per essere altamente correlate con le attività antiossidanti dei campioni. Il contenuto proteico totale e l'arginina libera erano correlati rispettivamente con le attività di inibizione dell'elastasi e della tirosinasi.

Questo lavoro è un passo avanti nello sviluppo di potenziali ingredienti cosmeceutici con effetti antiossidanti, sbiancanti per la pelle, antimicrobici e antinfiammatori da residui di sardine e telai di merluzzo, aggiungendo un potenziale valore elevato a questi rifiuti dell'industria della pesca.

Contributi dell'autore:Concettualizzazione, ICL, FBG, PS, AP, RM, NF e ATS; metodologia, MC, AB, ICL, FBG, NF e ATS; indagini, MC, ICL, FBG, MM, RM, NF e ATS; risorse, FBG, NF e ATS; scrittura—preparazione della bozza originale, MC; scrittura: revisione e modifica, ICL, FBG, RM, PS, NF e ATS; supervisione, FBG, PS, NF e ATS; acquisizione di finanziamenti, FBG, PS, NF e ATS Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento: Questo lavoro è stato finanziato dalla Fundação para a Ciência ea Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (FCT/MCTES, Portogallo) attraverso il progetto PTDC/ASPPES/28399/2017 e dai fondi nazionali iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 e UIDP/ 04462/2020) e i Laboratori Associati LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) e LAQV (UIDB/QUI/50006/2020). Il finanziamento del programma INTERFACE, attraverso il Fondo per l'innovazione, la tecnologia e l'economia circolare (FITEC), è riconosciuto con gratitudine. ATS riconosce anche FCT/MCTES per la sovvenzione individuale CEECIND/04801/2017.

Ringraziamenti:Ringraziamo Pascoal e Filhos SA (Gafanha da Nazaré, Portogallo) e Conservas A Poveira SA (Portogallo) per averci fornito, rispettivamente, i telai di merluzzo dell'Atlantico (Gadus morhua) e gli scarti di sardina (Sardina pilchardus) utilizzati in questo lavoro.

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