L'assorbimento di citochine durante la perfusione renale umana riduce la firma genica infiammatoria associata alla funzione ritardata dell'innesto

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Giovanni R. Ferdinando1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomas Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Unità di Immunità Molecolare, Dipartimento di Medicina dell'Università di Cambridge, Laboratorio di Biologia Molecolare, Cambridge, Regno Unito

2 National Institute of Health Research Blood and Transplant Research Unit in Organ Donation, Cambridge, Regno Unito

3 Dipartimento di Chirurgia dell'Università di Cambridge, Cambridge, Regno Unito

Il trapianto è il trattamento ottimale per la maggior parte dei pazienti con stadio terminalerenepatologiama la carenza di organi è una sfida importante. La perfusione con macchina normotermica (NMP) è stata utilizzata per ricondizionare gli organi marginali; tuttavia, i meccanismi attraverso i quali l'NMP potrebbe avvantaggiare gli organi non sono ben compresi. Utilizzando coppie di reni umani ottenuti dallo stesso donatore, abbiamo confrontato l'effetto della NMP con quello della cella frigorifera sulrenetrascrittoma. Abbiamo scoperto che la conservazione a freddo ha portato a una riduzione globale dell'espressione genica, compresi i geni della via infiammatoria e quelli necessari per i processi di generazione di energia, come la fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Al contrario, durante l'NMP, si è verificata una marcata sovraregolazione dei geni OXPHOS, ma anche di un certo numero di geni della via immunitaria e infiammatoria. Utilizzando biopsie di reni sottoposti a NMP che sono stati successivamente trapiantati, abbiamo scoperto che una maggiore espressione genica infiammatoria si verificava in organi con funzione di trapianto ritardata prolungata (DGF). Pertanto, abbiamo utilizzato un adsorbitore di orlo (HA) per rimuovere le citochine pro-infiammatorie. Questa espressione genica infiammatoria attenuata ha aumentato i geni del percorso OXPHOS e ha avuto effetti potenzialmente clinicamente importanti nel ridurre l'espressione di una firma genica associata a DGF. Insieme, i nostri dati suggeriscono che l'assorbimento dei mediatori pro-infiammatori dal perfusato rappresenta un potenziale intervento che può migliorare la vitalità dell'organo.

PAROLE CHIAVE:ricerca/pratica clinica, funzione di trapianto ritardato (DGF), donatori e donazione: deceduto,rene(allotrapianto) funzione/disfunzione,renepatologia: immunitario/infiammatorio, renale

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1. INTRODUZIONE

Reneil trapianto rappresenta il trattamento ottimale per la maggior parte dei pazienti constadio terminalerenepatologia, con benefici sia per la qualità che per la quantità di vita.1 La carenza di organi è una sfida importante e sono state impiegate diverse strategie per aumentare il numero di reni disponibili, incluso l'uso di donatori di morte circolatoria (DCD) e donatori con criteri estesi (ECD ), entrambi associati a tassi più elevati di funzione ritardata del trapianto (DGF) rispetto al donatore deceduto con morte del tronco cerebrale (DBD).2,3 Nei reni DCD, l'esposizione all'ischemia calda durante il processo di cessazione circolatoria fornisce un contributo significativo al DGF . Il DGF si verifica a causa del danno o della morte delle cellule tubulari ischemiche, che possono stimolare l'attivazione immunitaria innata tramite l'assemblaggio dell'inflammasoma NLRP3 che porta alla generazione di interleuchina (IL)1 e IL18.4-6 In effetti, la presenza di citochine infiammatorie nelle urine è stata usato come biomarcatore diacutorenelesionee DGF.{0}}

La perfusione con macchina normotermica (NMP) consente di perfondere gli organi trapiantati con globuli rossi caldi e ossigenati, in assenza di componenti immunitarie circolanti, inclusi complemento e neutrofili.10-14 Questo processo è stato utilizzato per valutare gli organi marginali15 e per " ricondizionare" gli organi per facilitare il trapianto di reni che erano stati inizialmente rifiutati a seguito di un'offerta tramite un servizio nazionale di assegnazione di organi.16 La nostra precedente esperienza sull'utilizzo dell'NMP ha fornito la motivazione per uno studio randomizzato controllato per valutarne l'efficacia nella prevenzione del DGF nei reni DCD,17 ma i meccanismi attraverso i quali l'NMP potrebbe avvantaggiare i reni trapiantati non sono completamente compresi. Inoltre, la questione se un'ulteriore manipolazione delrenedurante l'NMP, ad esempio mediante la rimozione di citochine e chemochine pro-infiammatorie dal perfusato, potrebbe offrire ulteriori vantaggi nell'ottimizzazione dell'organo prima del trapianto non è stato affrontato nei reni umani, ma il nostro studio sull'NMP suino ha dimostrato risultati promettenti.18

Qui abbiamo adottato un approccio imparziale per affrontare queste due domande utilizzando l'analisi trascrittomica dell'essere umanorenebiopsie effettuate all'inizio e alla fine dell'NMP per valutare i cambiamenti globali nell'espressione genica. Abbiamo utilizzato coppie di reni umani provenienti da un singolo donatore consentendo un confronto dell'effetto di diversi interventi in organi con un background genetico identico e siamo stati in grado di valutare l'impatto di tali cambiamenti su una previsione dell'esito del trapianto.

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2. RISULTATI

2.1. I reni accoppiati sono geneticamente simili e rappresentano un modello utile per valutare gli interventi

Abbiamo studiato i cambiamenti trascrizionali associati alla conservazione degli organi e alla NMP in due studi indipendenti, ciascuno con cinque paia di reni, per un totale di 10 paia/20 reni umani. Di questi, due provenivano da DBD e otto da donatori DCD (Tabella S1, S2 e Figura S1). In questi studi, abbiamo preso biopsie corticali prima e dopo l'intervento (conservazione a freddo o NMP) e abbiamo studiato il paesaggio trascrizionale utilizzando il sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq). L'uso di reni accoppiati e biopsie accoppiate dallo stessoreneci ha permesso di controllare la variazione biologica e di regredire questo confondente dall'analisi (Figura S2A). Lo abbiamo confermatorenele coppie iniziano con un paesaggio trascrizionale comune (Fig. S2B) e applicando a ciascuna diversi interventirenein coppia, siamo in grado di studiare l'effetto di un intervento indipendente dalla variazione biologica.

FIGURA 1 I reni esposti a celle frigorifere mostrano cambiamenti limitati nell'espressione genica rispetto a quelli sottoposti a NMP. Sono stati ottenuti un paio di reni che erano stati rifiutati per l'uso nel trapianto. Unoreneè stato mantenuto in celle frigorifere statiche e l'altro è stato sottoposto a perfusione con macchina normotermica (NMP). Le biopsie sono state prelevate dalla corteccia esterna all'inizio e dopo 2 ore. B, Grafico del vulcano che indica un cambiamento nell'espressione genica a 2 ore per il gruppo indicato rispetto all'inizio. I punti rossi indicano geni differenzialmente espressi con un valore P aggiustato<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

FIGURA 2 Correlazione del trascrittoma dopo NMP con la durata della funzione ritardata dell'innesto. Un'espressione genica è stata correlata alla lunghezza del DGF nelle biopsie eseguite dopo l'NMP come parte di uno studio clinico randomizzato. Sono stati tracciati i livelli di espressione dei 1000 geni con la maggiore correlazione con il risultato. B, GSEA è stato eseguito per la correlazione di A con il set di dati dei segni distintivi. Solo percorsi significativi (valore FDR q<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. L'NMP determina un aumento di OXPHOS e dei geni della via infiammatoria rispetto alla cella frigorifera

Per studiare i potenziali meccanismi con cui l'NMP potrebbe avere un impatto sui reni, inizialmente ne abbiamo presi cinquerenecoppie (n {{0}} donatori DCD e n=1 donatore deceduto di morte del tronco cerebrale [DBD], Figura S1, Tabella S1) ed eseguito una biopsia corticale di tempo 0 (0 ore) . A questo punto, i reni sono stati randomizzati in celle frigorifere statiche o NMP, come descritto in precedenza 10 (Figura 1A). Dopo 2 ore, è stata prelevata una seconda biopsia da entrambi i reni ed è stata eseguita l'RNA-Seq. Quando abbiamo confrontato l'espressione genica tra le biopsie del tempo 0- e 2-ora, abbiamo scoperto che i reni posti in celle frigorifere statiche non presentavano alcun cambiamento statisticamente significativo nell'espressione di alcun singolo gene quando corretti per test multipli (Figura 1B , pannello di sinistra). Al contrario, nel corso di 2 ore di NMP, 956 geni sono stati sovraregolati e 353 geni sono stati sottoregolati (Figura 1B, pannello di destra). Successivamente abbiamo valutato i cambiamenti nell'espressione di gruppi di geni all'interno di un percorso comune, confrontando decine o centinaia di geni piuttosto che qualsiasi singolo gene, riducendo così ulteriormente l'effetto della variazione biologica interindividuale sull'analisi. Ciò ha rivelato cambiamenti in percorsi funzionalmente importanti, in cui l'espressione di ogni singolo gene all'interno di quel percorso non è stata alterata in misura sufficiente per raggiungere la significatività statistica. Questa analisi di arricchimento del set di geni (GSEA) ha dimostrato che la conservazione a freddo ha avuto un impatto sostanziale su una serie di vie metaboliche (Figura 1C, pannello di sinistra). In particolare, si è verificata una marcata riduzione dei geni coinvolti nella fosforilazione ossidativa (OXPHOS), un percorso chiave necessario per generare ATP.19 Al contrario, OXPHOS era tra i percorsi significativamente sovraregolati durante l'NMP (Figura 1C, pannello di destra), con potenziali benefici per la vitalità cellulare e il ripristino dell'omeostasi cellulare. Inoltre, durante l'NMP sono state indotte numerose vie coinvolte nei processi immunitari o infiammatori, con la "segnalazione del TNF tramite NFkB" che ha dimostrato l'aumento maggiore. In linea con questo, il TNF, così come IL1B e le chemochine di reclutamento dei neutrofili CXCL8 (IL8) e CXCL2, erano tra i geni più sovraregolati nelle biopsie NMP dell'ora 2- (Figura 1D). L'analisi delle stringhe dei primi 50 geni sovraregolati ha rivelato una sovraregolazione di geni correlati biochimicamente che erano raggruppati in quattro nodi principali; IL8 e chemochine di reclutamento dei neutrofili, geni associati all'inflammasoma, segnalazione NFkB e regolazione trascrizionale (Figura 1E). Da notare che i reni DBD e DCD erano trascrizionalmente simili al basale (Figura S2C) e le vie geniche che cambiano durante l'NMP erano simili nei reni DBD e DCD (Figura S2D). Insieme, la nostra analisi dimostra che durante l'NMP, c'è una maggiore espressione di geni che promuovono la generazione di energia, con effetti potenzialmente benefici per l'organo, ma una simultanea induzione di geni pro-infiammatori, che possono essere deleteri.

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2.3. Geni della via infiammatoria nei reni NMP associati a una prolungata funzione ritardata dell'innesto

Al fine di collegare i cambiamenti trascrizionali che si verificano durante la conservazione a freddo e l'NMP ai risultati clinici, abbiamo eseguito RNA-Seq su biopsie prelevate da 33 reni DCD che erano stati sottoposti a NMP come parte di uno studio clinico randomizzato che attualmente ne valuta l'efficacia.17 I campioni erano disponibili su un sottogruppo di reni randomizzati al braccio NMP dello studio che è stato successivamente trapiantato (Tabella S3, Figura S1). Il DGF è più comune nei reni DCD ed è classicamente definito come un requisito per la dialisi nella prima settimana dopo il trapianto. Tuttavia, nell'immediato periodo post-trapianto, alcuni pazienti ricevono un singolo episodio di dialisi per iperkaliemia, che non riflette necessariamente la presenza di una significativa necrosi tubulare acuta. Pertanto, abbiamo utilizzato un modello che correla l'espressione genica con il tempo tra l'intervento chirurgico di trapianto e l'ultima sessione di dialisi (cioè, la durata del DGF). Ciò ha mostrato cambiamenti trascrizionali più marcati nei trapianti che richiedono la dialisi oltre le prime 24 ore del post-trapianto (Figura 2A), nonché una correlazione positiva significativa tra l'espressione dei geni della via infiammatoria, inclusa la "segnalazione del TNFA tramite NFkB" e le vie di "risposta infiammatoria" e la lunghezza del DGF, con un maggiore arricchimento di questi percorsi nei reni che hanno subito un DGF più prolungato dopo il trapianto (Figura 2B). Al contrario, la lunghezza del DGF era correlata negativamente con l'entità dell'espressione dei geni del percorso "OXPHOS" (Figura 2B). Presi, questi dati insieme indicano che dopo l'NMP, i reni che hanno una minore espressione dei geni della via infiammatoria e una maggiore espressione dei geni della via "OXPHOS" sono meno suscettibili al prolungato DGF post-trapianto. Ciò sosterrebbe la conclusione che i cambiamenti molecolari che si verificano durante l'NMP possono avere effetti sia benefici (induzione dei geni del percorso OXPHOS) che deleteri (induzione dei geni del percorso infiammatorio).

2.4. La produzione di urina e il flusso sanguigno renale durante NMP dimostrano associazioni diverse con OXPHOS e geni della via infiammatoria

La quantità di urina prodotta durante l'NMP è uno dei numerosi parametri inclusi nei punteggi di valutazione della qualità chirurgica utilizzati per guidare le decisioni sull'utilizzo degli organi,15 ma se un'elevata produzione di urina durante l'NMP fa presagire davvero una buona prognosi per il rene e le vie molecolari sottostanti attivate in i reni con un'elevata produzione di urina non sono chiari. In un totale di 10 rene sottoposto a NMP (solo reni NMP, Tabella S1 e S2, Figura S1), abbiamo osservato un intervallo di produzione di urina da 0 a 340 ml nel periodo di 2-ora di perfusione (Figura 3A pannello sinistro). Da notare, quando abbiamo confrontato i percorsi che cambiano durante l'NMP in cinque reni in due esperimenti indipendenti, abbiamo scoperto che sono stati indotti percorsi simili (Figura S3A) a conferma della riproducibilità del nostro disegno sperimentale e dell'utilità di confrontare percorsi piuttosto che singoli geni. Nelle 2-biopsie successive alla perfusione, l'espressione di 11 geni era significativamente correlata al volume di urina prodotto durante questo periodo. Questi includevano proteine ​​​​da shock termico (HSP), HSPA1A, HSPA1B e HSPH1, che erano positivamente correlate con una maggiore produzione di urina (Figura 3A pannello di destra). L'analisi dell'arricchimento del set genico ha mostrato che la produzione di urina era anche correlata positivamente con i geni della via "segnalazione TNF tramite NFkB" e correlata negativamente con i geni OXPHOS nelle biopsie postperfusione (Figura 3B, S3C). Allo stesso modo, nelle biopsie pre-perfusione, OXPHOS era correlato negativamente con la produzione di urina in questi reni mentre le vie associate all'attivazione immunitaria, tra cui "segnalazione del TNF tramite NFkB" e "rigetto dell'allotrapianto", erano correlate positivamente con la produzione di urina, suggerendo che l'NMP ha avuto scarso effetto su questi processi o su altri percorsi analizzati, nei reni ad alta produzione di urina (Figura 3B, S3C-D). Poiché l'induzione dei geni della via infiammatoria è stata osservata nei nostri campioni clinici con DGF prolungato (Figura 2B), questi dati sfidano il dogma secondo cui un'elevata produzione di urina si verifica in reni più vitali e "sani" e suggeriscono che in realtà questi reni potrebbero avere più potenziale infiammatorio, sono meno in grado di generare energia e che questa non viene sostanzialmente alterata durante la NMP.

Anche il flusso sanguigno renale durante la perfusione è stato valutato come parametro che può riflettere la successiva funzione del trapianto.15 Nei 10 reni studiati, il flusso sanguigno renale a 2 ore di perfusione variava da 14,1 a 168,8 ml/minuto (Figura 3C pannello sinistro). Nelle 2- biopsie postperfusione dell'ora, otto geni erano significativamente correlati positivamente con l'aumento del flusso sanguigno renale (Figura 3C pannello di destra), incluso HSPA1L, ma non vi era alcuna sovrapposizione diretta tra questo elenco di geni e quelli correlati alla produzione di urina (Figura 3A ). L'analisi dell'arricchimento del set genico ha dimostrato che un flusso sanguigno renale elevato era correlato positivamente con i geni OXPHOS nelle biopsie di 0-ore, ma contrariamente a quelle con la più alta produzione di urina, la perfusione ha avuto un impatto significativo, risultando in una correlazione negativa con "OXPHOS" geni del percorso di 2 ore (Figura 3D, Figura S4A-B). I flussi di sangue renale sono correlati negativamente con una serie di percorsi genici immunitari e infiammatori in entrambe le biopsie 0- e 2- dell'ora (Figura 3D, Figura S4B), in contrasto con la produzione di urina (Figura 3B, Figura S3C). Insieme, questi dati suggeriscono che il flusso sanguigno renale e la produzione di urina potrebbero non essere indicatori equivalenti di un rene più vitale, ma che il primo potrebbe identificare più fedelmente unrenemeno probabilità di avere DGF prolungato.

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2.5. L'aggiunta di un adsorbitore per orlo al circuito di perfusione non ha alcun effetto sui parametri di perfusione ma riduce significativamente l'espressione genica infiammatoria, inclusi NLRP3 e IL1B

Analisi direneperfusate hanno dimostrato un aumento sostanziale della concentrazione di citochine e chemochine pro-infiammatorie durante il decorso dell'ipotermia e della NMP.20,21 Queste molecole bioattive ricircolano nel rene, con il potenziale di indurre ulteriore infiammazione. Dato che la nostra analisi dei trapiantatirenecampioni hanno indicato che l'induzione di geni TNF-dipendenti nei reni NMP era associata al DGF (Figura 2B), abbiamo ipotizzato che la rimozione di citochine e chemochine dal circuito di perfusione possa attenuare l'induzione del gene infiammatorio, con potenziali effetti benefici per il rene. Tale approccio ha mostrato una certa efficacia nei pazienti con sindrome da risposta infiammatoria sistemica,22,23, ed è stato associato a un aumento del flusso sanguigno renale nei reni suini sottoposti a NMP.18 Per testare questo aspetto nei reni umani, abbiamo preso altre cinque coppie di reni ed eseguito NMP per 4 ore con biopsie eseguite a 0, 2 e 4 ore (Figura S1). In ogni caso, al circuito di perfusione di un rene all'interno di ciascuna coppia (NMP più HA) è stato aggiunto un adsorbitore orlo di citosol (HA) che rimuove le molecole con un peso molecolare di 10-50 kDa (Figura 4A). Come anticipato, l'aggiunta dell'HA ha comportato concentrazioni inferiori di una varietà di citochine nel perfusato (Figura 4B) ma non ha avuto alcun effetto sul flusso sanguigno renale, sulla produzione o sulla composizione delle urine, sul consumo di ossigeno e sull'omeostasi acido-base (Figura 4C, Tabelle S4, S5). Pertanto, in 4 ore di NMP, l'HA non ha avuto alcun impatto sui parametri di perfusione attualmente utilizzati clinicamente per generare punteggi di valutazione della qualità, ma ha avuto un effetto sostanziale sull'espressione genica; Dopo NMP, i geni 1794 e 4026 sono stati sovraregolati rispettivamente a 2 e 4 ore, inclusi TNF e IL6 (Figura 4D, E). ma solo la metà di questo numero (n=898 e n=2606) è stato aumentato quando era presente l'HA (Figura 4D, Figura S5A e B). Anche il numero di geni sottoregolati è stato ridotto dall'aggiunta di HA (Figura 4D). Dopo 4 ore di NMP, 46 geni erano significativamente sovraregolati e 181 sottoregolati con l'aggiunta dell'HA (Figura 4F). Questa risposta trascrizionale attenuata includeva geni associati all'attivazione dell'inflammasoma NLRP3, come IL1B, NLRP3 e CASP1 (Figura 4G, Figura S4B) e alcune chemochine di reclutamento dei neutrofili (Figura S5C), precedentemente associate a danno renale in modelli animali.24,25 Ciò dimostra che i mediatori solubili rilasciati dalrenericircolare e guidare l'espressione de novo dei geni infiammatori all'interno dell'organo, ma che ciò può essere alleviato dalla loro rimozione dal circuito di perfusione.

FIGURA 4 L'aggiunta di un hem-adsorber al circuito di perfusione della macchina normotermica ha effetti sostanziali sul livello di citochine nel perfusato e nel trascrittoma ma non sui parametri fisici registrati sul rig. Un paio di reni umani sono stati prelevati dallo stesso donatore, uno dei due è stato sottoposto al protocollo standard di perfusione con macchina normotermica (NMP) per 4 ore e l'altroreneè stato sottoposto a NMP con l'aggiunta di un adsorbitore di orlo al circuito. I campioni sono stati prelevati per RNA-Seq prima della perfusione (0 ore), dopo 2 ore e alla fine (4 ore). B, Concentrazione di citochine chiave nel perfusato dopo 4 ore di NMP. La linea indica coppie di reni. Le misurazioni delle citochine sono state normalizzate al contenuto proteico totale del perfusato. Il valore P dichiarato deriva da un test t accoppiato per la riduzione delle citochine con l'aggiunta di HA. C, Produzione di urina e flusso sanguigno renale (RBF) nel corso del tempo della perfusione. Greenline indica NMP da solo e arancione con l'aggiunta di assorbente per l'orlo. D, diagramma di Venn che mostra i numeri di geni espressi in modo significativamente differenziale quando si confrontano i campioni di 2-ora o 4-ora con i campioni pre(0-ora). I diagrammi rossi sono geni sovraregolati e blu sottoregolati. L'intersezione sono i geni che sono espressi in modo deferente in entrambi i punti temporali nella stessa direzione. E, log2 valori di espressione normalizzati per i geni indicati attraverso la perfusione dal trascrittoma tissutale, sono indicate le barre di errore standard. F, Grafico del vulcano per il confronto a coppie di NMP da solo con NMP più HA a 4 ore. Il rosso indica geni differenzialmente espressi con un valore P aggiustato<0.05. g,="" as="" for="">

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2.6. HA associato a una riduzione di una firma genica associata alla funzione dell'innesto ritardata

L'analisi dell'arricchimento del set genico ha mostrato una diminuzione significativa della via "Segnalazione TNF tramite NFkB" nei reni NMP più HA rispetto al solo NMP (Figura 5A-B). In particolare, la presenza dell'HA non solo ha ridotto l'espressione genica infiammatoria all'interno delrenema anche aumentato OXPHOS e vie del metabolismo degli acidi grassi, che contribuiscono entrambi alla generazione di energia (Figura 5A-B). Pertanto, i cambiamenti nei percorsi di espressione genica che si verificano con l'HA sosterrebbero la conclusione che i suoi effetti sono clinicamente benefici, poiché riduce i geni del percorso "TNFA signaling via NFkB" e aumenta i geni del percorso "OXPHOS", entrambi associati a un più breve durata del DGF (Figura 2B).

Per esplorare ulteriormente la relazione tra i cambiamenti trascrizionali nella NMP e gli esiti clinici, abbiamo cercato di curare una firma genica presente nei reni con DGF. Abbiamo identificato i primi 100 geni regolati positivamente (UP) e negativamente (DOWN) (classificati in base al cambiamento di piega del registro) che erano correlati alla lunghezza del DGF nei 33 campioni di studi clinici (Figura 5C, Dati S1). Abbiamo riscontrato un significativo arricchimento della firma genica associata all'aumento della lunghezza del DGF nei campioni con una maggiore produzione di urina (Figura 5D), suggerendo che un'elevata produzione di urina durante l'NMP identifica i reni a rischio di DGF più prolungato. Non c'era una correlazione statisticamente significativa tra la firma DGF e i geni associati a un flusso sanguigno renale più elevato (Figura 5E). Successivamente abbiamo valutato se e come l'aggiunta dell'HA al circuito NMP ha influenzato l'espressione delle firme dei geni DGF "UP" e "DOWN". Sorprendentemente, questo ha mostrato che l'espressione della firma genica associata all'aumento della lunghezza del DGF è stata significativamente ridotta dall'aggiunta dell'HA e la firma associata alla diminuzione della lunghezza del DGF è stata significativamente aumentata dall'aggiunta dell'HA (Figura 5F).

Nel complesso, i cambiamenti trascrizionali che abbiamo identificato suggeriscono che l'NMP ha potenziali benefici rispetto alla conservazione a freddo in termini di effetti sulla generazione di energia nel rene. Tuttavia, durante la perfusione, alcune molecole bioattive vengono rilasciate dal rene nel circuito di perfusione, generando un circuito di amplificazione che guida l'infiammazione quando rientrano nel rene. La rimozione di queste molecole interrompe questo ciclo e può essere utile per ridurre l'infiammazione e aumentare la generazione di energia, migliorando ulteriormente gli effetti benefici dell'NMP e riducendo la suscettibilità al DGF (Figura 6).

FIGURA 5 L'aggiunta dell'adsorbitore prosciutto riduce una firma genica associata a DGF. Un'analisi GSEA dell'effetto dell'aggiunta di HA al trascrittoma dopo 4 ore NMP contro il percorso dei segni distintivi dei set genetici. Vengono tracciati solo percorsi significativi. I punti rossi indicano un arricchimento positivo e il blu negativo, la dimensione del punto è inversamente correlata al valore FDR q e la posizione indica il punteggio di arricchimento normalizzato (NES). B, Grafici di arricchimento da GSEA per i percorsi chiave dal database Hallmark per il confronto da A. La linea indica il punteggio di arricchimento in esecuzione e il grafico del violino indica la distribuzione dei geni membri del geneset nell'elenco dei geni classificati utilizzato in ciascuna analisi. C, Heatmap delle prime quattro maggiori correlazioni positive (UP) e negative (DOWN) con la lunghezza del DGF e utilizzata come parte della firma dell'espressione genica per DGF. Firma DGF completa riportata nei dati supplementari. La firma genica associata a DF e DGF è stata utilizzata con GSEA per studiare l'espressione della firma nella correlazione della produzione di urina di 2-ora con il trascrittoma di 2-ora (D), correlazione di 2-ora RBF con 2-ora trascrittoma (E) e l'effetto dell'aggiunta di HA sul trascrittoma a 4 ore (F). Trame come per A

FIGURA 6 Riepilogo grafico. R, Durante la conservazione a freddo, c'è una riduzione globale della trascrizione. Durante l'NMP l'espressione dei geni in una serie di percorsi è sovraregolata tra cui la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e i geni del percorso infiammatorio come TNF, IL8 e NFkB. Pannello di sinistra B, durante l'NMP, i mediatori infiammatori (cerchi gialli) vengono rilasciati dalrenenella soluzione di perfusione. Ricircolano e stimolano la trascrizione del gene pro-infiammatorio nel rene e sono associati a una riduzione dei geni di produzione del percorso energetico, riducendo l'ATP. Pannello di destra, la presenza dell'orlo-adsorbitore (HA) interrompe questo ciclo di amplificazione infiammatoria

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3. DISCUSSIONE

I nostri dati mostrano che la conservazione a freddo è efficace nel limitare i cambiamenti sostanziali nell'espressione genica. Ciò è in linea con i modelli di roditori, in cui i reni conservati per un massimo di 18 ore in celle frigorifere hanno mostrato pochi cambiamenti nell'espressione delle citochine pro-infiammatorie, tra cui IL1, TNF e IL6.26 Il nostro uso di un profilo trascrizionale globale imparziale piuttosto che la misurazione di un piccolo numero di geni candidati ci ha permesso di analizzare l'espressione di gruppi di geni che si trovano all'interno di percorsi specifici. Ciò ha rivelato una significativa riduzione dell'espressione di OXPHOS e dei geni della via della glicolisi nei reni refrigerati, riducendo potenzialmente la capacità di questi reni di generare ATP, in linea con uno studio precedente che mostrava una riduzione dell'ATP nei reni umani refrigerati.27 Un numero delle vie pro-infiammatorie sono state anche sottoregolate durante la conservazione a freddo, inclusa l'attivazione del TNF tramite NFkB e le vie delle specie reattive dell'ossigeno che possono essere potenzialmente benefiche. Tuttavia, può darsi che la conservazione a freddo metta semplicemente una sospensione temporanea su questi percorsi e che, a seguito della riperfusione nel ricevente, si verifichino cambiamenti simili nell'espressione genica infiammatoria osservati nella NMP.

L'NMP ha avuto l'effetto opposto alla conservazione a freddo su OXPHOS e sui geni della via della glicolisi, aumentandone l'espressione, con il potenziale per aumentare la capacità cellulare di generare ATP e ripristinare l'omeostasi. Da notare che è stato anche dimostrato che la perfusione ossigenata ipotermica dei reni umani aumenta i livelli di ATP rispetto alla cella frigorifera 27, quindi il ripristino dell'ossigenazione può essere lo stimolo principale per questi processi piuttosto che la normotermia. Tuttavia, è probabile che questi cambiamenti siano benefici per l'organo data la nostra osservazione di una correlazione negativa tra l'aumentata espressione dei geni del percorso OXPHOS e il DGF prolungato.

Un recente articolo di Hameed et al28 ha anche eseguito un'analisi trascrittomica di NMP in tre reni sottoposti a NMP. Sfortunatamente, gli autori non hanno reso pubblicamente disponibili i loro dati, quindi non è possibile un confronto approfondito con il nostro set di dati. Tuttavia, il loro manoscritto indicava l'induzione di geni correlati alla risposta immunitaria durante l'NMP, inclusi IL1B, CXCL2 e TNF, che è concordante con i nostri risultati.

Nella nostra analisi dei reni sottoposti a NMP nel contesto di una sperimentazione clinica, abbiamo correlato le firme dell'espressione genica con una lunghezza di DGF piuttosto che con un'incidenza di DGF (definita come necessità di dialisi entro la prima settimana dopo il trapianto). In particolare, i reni con una durata del DGF di 1 giorno o meno erano altamente simili trascrizionalmente a quelli senza DGF, probabilmente riflettendo il requisito della dialisi a causa dell'iperkaliemia associata al peri-operatorio piuttosto che del DGF in buona fede. Abbiamo scoperto che un DGF più lungo era associato a una maggiore espressione della segnalazione del TNFA tramite i geni del percorso NFkB e a una minore espressione di geni associati a OXPHOS. Questi dati suggeriscono che i reni con OXPHOS aumentato e ridotta segnalazione immunitaria possono presentare un potenziale migliore come reni dei donatori, ma questa conclusione richiede la convalida in uno studio prospettico più ampio.

Abbiamo anche valutato i processi molecolari correlati alla produzione di urina e al sangue renale durante l'NMP. Questi parametri sono stati precedentemente utilizzati, insieme a una serie di altre misure, per generare un punteggio di valutazione della qualità dei reni perfusi. Si è ritenuto che alti valori di produzione di urina e flusso sanguigno renale riflettano un innesto più praticabile.15 I nostri dati rivelano che le vie correlate all'elevata produzione di urina e all'alto flusso sanguigno renale differiscono e, in effetti, questi parametri dimostrano associazioni opposte con le vie infiammatorie . Un'elevata produzione di urina era associata a una maggiore espressione dei geni della via immunitaria mentre un flusso sanguigno renale elevato era correlato negativamente con queste vie. Abbiamo anche scoperto che la firma del gene DGF che abbiamo generato è stata arricchita nei reni con un'elevata produzione di urina durante NMP, suggerendo che questo parametro può identificare i reni a rischio di un DGF più lungo, in contrasto con l'attuale dogma. Una possibile spiegazione è che una produzione di urina molto elevata riflette i reni con più danni tubulari che non hanno la capacità di concentrare l'urina. Pertanto, potrebbe esserci un "effetto Goldilocks" per quanto riguarda la produzione di urina, dove i reni con una produzione di urina bassa/poca sono quelli con anomalie sostanziali nella generazione di filtrato, quelli con una produzione di urina molto elevata hanno un danno tubulare sostanziale che impedisce la concentrazione di urina. Questa ipotesi dovrebbe essere verificata in un numero maggiore di reni che sono stati successivamente trapiantati.

Durante 4 ore di NMP, si è verificata un'induzione di geni infiammatori nel rene. Tuttavia, vale la pena notare che la pratica clinica attuale prevede solo 1 ora di NMP e questo effetto potrebbe non essere evidente in un tempo di perfusione più breve. Tuttavia, una perfusione più lunga può avere benefici in termini di ripristino dell'ossigenazione e generazione di energia e, nel nostro esperimento, gli effetti negativi dell'induzione del gene immunitario potrebbero essere sostanzialmente negati dall'introduzione di un citosol HA nel circuito di perfusione. Questi dati indicano che i mediatori dell'infiammazione generati dal rene durante il corso della NMP entrano nel circuito di perfusione e sono in grado di esacerbare l'infiammazione sterile e che la loro rimozione migliora l'induzione dei geni della via dell'infiammazione osservata durante la NMP. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che l'aggiunta dell'HA influisce sull'espressione dei geni associati a risultati clinici peggiori. La nostra firma del gene DGF è stata derivata da campioni sottoposti a NMP nell'ambito di uno studio clinico che ne ha valutato l'efficacia, consentendoci di collegare saldamente i cambiamenti osservati nei nostri studi sui reni accoppiati con gli endpoint clinici nei reni sottoposti a trapianto. Tuttavia, la sua applicazione nel contesto di una sperimentazione clinica sarà necessaria per dimostrare definitivamente l'utilità della sua applicazione ai reni prima del trapianto. L'HA non è specifico e può rimuovere molecole utili, oltre a quelle dannose per l'organo. Abbiamo scoperto che l'effetto netto dell'HA sul trascrittoma renale è apparso benefico, ma potrebbe essere ancora più efficace un perfezionamento per rimuovere in modo specifico mediatori comprovati e deleteri.

Le coppie di reni che abbiamo utilizzato provenivano dallo stesso individuo ed erano quindi geneticamente identiche e avevano sperimentato un ambiente simile per tutta la vita del donatore. Abbiamo confermato che il loro trascrittoma temporale 0 era estremamente simile (Figura S2 A, B). Tuttavia, queste biopsie campionano una piccola parte del rene e le coppie di reni potrebbero essere influenzate in modo asimmetrico da patologie, ad esempio cisti o malattie dei piccoli vasi. Un ulteriore avvertimento è che tutti i reni utilizzati negli esperimenti di intervento qui presentati sono stati rifiutati per il trapianto e alcuni rappresentano organi trapiantati all'estremità inferiore dello spettro di qualità. Tuttavia, abbiamo osservato risultati altamente riproducibili confrontando i percorsi genici in gruppi di cinque reni. Siamo stati anche in grado di dimostrare che i reni di DCD e DBD avevano una risposta simile alla perfusione. Combinando questo con la nostra firma DGF post-NMP curata, siamo stati in grado di prevedere potenziali benefici clinici. Questo approccio sperimentale potrebbe essere impiegato come strumento preclinico per lo screening di interventi futuri per la potenziale efficacia terapeutica per consentire la selezione razionale di interventi candidati per le sperimentazioni cliniche.

In sintesi, il nostro studio fornisce il primo profilo trascrizionale globale dei reni umani sottoposti a NMP, risolvendo i diversi percorsi molecolari che vengono attivati ​​nell'NMP rispetto alla conservazione a freddo e dimostrando che gli effetti deleteri delle molecole bioattive prodotte o rilasciate dal rene durante l'NMP possono essere invertito con l'aggiunta di un HA. Inoltre, questo intervento ha ridotto l'espressione dei geni associati al DGF prolungato fornendo una forte motivazione meccanicistica per l'applicazione di tale intervento a una futura sperimentazione clinica. I nostri dati hanno anche implicazioni per le strategie di perfusione oltre il rene, anche nel trapianto di fegato e polmone, suggerendo che la rimozione di molecole bioattive dai perfusati dovrebbe essere studiata in questi contesti in cui l'NMP è sempre più utilizzato. Infine, il nostro studio mette in evidenza l'utilità della profilazione trascrizionale globale in coppiareniper la valutazione di nuovi interventi sugli organi perfusi; i cambiamenti trascrizionali precedono i cambiamenti nell'abbondanza di proteine ​​(tradizionalmente utilizzate come biomarcatori direnelesioni) e decine di migliaia di trascrizioni geniche possono essere facilmente misurate. Pertanto, la misurazione dell'RNA ha il potenziale per fornire una lettura precoce e sensibile della funzione cellulare degli organi umani recuperati per il trapianto che può essere applicata a studi futuri.

RINGRAZIAMENTI

Gli autori ringraziano tutti i donatori di organi e le loro famiglie. Il Clatworthy Lab è grato per le strutture di base fornite dal Laboratorio di Biologia Molecolare MRC. Questo lavoro è stato eseguito utilizzando le risorse fornite dal Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3) gestito dall'Università di Cambridge Research Computing Service, fornito da Dell EMC e Intel utilizzando il finanziamento di livello-2 dell'Engineering and Physical Sciences Research Council (sovvenzione in conto capitale EP/P020259/1) e finanziamenti DiRAC dal Science and Technology Facilities Council (www. Dirac. ac. the UK).

CHIARIMENTI

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare come descritto dall'American Journal of Transplantation.

CONTRIBUTI D'AUTORE

JRF, SH, MLN e MRC hanno progettato lo studio e interpretato i dati. JRF, SH, TM, CJW, AF e TCD hanno eseguito gli esperimenti. JRF, SH e MRC hanno creato figure e tabelle. MRC ha scritto il manoscritto principale. JRF e SH hanno creato i metodi e le legende delle figure, JRF, SH e MLN hanno modificato il manoscritto.

Beneficio Cistanche: migliora la funzionalità renale

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