Potenziale depigmentante degli estratti di licheni valutato da test in vitro e in vivo, parte 2

Secondo studi pertinenti,cistancheè un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale èCistanoside, che ha vari effetti comeantiossidante, antinfiammatorioe promozione della funzione immunitaria. Il meccanismo tra cistanche e sbiancamento della pelle risiede nell'effetto antiossidante della cistancheglicosidi. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata datirosinasie la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contiene cistanoside, che è un antiossidante e può quindi ridurre la generazione di radicali liberi nel corpoinibendo la produzione di melanina.

Inoltre, la cistanche ha anche la funzione di promuovere la produzione di collagene, che può aumentare l'elasticità e la lucentezza della pelle e aiutare a riparare le cellule cutanee danneggiate. CistancheFeniletanolo Glicosidihanno un significativo effetto di down-regulation sull'attività della tirosinasi e l'effetto sulla tirosinasi si è dimostrato essere un'inibizione competitiva e reversibile, che può fornire una base scientifica per lo sviluppo e l'utilizzo degli ingredienti sbiancanti in Cistanche. Pertanto, cistanche ha un ruolo chiave insbiancamento della pelle. Può inibire la produzione di melanina per ridurre lo scolorimento e l'ottusità; e promuovere la produzione di collagene per migliorare l'elasticità e la luminosità della pelle. A causa del diffuso riconoscimento di questi effetti di cistanche, molti pellesbiancamentoi prodotti hanno iniziato a infondere ingredienti a base di erbe come Cistanche per soddisfare la domanda dei consumatori, aumentando così il valore commerciale di Cistanche nei prodotti sbiancanti per la pelle. In sintesi, il ruolo della cistanche nello sbiancamento della pelle è cruciale. Il suo effetto antiossidante e l'effetto di produzione di collagene possono ridurre lo scolorimento e l'ottusità, migliorare l'elasticità e la lucentezza della pelle e quindi ottenere un effetto sbiancante. Inoltre, l'ampia applicazione di Cistanche nei prodotti sbiancanti per la pelle dimostra che il suo ruolo nel valore commerciale non può essere sottovalutato.

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Rilevazione dell'inibizione della tirosinasi mediante bioautografia TLC

Il profilo TLC ha permesso di evidenziare le principali sostanze contenute in ciascun estratto. L'identificazione di queste sostanze non è uno scopo di questo lavoro, ma, ad esempio, è evidente la macchia di acido vulpinico (giallo sotto luce visibile) nell'estratto metanolico di L. vulpina (Huneck & Yoshimura, 1996) (Fig. 2). I dati di bioautografia hanno rivelato che diversi composti esercitano effetti inibitori sull'attività della tirosinasi. In particolare, l'attività inibitoria dell'estratto di cloroformio-metanolo di C. islandica è stata distribuita tra diverse bande che coprono un'ampia gamma di polarità (Fig. 2A). Al contrario, l'attività inibitoria della tirosinasi dell'estratto di metanolo di L. vulpina è concentrata in una banda che migra vicino alla grande banda gialla corrispondente all'acido vulpinico (Fig. 2B).

Effetti depigmentanti dell'estratto di lichene sulle cellule MeWO

La linea cellulare di melanoma umano MeWo è stata utilizzata come modello in vitro per esplorare gli effetti di depigmentazione del lichene. Come primo passo, le cellule sono state sottoposte a test di vitalità cellulare dopo l'esposizione per 48 ore a concentrazioni crescenti di L. vulpina metanolo e estratti di cloroformio-metanolo di C. islandica. Le curve dose-risposta della vitalità cellulare hanno permesso di derivare valori IC50 di 88 µg/ml (IC 95% [68-113 µg/ml]) per L. vulpina e 264 µg/ml (IC 95% [213-328 µg/ml] ) per C. islandica. I valori di soglia IC05 erano rispettivamente di 19 µg/ml (95% CI [9–40 µg/ml]) e 51 µg/ml (95% CI [31–85 µg/ml]).

Successivamente, il dosaggio della melanina condotto su cellule MeWo, dopo 72 ore di esposizione a diverse concentrazioni di estratto di lichene, ha mostrato una netta riduzione dei controlli indotti da entrambi gli estratti. In questi esperimenti, l'arbutina (8 mM) è stata utilizzata come controllo positivo, riducendo il contenuto di melanina delle cellule a circa il 50% dei controlli. L'estratto metanolico di L. vulpina ha indotto una riduzione della melanina simile a quella dell'arbutina, che si verifica già a una concentrazione di soli 10 µg/ml (Fig. 3). Questa concentrazione è inferiore alla soglia per gli effetti citotossici misurata per questo estratto, consentendo di escludere la possibilità di specifici effetti dannosi sulle cellule. Un effetto simile sul contenuto di melanina delle cellule è stato osservato anche per l'estratto di cloroformio-metanolo di C. islandica, ma solo a una concentrazione di 50 µg/ml (Fig. 3). Tuttavia, anche la concentrazione effettiva di questo estratto era inferiore alla soglia per gli effetti citotossici.

Valutazione basata sul fenotipo degli effetti depigmentanti degli estratti di licheni utilizzando il pesce zebra

Sono stati utilizzati modelli di pesce zebra per confermare ulteriormente in vivo gli effetti dell'inibizione della melanogenesi da parte di C. islandica e L. vulpina. Per definire la concentrazione ottimale da utilizzare, i primi embrioni sono stati sottoposti a test di tossicità dopo l'esposizione per 48 ore a concentrazioni crescenti di L. vulpina metanolo e C. islandica estratti cloroformio-metanolo.

Successivamente, abbiamo osservato che, se trattate con dosi subtossiche di C. islandica e L. vulpina, le larve di pesce zebra presentavano una riduzione della pigmentazione (Figg. 4 e 5). L'estratto di L. vulpina ha mostrato una maggiore attività inibitoria rispetto a C. islandica, come indicato dai dati dell'analisi delle immagini. Le curve di regressione logistica hanno prodotto valori IC50 di 44 µg/ml (42–47 µg/ml) per l'estratto cloroformio-metanolo di C. islandica e di 30 µg/ml (25–36 µg/ml) per l'estratto metanolo di L. vulpina (Fig. 6). Infine, l'attività depigmentante degli estratti di C. islandica e L. vulpina è stata valutata anche negli embrioni di pesce zebra mediante saggio di melanina (Informazioni supplementari).

DISCUSSIONE

Il nostro studio ha evidenziato un complesso di effetti depigmentanti in vitro e in vivo dovuti a specifici licheni e solventi di estrazione. La strategia di scegliere estrazioni separate con una varietà di polarità del solvente, invece di un'estrazione successiva con solventi di polarità crescente, è stata dettata dall'aspetto pionieristico dell'indagine. Lo studio era finalizzato alla scoperta di specie di licheni ampiamente disponibili che potessero essere sfruttate per i loro effetti depigmentanti, con una conoscenza molto limitata sulla possibile presenza di principi attivi e sulle loro interazioni. Pertanto, abbiamo adottato un metodo di frazionamento dell'estratto che può comportare una certa sovrapposizione di composizione tra le frazioni ma massimizza le loro prestazioni depigmentanti, forse anche a causa di effetti sinergici.

Per quanto riguarda l'inibizione della tirosinasi negli esperimenti senza cellule, i nostri risultati confermano i dati di Higuchi et al. (1993), che mostrano tassi di inibizione della tirosinasi del 40,4% per L. vulpina e del 13,8% per C. islandica, rispettivamente per il nostro 86,2% e 42,6% , probabilmente a causa dell'uso di licheni in coltura e della diversa estrazione solvente. Abbiamo mostrato l'attività più forte per l'estratto di metanolo di L. vulpina, seguito dagli estratti di cloroformio-metanolo di C. islandica. Pertanto, questi estratti sono stati utilizzati per esplorare l'attività anti-melanogenica delle cellule di melanoma e delle larve di pesce zebra. I dati ottenuti da questi test hanno confermato quelli di esperimenti senza cellule e, in tutti i casi, l'estratto metanolico di L. vulpina ha indotto l'effetto più forte.

Inoltre, il saggio di bioautografia indica che diverse sostanze contenute in questi licheni esercitano l'inibizione della tirosinasi. Pur non avendo effettuato una caratterizzazione completa degli estratti, conosciamo dalla letteratura le principali sostanze licheniche che caratterizzano questi licheni: L. vulpina contiene atranorina e acido vulpinico, mentre C. islandica contiene acido lichesterinico, protolichestrinico e fumarprotocetrarico (Culberson, 1969) . Tuttavia, le informazioni relative alle attività antitirosinasiche delle sostanze licheniche in letteratura sono relativamente scarse, mentre solo in pochi casi è stato possibile chiarire i meccanismi di inibizione. Recentemente, Brandão et al. (2017) ha isolato l'acido fumarprotocetrarico dal lichene Cladonia verticillate e ha mostrato un'inibizione di tipo misto non competitiva sull'attività della tirosinasi che è aumentata con l'aumentare della concentrazione, a 0,6 mM l'acido ha inibito l'attività della tirosinasi del 39,8%.

Un elemento che rende difficile il confronto tra diverse specie di licheni è l'elevata variabilità della composizione chimica, che è soggetta anche al variare dei parametri ambientali, dell'habitat e delle caratteristiche microclimatiche (es. disponibilità di acqua e luce) (Matteucci et al. , 2017). Queste differenze possono essere alla base di notevoli differenze nell'attività biologica dei fitocomplessi lichenici in cui la composizione non è stata quantitativamente caratterizzata. Pertanto, è necessario un ulteriore lavoro per isolare e quantificare i composti attivi dagli estratti per definire meglio i componenti con attività antitirosinasi. Finora, diversi lavori hanno studiato la possibile attività antitirosinasica dei composti lichenici (ad esempio, Kwong et al., 2020; Honda et al., 2016; Lopes, Coelho & Honda, 2018). Ad esempio, Kim & Cho (2007) hanno determinato che gli estratti metanolici di Usnea longissima e Usnea esculent influenzano la formazione di melanina indipendentemente dalla loro azione antiossidante. Per quanto riguarda la loro struttura fenolica, è probabile che diversi costituenti siano forti inibitori della tirosinasi, con una IC50 molto più bassa rispetto a quella dell'intero estratto.

In conclusione, il nostro studio fornisce prove degli effetti depigmentanti di specifici estratti di licheni, passando dall'inibizione della tirosinasi in esperimenti senza cellule agli effetti depigmentanti in vitro su cellule in coltura e in vivo su larve di zebrafish. Questi dati indicano che gli estratti di licheni di L. vulpina e C. islandica sono potenziali candidati per lo sviluppo di prodotti farmaceutici e cosmetici per lo sbiancamento della pelle. Inoltre, i dati suggeriscono anche che L. vulpina potrebbe essere una buona fonte per l'isolamento di composti con forti proprietà depigmentanti. Obiettivi futuri in questa direzione saranno la caratterizzazione chimica degli estratti di licheni e la valutazione dell'attività dei loro costituenti più promettenti.

ULTERIORI INFORMAZIONI E DICHIARAZIONI

Finanziamento

Questo lavoro è stato supportato dall'Università di Genova (FRA2018). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta dei dati, nell'analisi, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Concessione Divulgazioni

Le seguenti informazioni sulla sovvenzione sono state divulgate dagli autori: Università di Genova: FRA2018.

Interessi conflittuali

Paolo Giordani è Academic Editor per PeerJ.

Contributi dell'autore

Etica animale

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Disponibilità dei dati

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Le misurazioni grezze dell'inibizione della tirosinasi sono disponibili in un file supplementare.

Informazioni supplementari

Informazioni supplementari per questo articolo possono essere trovate online.

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